КЛІНІКО-ПАТОГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОЗСІЯНОГО СКЛЕРОЗУ У ЗОНІ ВИСОКОГО РИЗИКУ ЗАХВОРЮВАННЯ

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. З метою вирішення визначених завдань, у період з 2004 по 2005 рр. неврологічно, інструментально та лабораторно обстежено 216 хворих на РС – жителів м. Львова та Львівської області. Метою І-го етапу досліджень стала клініко-епідеміологічна характеристика РС у межах різних районів м. Львова та області, яка включала порівняльний аналіз клінічних показників цього захворювання на екологічно чистих (ЕЧ) та екологічно забруднених (ЕЗ) територіях (173 хворих на РС і 128 клінічно здорових осіб).        Підставою для формування поняття ЕЗ та ЕЧ райони стали дані санітарно-епідеміологічної служби Львівської області, згідно яких забрудненість грунтів Яворівського району, в якому розташований Яворівський державний гірничо-хімічний комбінат “Сірка”, є найвищою по області - 16,2% зразків із перевищенням граничнодопустимих концентрацій, водночас, найменше забрудненим виявився Буський район. У межах м. Львова порівнювали Франківський район, на території якого розташовано танкоремонтний завод, автомобільний завод та інші промислові підприємства, із Сихівським районом, який безпосередньо межує із лісосмугою і не містить жодних великих промислових об’єктів. Особливістю цього розділу виконаних досліджень був метод детального неврологічного огляду кожного хворого з встановленням достовірного діагнозу із використанням спеціально розробленої Інститутом неврології, психіатрії та наркології АМН України анкети-опитувальника.

У 38-ми хворих на РС та 27-ми здорових осіб (ІІ-й етап) досліджували здатність Ig, виділених із їх плазми крові, впливати на імунокомпетентні клітини. У дисертаційній роботі цей розділ представлений на прикладі випадкової вибірки хворих на РС (14 хворих і 6 осіб контрольної групи), оскільки всі закономірності, отримані в загальній групі, виявилися ідентичними, до тих змін, які отримали у цій вибірці.

У 9-ти хворих на РС та 6-ти донорів (ІІІ-й етап) досліджували здатність IgG, виділених із їх плазми крові, до руйнування ОБМ та ДНК.

Вплив лікування Бетафероном на ознаки апоптозу в імунокомпетентних клітинах досліджували у 10-ти хворих на РС та 10-ти здорових осіб (IV-й етап).

Для діагностики РС використовували критерії C. Poser et al. (1983) і Mc. Donald et al. (2005). Діагноз РС ставили на основі уважного виявлення і вивчення скарг, анамнезу захворювання та параклінічних (МРТ) методів обстеження хворих. При необхідності долучали консультації інших спеціалістів та серологічні обстеження крові на токсоплазмоз, бореліоз, герпесвірусну персистенцію, що дозволило виключити інтеркурентну патологію, передусім інфекційні та хронічні захворювання внутрішніх органів.

Виділення фракції імуноглобулінів із плазми венозної крові. Виділення імуноглобулінової фракції з плазми венозної крові проводили за описаною методикою (Фримель Г., 1997). Для дослідження каталітичної активності препаратів IgG використали афінну хроматографію на колонці, наповненій протеїн A – агарозою Fast Flow (Sigma, США). Для перевірки чистоти IgG, препарати піддавали гель-фільтрації на колонці розміром 180 х 5 мм, яка містила сорбент Toyopearl TSK HW-55 (Toyo Soda, Японія). На кінцевій стадії білки фракціонували електрофорезом у 12% ПААГ у присутності 0,1% SDS.

Дослідження цитотоксичної дії Ig. Як об’єкт для дослідження цитотоксичної й проапоптичної дії Ig використали людські лейкемічні Т-лімфоцити ліній Jurkat і MT-4; лейкемічні В-клітини лінії Namalwa (лімфома Беркітта); лейкемічні В-лімфоцити миші (лінія L-1210). Усі лінії клітин були отримані з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ, Україна). Клітини культивували у флаконах Карреля у поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma, США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів ВРХ (Sigma, США), 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, СШA) до досягнення клітинами субконфлюентного стану. Для перевірки життєздатності клітин через 24 години дії на них препаратів Ig використовували тест із фарбуванням клітин 0,1% водним розчином трипанового синього. Кількість незафарбованих живих та зафарбованих у синій колір (мертвих) клітин підраховували у гемоцитометричній камері (камера Горяєва) під світловим мікроскопом Біолам (ЛОМО, Санкт-Петербург, РФ).

Визначення проапоптичної активності Ig плазми крові хворих на РС проводили за методом G. Zauli (1993), використовуючи електрофорез тотальної ДНК моноядерних клітин периферійної крові (МКПК) хворих на РС. Розподіл фракцій деградованої ДНК визначали, використовуючи програму Gel-Pro 3.1. «Кометний» аналіз ДНК МКПК хворих на РС проводили, як описано у роботі Камінський В.О. та співавт. (2005). Підрахунок кількості комет ДНК проводили під мікроскопом при збільшенні × 200-400. У зразку рахували не менше 500 клітин. Комети поділяли на 5 класів залежно від співвідношення ДНК у "голові" та "хвості" комети.

Дослідження каталітичної дії Ig плазми крові.

1. Гідроліз ОБМ. IgG досліджували, як описано у роботі Latry V. at al. (2003).

2. Визначення зв’язування ОБМ імуноглобулінами плазми крові за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА здійснювали, як описано в Vojdani A. et al. (2003).

3. Активність IgG щодо гідролізу ДНК. ДНК-азну активність IgG визначали, як описано (Gabibov A.G. et al., 2000).

Статистична обробка отриманих результатів. Статистичне опрацювання результатів з визначення цитотоксичної дії препаратів Ig здійснювали за допомогою програми OriginPro 7.0, вираховуючи t-критерії Стьюдента. Достовірними вважали зміни показників за умови Р<0,05.

Результати власних досліджень та їх обговорення. Згідно з результатами проведених нами досліджень (1-й етап), серед 173-х обстежених хворих переважали жінки над чоловіками (1,33:1), що підтверджує участь гормональної дисфункції в патогенезі РС. Показали деякі відмінності у порівнянні з даними літератури щодо вищої частоти захворювання в осіб віком 40 -  49 років (43,93%). Кількість хворих віком понад 50 років також виявилася вагомою (29,48%). Ймовірно, така перевага (73,41%) хворих старших 40 років й обумовлює злоякісність перебігу РС у західному регіоні України, зокрема у Львівській області. Найбільша кількість хворих мала тривалість захворювання понад 10-ть років (57,79%) і від 6-ти до 10-ти років (26,59%). Виявили статистично вірогідну більшу кількість хворих із тривалістю захворювання від 1-го до 5-ти років та від 6-ти до 10-ти років у ЕЗ порівняно з ЕЧ районами Львівської області. Кількість обстежених хворих із церебро-спінальною клінічною формою була найбільша порівняно із церебральною та спінальною (54,91% проти 28,9% та 16,18% відповідно) з перевагою у ЕЗ районах. Серед оглянутих хворих на РС переважали пацієнти із РР і ВП типами перебігу патологічного процесу (по 39,3% у кожній підгрупі). 20,8% пацієнтів перебували на етапі первинного прогресування, що є значно вищим відсотком порівняно з даними літератури (10-15%) (Вінничук С.М. та співавт., 2000; Завалишин И.А. и соавт., 2002; Соколова Л.І., 1998; Montablan X., Rio J., 2001; Runmarket B., Andersen O., 1993), і може пояснити агресивність перебігу РС у нашому регіоні. Водночас, кількість хворих на стадії вторинного прогресування виявилася вагомішою в ЕЗ порівняно з ЕЧ районами. Найбільшу кількість хворих на РС було виявлено із середньої тяжкості (42,19%) та тяжкими (50,87%) проявами патологічного процесу, з перевагою останніх у ЕЗ районах області.

Таким чином, статистично достовірну перевагу хворих із церебро-спінальною формою, тяжким ступенем інвалідизації (6-9,5 балів за шкалою Куртцке), а також у стадії вторинного прогресування патологічного процесу було зафіксовано в ЕЗ порівняно із ЕЧ районами Львівської області. Зроблено висновок про відсутність клінічних відмінностей у перебігу РС серед жителів одного навіть великого міста. Отримані еколого-епідеміологічні асоціації при оцінці клінічного перебігу РС і ступеня забрудненості грунтів, на яких проживають обстежені пацієнти, співпадають з даними  інших авторів (Lauer K., 1995; Lauer K., 1989). При наявності генетичної схильності (Завалішин І.А. і співавт., 2002) цей та інші екзо- і/або ендогенні фактори ризику можуть впливати не тільки на ризик розвитку РС, але й на особливості клінічних виявів захворювання в подальшому.

При аналізі клінічних виявів РС у дебюті цього захворювання встановлено, що 78,61% серед оглянутих хворих – постійні мешканці нашого регіону, 89,02% із середніх та вищих соціальних верств, 89,01% мають середню спеціальну і вищу освіту, що узгоджується з даними літератури (Гусев Е. И. и соавт., 2004). Підтвердили факт збереження повних сімей при наявності хворого на РС одного із її членів (69,36%), а при аналізі умов соціально-побутового статусу та анамнезу захворювання у обстежених виявили професійні шкідливості (інсоляція, переохолодження, контакт з барвниками, розчинниками) у 45,66% осіб, перенесені інфекційні хвороби у 26,01%, шкідливі звички (вживання алкоголю, паління) у 24,85% та часті стресові ситуації – у 15,03% випадків. Водночас, частка осіб, які не змогли вказати на будь-який причинний фактор, також виявилася досить вагомою (31,21%).

На думку багатьох авторів (Бойко А.Н. и соавт., 2003; Дëмина Т.Л. и соавт., 2006) клінічні особливості дебюту РС можуть вказати, як це захворювання буде себе вести в подальшому, що й було підтверджено власними дослідженнями. Так, незважаючи на перевагу моносиндромного дебюту РС у Львівській області (у 43,93% обстежених хворих) проти полі- і олігосиндромного, він володів наступними прогностично несприятливими ознаками: у 82,08% хворих був середньої тяжкості або тяжким, у 54,91% характеризувався гострим (до 7-ми днів) або інсультоподібним (години) початком, у 94,21% обстежених був тривалим (1 місяць і більше) або середньої тривалості (3 - 4 тижні), а у 94,79% - сповільнений (1місяць і більше) або поступовий (3 - 4 тижні) вихід з нього. Причому, в ЕЗ районах була статистично вірогідна перевага хворих на РС із тяжким, тривалим дебютом, інсультоподібним темпом входження і сповільненим виходом з нього.

 Розглянувши особливості клінічного перебігу РР РС в ЕЧ та ЕЗ районах Львівської області, виявили статистично вірогідне превалювання хворих із рецидивами середньої тяжкості (23,12%) і різної тяжкості (9,25%) при мінімальній кількості пацієнтів із легкими рецидивами (2,31%); з поступовим (1 – 4 тижні) і сповільненим (більше 4 тижнів) темпами виходу з рецидиву; з  одномоментною появою симптомів та синдромів при входженні у рецидив у жителів ЕЗ (10,4%) порівняно з ЕЧ (2,3%). Водночас, зафіксовано найбільшу кількість пацієнтів із короткотривалими (до 1 місяця) рецидивами (15,6%). Стосовно особливостей перебігу ВП РС було достовірно встановлено, що цей тип перебігу розвивався одразу після фази ремісії, яка йшла слідом за дебютом захворювання, без етапу попереднього рецидивування. Причому, стан прогресування у більшості обстежених був дуже коротким (від 1-го до 5-ти років). Отже, два типи перебігу РС (РР та ВП) у Львівській області мають низку негативних рис, які, не виключено, можуть бути обумовленими несприятливими екологічними факторами.

Первинне прогресування патологічного процесу в обстежених хворих виникало одразу після дебюту, часто минаючи етап стабілізації, з дуже короткими термінами первинного прогресування та поступово-прогресуючим варіантом перебігу (Р<0,05). Всі наведені характеристики цього типу перебігу РС, очевидно, і визначають його злоякісність у Львівській області.

Подальші наші дослідження ставили за мету прояснити значення механізмів реалізації патологічного впливу зовнішніх факторів ризику при цьому мультифакторному захворюванні. На сучасному етапі дослідження патогенезу РС здійснюється із загальнобіологічних позицій (Вершигора А.Ю. та співавт., 2005; Волошин П.В. и соавт., 2004; Hemmer B. et al., 2002; Latry V.J. et al., 2003). Характерною ознакою автоімунних захворювань є наявність у крові хворих антитіл (АТ) до власних антигенів. Оскільки ДНК-гідролізуючі абзими володіють високою цитотоксичною активністю, їхня присутність у крові хворих на РС може порушувати баланс лімфоїдних клітин в організмі. Визначення рівня абзимів у плазмі крові хворих на РС, є одним із важливих сучасних напрямків дослідження цієї патології (Polosukhina D.I. et al., 2004). Аналіз раніше опублікованих даних (Kozyr A.V. et al., 1988) свідчить про принципову важливість вибору високочутливого методу визначення АТ у хворих на РС та необхідність порівняння рівня цих АТ у хворих із різних популяцій. Тому на ІІ-му етапі власних досліджень визначали вплив фракцій Ig, виділених із плазми крові обстежених на ріст in vitro лейкемічних В- і Т-лімфоцитів людини і миші. Ig окремих хворих на РС було також перевірено на здатність індукувати апоптоз Т-клітин.

Встановили, що препарати Іg, виділених із плазми венозної крові клінічно здорових людей, володіли цитотоксичною активністю щодо Т-лімфоцитів. Препарати Ig плазми крові хворих на РС характеризувалися нижчою цитотоксичною активністю щодо Т-клітин (лінія МТ-4), а деякі з них навіть слабо стимулювали їх ріст у порівнянні з Ig клінічно здорових донорів. Таких відмінностей у дії цих Ig щодо В-клітин нами виявлено не було. Зниження рівня цитотоксичної дії препаратів Ig щодо Т-клітин може сприяти зростанню кількості та стійкості активованих автореактивних Т-клітин при РС і, як наслідок, посиленню процесів автоімунної деструкції, що мають місце при цьому захворюванні.