Данченко Ніна Миколаївна. Вплив таурину і гліцину на жовчокислотний та ліпідний склад жовчі щурів за умов цукрового діабету

Краткое описание

Данченко Ніна Миколаївна. Назва дисертаційної роботи: "Вплив таурину і гліцину на жовчокислотний та ліпідний склад жовчі щурів за умов цукрового діабету"

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
ДАНЧЕНКО НІНА МИКОЛАЇВНА
УДК 612.35+616.36+591.132.5
ВПЛИВ ТАУРИНУ І ГЛІЦИНУ НА ЖОВЧНОКИСЛОТНИЙ
ТА ЛІПІДНИЙ СКЛАД ЖОВЧІ ЩУРІВ ЗА УМОВ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ
03.00.04 – біохімія
Дисертація
на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Науковий керівник:
Весельський Станіслав Павлович,
доктор біологічних наук
Київ – 2015
2
З М І С Т
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ…………………..………………………. 5
ВСТУП…………………………………………………………………………… 7
РОЗДІЛ 1 БІОХІМІЧНИЙ СКЛАД, МЕХАНІЗМИ БІОСИНТЕЗУ ТА
ФУНКЦІЇ ЖОВЧІ……………………………………………………………….. 12
1.1 Біохімічний склад та функції жовчі в організмі людини та тварин……… 12
1.1.1 Сучасні уявлення про клітинні та молекулярні механізми синтезу
жовчних кислот………………………………………………………………….. 19
1.1.2 Молекулярна регуляція активності ключових ензимів у шляхах
синтезу жовчних кислот……………………………………………………….. 23
1.1.3 Внутрішньоклітинний транспорт жовчних кислот………………… 25
1.1.4 Ентерогопатична циркуляція жовчних кислот. Перетворення
жовчних кислот у кишківнику………………………………………………… 26
1.2 Жовчнокислотний та ліпідний склад жовчі за цукрового діабету……….. 27
1.3 Вплив таурину та гліцину на органічний склад жовчі людини та тварин
в нормі та при цукровому діабеті………………………………………………. 30
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ……………………….. 34
2.1 Програма та загальна схема досліджень………………………………… 34
2.2 Відтворення моделі цукрового діабету піддослідних тварин………….. 36
2.3 Визначення інтенсивності секреції жовчі печінкою в щурів у гострому
експерименті…………………………………………………………………….. 38
2.4 Оцінка якісних і кількісних характеристик жовчі щурів……………….. 39
2.4.1 Визначення вмісту жовчних кислот………………………………. 39
2.4.2 Визначення основних фракцій ліпідів у жовчі тварин………….. 40
2.4.3 Визначення компонентів аденілової системи…………………….. 41
2.5 Визначення біохімічних показників крові щурів в нормі та при
цукровому діабеті………………………………………………………………… 42
2.6 Статистична обробка результатів досліджень з застосуванням
кореляційного та кластерного аналізів………………………………………… 43
3
РОЗДІЛ 3 РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ……….. 46
3.1 Вплив таурину на жовчнокислотний та ліпідний склад жовчі інтактних
щурів ……………………….…………………………………………………… 46
3.1.1 Жовчнокислотний склад жовчі щурів за дії таурину………………. 46
3.1.2 Ліпідний склад жовчі щурів при навантаженні їх організму
таурином………………………………………………………………………… 49
3.2 Вплив гліцину на жовчнокислотний та ліпідний склад жовчі інтактних
щурів ……………………………………………………………………………. 51
3.2.1 Жовчнокислотний склад жовчі щурів за дії гліцину………………. 51
3.2.2 Ліпідний склад жовчі щурів при навантаженні їх організму
гліцином………………………………………………………………………… 55
3.3 Жовчнокислотний склад жовчі за умов відтворення моделі цукрового
діабету алоксаном………………………………………………………………. 61
3.3.1 Динаміка змін жовчнокислотного складу жовчі щурів…………. 61
3.3.2 Ієрархічна кластеризація показників жовчнокислотного складу
жовчі щурів……………………………………………………………………… 89
3.3.3 Аденілові нуклеотиди в тканинах щурів за умов
алоксаніндукованого діабету…………………………………………………… 98
3.4 Вплив гліцину і таурину на жовчнокислотний та ліпідний склад жовчі
щурів за умов розвитку цукрового діабету…………………………………. 101
3.4.1 Жовчнокислотний склад жовчі щурів з цукровим діабетом за дії
гліцину і таурину………………………………………………………………. 101
3.4.2 Вплив гліцину і таурину на ліпідний склад жовчі щурів………….. 113
3.4.3 Вплив гліцину і таурину на рівень колоїдної стабільності жовчі
щурів……………………………………………………………………………. 119
3.5 Оцінка впливу гліцину і таурину на стан організму щурів при цукровому
діабеті за даними біохімічних характеристик їхньої крові…………………… 137
3.5.1 Особливості змін ліпідного складу крові щурів…………………. 137
3.5.2 Особливості змін активності ферментів у крові щурів………….. 143
4
3.5.3 Особливості вуглеводного, білкового та мінерального обміну в
крові щурів……………………………………………………………………… 147
3.5.4 Результати кореляційного аналізу особливостей взаємозв’язків
між дослідженими показниками крові щурів………………………………… 151
3.5.5 Аналіз кластерів з загальної сукупності біохімічних показників
крові……………………………………………………………………………… 164
РОЗДІЛ 4 УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ…………….. 173
ВИСНОВКИ……………………………………………………………………… 182
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ……………………………………….. 184
ДОДАТКИ………………………………………………………………………... 205
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
БАД – біологічно активні добавки
ЖК – жовчні кислоти
ЖНК – жирні кислоти
ДБ – диглюкуронід білірубіна
ХЦК – холецистокінін
ЛГ – лізосомальні гідроксилази
ЕГЦ – ентерогепатична циркуляція
цАМФ – циклоаденозінмонофосфат
АЦ – аденілатциклаза
ХК – холева кислота
ДХК – дезоксихолева кислота
ХДХК – хенодезоксихолева кислота
ЛХК – літохолева кислота
АХК – алохолева кислота
УДХК – урсодезоксихолева кислота
ТХК – таурохолева кислота
ТХДХК – таурохенодезоксихолева кислота
ТДХК – тауродезоксихолева кислота
ГХК – глікохолева кислота
ГХДХК – глікохенодезоксихолева кислота
ГДХК – глікодезоксихолева кислота
ЦД – цукровий діабет
FGF-15/19 – fibroblast growth factor (фактор росту фібробластів)
FXR – farnesoid X receptor (рецептор жовчних кислот)
CYP7A – cytochrome P450 7A1 (холестерин-7α-гідроксилаза)
TGR5 – the G protein-coupled bile acid receptor
D-2 – deiodinase-2 (дейодиназа-2)
6
CFTR – cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
MRP;
MDRP
– multidrug resistance protein (білок полірезистентності до
лікарського впливу)
BSEP – bile salt export pump (експортуючі помпи ЖК)
CAR – constitutive androstane receptor
PXR – pregnane X receptor
HNF-4α – hepatocyte nuclear factor 4 alpha
7
ВСТУП
Актуальність теми. За визначенням Всесвітньої організації охорони
здоров’я цукровий діабет (ЦД) набув статусу епідемії ХХІ століття [50, 91].
Кількість хворих на ЦД безперервно зростає і в даний час перевищило 200
млн., що складає приблизно 4% населення Землі [53]. Більшість з них (85-90%)
страждають на ЦД 2-го типу, який розвивається в осіб зрілого віку. Хворі на
цукровий діабет І-го типу складають 10% від загальної кількості хворих на ЦД,
але до цієї групи відносяться переважно діти і підлітки [139]. Серед усіх тяжких
хронічних захворювань у дітей ЦД І-го типу посідає третє місце після
бронхіальної астми і дитячого церебрального паралічу [51]. На відміну від ЦД
2-го типу запобігти виникненню ЦД І-го типу неможливо [73]. Середня
тривалість життя хворих з дитинства на ЦД не перевищує 40 років [7, 9, 49].
Тому ЦД І-го типу є актуальною проблемою сучасної ендокринології [11].
Доведено, що саме гіперглікемія при ЦД призводить до глікозилювання
білків, оксидативного стресу, пошкодження клітинних мембран, поступового
розвитку типових для ЦД ускладнень: пошкодження нервів (полінейропатії),
ураження судин (мікро- і макроангіопатії), порушення функцій різних органів і
систем організму, зокрема шлунково-кишкового тракту [30, 52, 54]. Відомо, що
підвищення глюкози в крові гальмує холерез у піддослідних тварин, а таурин, в
певних дозах, може ефективно знижувати майже на третину рівень глюкози в їх
крові [2, 47, 54].
Згідно з останніми оцінками, ураження печінки – одна з найбільш частих
патологій при ЦД [67]. Розвиток цукрового діабету негативно впливає на стан
печінки, порушуючи обмін білків, амінокислот, жирів, жовчних кислот і
функціонування ферментних систем гепатоцита, що в свою чергу призводить
до розвитку хронічних захворювань печінки [68]. Окрім цього, виявлено факт
підвищеної втрати із сечою таурину організмом людини за умов цукрового
діабету.
Жовчні кислоти (ЖК) та їх рецептори в деяких випадках можуть слугувати
8
певними маркерами оцінки стану печінки та ефективності медичних засобів
лікування холестатичних захворювань, в тому числі ЦД, ожиріння та
метаболічного синдрому [59].
Гальмувати прогресування серйозних патологій печінки при ЦД можна за
допомогою амінокислот, таких як таурин [161] та, частково, гліцин [53].
Оскільки ці дві амінокислоти входять до складу печінкового секрету у вигляді
кон’югатів ЖК можна припустити, що вони здатні впливати не тільки на
хімічний склад жовчі, а і регулювати інтенсивність секреції жовчі через
модулювання активності поліферментних систем печінки, зокрема CYP7A1 –
ключового ферменту синтезу жовчних кислот – EC:1.14.13.17 [122]. Наукові
дані щодо зовнішньосекреторної функції печінки за умов розвитку ЦД досить
суперечливі, а цілий ряд аспектів залишається нез’ясованим. У зв’язку з цим є
актуальним проведення комплексного дослідження особливостей впливу
таурину і гліцину, за умов ЦД, на жовчоутворення та перебіг процесів в
окремих ланках жовчнокислотного та ліпідного обміну в печінці щурів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана відповідно до плану наукових досліджень
Київського національного університету імені Тараса Шевченка і є фрагментом
наукової теми Навчально-наукового центру “Інститут біології” “Механізми
реалізації адаптаційно-компенсаторних реакцій організму за умов розвитку
різних патологій” № д/р 0111U004648 (2011-2015 pp.), № 11БФ036-01.
Метою даної роботи є дослідження впливу таурину і гліцину на окремі
ланки жовчнокислотного та ліпідного обміну в печінці щурів за норми та при
розвитку експериментального цукрового діабету.
Об’єкт дослідження – регуляція зовнішньосекреторної функції печінки
щурів.
Предмет дослідження – рівень холесекреції, вміст вільних та
кон’югованих жовчних кислот та основних фракцій ліпідів у жовчі і
холестеролу в ліпопротеїдах різної щільності, активність маркерних ферментів
в плазмі крові, компонентів аденілової системи в тканинах щурів з
9
алоксаніндукованим цукровим діабетом.
Відповідно до мети даної роботи були поставлені наступні завдання:
1. Дослідити вплив таурину та гліцину на окремі ланки жовчнокислотного
та ліпідного обміну в печінці щурів за нормальних умов.
2. Визначити зміни в жовчнокислотному та ліпідному обміні в печінці
щурів при моделюванні алоксаніндукованого ЦД.
3. З’ясувати особливості впливу таурину і гліцину на жовчнокислотний та
ліпідний обмін у печінці щурів при алоксаніндукованому цукровому діабеті.
4. З’ясувати особливості змін біохімічних показників крові щурів із
алоксаніндукованим цукровим діабетом та при дії гліцину і таурину.
5. Дослідити кореляційні зв’язки між визначеними біохімічними
показниками та провести ієрархічну їх кластеризацію з метою побудови
прогностичних моделей оцінки особливостей корегуючої дії таурину та гліцину
на організм щурів з алоксаніндукованим ЦД.
Методи дослідження: фізіологічні (лапаротомія та зондування жовчної
протоки в гострих дослідах на щурах) – для вивчення впливу алоксану, гліцину
і таурину на холесекрецію; біохімічні – тонкошарова хроматографія жовчних
кислот і основних фракцій ліпідів жовчі та компонентів аденілової системи в
тканинах з їх визначенням за допомогою денсітометрів ДО-1М та Shimadzu GS920, визначення вмісту вільної глюкози, холестеролу в ліпопротеїдах різної
щільності, активність маркерних ферментів та деяких метаболітів білкового та
мінерального обміну в плазмі крові за допомогою біохімічного аналізатора
“FlexorXteiSelestraXL” (Голландія); статистичні – для оцінки вірогідності
результатів залучався багатовимірний, в тому числі кореляційний, факторний і
кластерний аналізи з використанням комп’ютерної програми SPSS-13,0.
Наукова новизна. Вперше показано можливість та особливості впливу
таурину і гліцину на зовнішньосекреторну функцію печінки щурів за норми та
при розвитку експериментального діабету. Виявлено зміни в спектрі жовчних
кислот та основних фракцій ліпідів у жовчі щурів за дії алоксану, таурину та
гліцину. Встановлено, що у щурів з алоксаніндукованим діабетом рівень
10
кон’югованих жовчних кислот суттєво знижується у жовчі, а застосування
таурину за цих умов сприяє підвищенню їх частки в цій біорідині до
контрольних значень. Виявлено суттєві зміни в ефективності роботи
поліферментних систем, що забезпечують процеси гідроксилювання та
кон’югації жовчних кислот з амінокислотами. Одночасно проаналізовано
закономірності змін співвідношення холестеролу в ліпопротеїдах різної
щільності (ЛПВЩ, ЛПНЩ, ЛПДНЩ) та окремих основних фракцій ліпідів в
крові щурів за умов розвитку алоксаніндукованого цукрового діабету та за
корегуючої дії таурину і гліцину. Проведено також оцінювання активності
деяких маркерних ферментів (АлАТ, АсАТ, альфа-амілаза, фосфатаза лужна) та
змін рівня в цій біорідині певних показників білкового та мінерального обміну.
Вперше застосовано кореляційний і кластерний аналіз для оцінки
функціонального стану організму тварин за дії провокуючого цукровий діабет
агента – алоксану та корегуючих чинників – гліцину і таурину.
Практичне значення одержаних результатів. Робота відноситься до
фундаментальних досліджень з потенційною прикладною значимістю.
Одержані результати розширюють і поглиблюють існуючі уявлення про
перебіг біохімічних процесів, що забезпечують жовчоутворення в печінці щурів
за умов розвитку алоксаніндукованого цукрового діабету та корегуючій дії
таурину і гліцину.
Результати експериментальних досліджень є теоретичною передумовою
для можливого застосування таурину та гліцину в практичній медицині як
засобів, що послаблюють і м’яко згладжують кардинально змінені метаболічні
перебудови в організмі хворих на цукровий діабет.
Отримані дані можуть бути впроваджені також в навчальний процес при
розробці чи формуванні спеціального курсу стосовно особливостей
функціонування гепатобіліарної системи за певних патологічних станів для
студентів біологічних факультетів університетів та медичних вузів.
Апробація: результати даної роботи були представлені на наукових
форумах та у вигляді тез доповідей увійшли до відповідних збірників: 1.
11
Матеріали ХІ Міжнародного біохімічного конгресу (Київ, 2014); 2.
Психофизические и висцеральные функции в норме и патологии /VI
Международная конференция, посвященная 170-летию кафедры физиологии
человека и животных и 100-летию школы электрофизиологии Киевского
университета (Київ, 2012); 3. Нетрадиційні методи лікування (натуропатія) з
позицій доказової медицини / науковий симпозіум з міжнародною участю
(Київ, 2013); 4. Шевченківська весна 2013: біологічні науки / XI міжнародна
наукова конференція студентів та молодих науковців (Київ, 2013); 5.
Всеукраїнська конференція «Фізіолого-біохімічні і технологічні аспекти
охорони навколишнього середовища» (Мелітополь, 2013).
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано
наукову літературу за темою роботи. Самостійно виконано експериментальні
дослідження, математично опрацьовано первинні дані досліджень та
підготовлено матеріали до публікації. За участі співавторів публікацій проведено
інтерпретацію отриманих результатів. Планування експерименту та розробка
методичних підходів, формування робочої ідеї, узагальнення результатів
досліджень та редагування дисертаційної роботи здійснено спільно з науковим
керівником.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць у
вітчизняних фахових виданнях, рекомендованих Департаментом акредитації
кадрів України – 7 статей, тез наукових конференцій і з’їздів – 5.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, чотирьох
розділів і висновків, містить 46 таблиці і 37 рисунків, список використаних
джерел із 200 найменувань (із них 131 – латиницею) та 3 додатків – 38 таблиць
і 3 рисунка. Повний обсяг дисертації складає 241 сторінок, основний зміст
роботи викладено на 155 сторінках комп’ютерного тексту.

Список литературы

ВИСНОВКИ
В представленій дисертаційній роботі відповідно до мети та завдань
дослідження за допомогою об’єктивних методів визначення функціонального
стану гепатобіліарної системи проведено аналіз змін перебігу фізіологобіохімічних процесів які забезпечують зовнішньосекреторну функцію печінки
за дії гліцину і таурину у щурів з алоксаніндукованим діабетом. З отриманих
результатів зроблено наступні висновки.
1. Введення екзогенного таурину інтактним щурам значно інтенсифікує
роботу поліферментних систем печінки, забезпечуючи його кон’югацію з
жовчними кислотами. Однак, при цьому знижується їх кон’югація з гліцином,
що додатково підтверджується значними змінами коефіцієнтів співвідношення
гліко- до таурохолатів в отриманій жовчі.
2. Гліцин у меншій апробованій дозі (4,9 мг/100 грам маси тіла тварин)
більш суттєво сприяв посиленню у печінці нормальних щурів процесів
кон’югації жовчних кислот не лише з цією амінокислотою, а й з таурином, що
супроводжувалося значним зростанням коефіцієнта кон’югації ЖК.
3. При відтворенні моделі цукрового діабету за допомогою алоксану
спостерігається зниження ефективності роботи поліферментних систем, які
забезпечують біосинтез жовчних кислот та деяких фракцій ліпідів, що є однією
з основних причин виявленого значного гальмування холерезу у піддослідних
щурів. Встановлено достовірні зміни інтегральних характеристик жовчі, якими
є холатохолестериновий індекс, коефіцієнт кон’югації та гідроксилювання ЖК,
а також співвідношення тауро- і глікокон’югованих ЖК, вказують на суттєві
перебудови обміну жовчних кислот що, як наслідок, призводить до
дестабілізації колоїдної системи жовчі.
4. На тлі цукрового діабету таурин і гліцин по-різному впливають на
жовчнокислотний склад жовчі. З усіх досліджених показників ЖКС тільки
зміни вмісту суміші ГХДХК і ГДХК у цих дослідних групах є
односпрямованими.
183
5. За дії гліцину у щурів з експериментальним ЦД підвищується вміст
жирних кислот у жовчі. Водночас нормалізується вміст тригліцеридів і ефірів
холестерину. Таурин на тлі цукрового діабету нормалізує вміст жирних кислот,
суттєво підвищує вміст фосфоліпідів та вільного холестерину, водночас
достовірно знижує вміст його ефірів.
6. Під впливом таурину відмінності ліпідного складу крові у щурів з
експериментальним ЦД, порівняно з контрольною групою посилюються, а
гліцин, навпаки, сприяє максимальному наближенню характеристик ліпідного
профілю крові щурів з ЦД до контрольної групи. При цьому обидві
амінокислоти, на тлі цукрового діабету, сприяють нормалізації рівня глюкози і
ряду показників білкового та мінерального обміну. Втім, гліцин більш
позитивно впливає на вміст фосфору і заліза, а таурин – магнію.
7. Кореляційний аналіз з побудовою відповідних кластерних моделей
більш наочно виявляє важливі взаємозв’язки між певними процесами в
організмі тварин та вказує ланки в обміні речовин, на які припадають основні
зрушення за розвитку цукрового діабету та корегуючої дії тауринуі гліцину.