Молекулярно-генетические механизмы развития идиопатической рестриктивной кардиомиопатии Костарева Анна Александровна

Краткое описание

Костарева Анна Александровна. Молекулярно-генетические механизмы развития идиопатической рестриктивной кардиомиопатии: диссертация ... доктора Медицинских наук: 14.01.05 / Костарева Анна Александровна;[Место защиты: ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2019.- 314 с.

Молекулярно-генетические механизмы развития идиопатической рестриктивной кардиомиопатии Костарева Анна Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

доктор наук Костарева Анна Александровна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Идиопатическая рестриктивная кардиомиопатия и спектр ее генетических причин

1.2. Кардиомиопатии и нейромышечные заболевания

1.3. Особенности течения сердечной недостаточности и прогноз

для пациентов с РКМП

1.4. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных

с мутациями в гене десмина (DES)

1.5. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных

с мутациями в гене ламина А/С (LMNA)

1.6. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных

с мутациями в гене сердечного тропонина I (TNNI3)

1.7. Роль генетических детерминант в развитии рестриктивного фенотипа и диастолической дисфункции

1.8. Перспективы дальнейших научных исследований

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Формирование группы пациентов с идиопатической рестриктивной кардиомиопатией (РКМП)

2.2. Формирование группы пациентов с ХСН с целью изучения ассоциации полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функционирования саркомера, с развитием рестриктивного фенотипа

2.3. Секвенирование нового поколения

2.4. Создание генетических конструкций, несущих мутации гена десмина, для последующей генетической модификации мышечных клеток

2.5. Клонирование гена десмина с использованием конструкции

на основе лентивирусного вектора

2.6. Мутагенез на основе плазмиды с геном десмина

2.7. Продукция лентивирусных конструкций, содержащих ген десмина

2.8. Получение индуцированных плюрипотентных клеток (иПСК)

и их дифференцировка в кардиогенном направлении

2.9. Получение первичной культуры мышечных клеток мыши

2.10. Культивирование клеток линии С2С12 и миогенная дифференцировка сателлитных клеток и клеток линии С2С12

2.11. Трансдукция первичных миофибрилл мыши и клеток линии

С2С12 лентивирусными конструкциями

2.12. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток

2.13. ПЦР в реальном времени для определения экспрессии

миогенных маркеров

2.14. Оценка внутримитохондриального уровня кальция

2.14.1. Применение флюоресцентных красителей и стимуляция митохондриального захвата кальция

2.14.2. Конфокальная лазерная микроскопия

2.15. Исследование функции клеточного дыхания в культуре клеток

с использованием прибора «Sea horse»

2.16. Исследование функции потенциалзависимого натриевого канала (Nav1.5) с помощью методики локальнй фиксации мембранного потенциала

2.17. Создание генетических конструкций, несущих мутации гена LMNA, для последующей модификации мезенхимных стволовых клеток

2.18. Культивирование ММСК и их дифференцировка

2.19. Подсчет эффективности дифференцировки

2.20. Определение колониеобразующей способности ММСК

методом предельных разведений

2.21. Анализ экспрессии остеогенных и адипогенных маркеров

2.22. Множественный анализ экспрессии генов

2.23. Вестерн-блоттинг с применением антител к ламину А/С

и оценка общей активности гистоновых деацетилаз

2.24. Конструирование вектора и мутагенез мутантных форм

гена TNNI3

2.25. Выделение белка для исследований in vitro

2.26. Коседиментация

2.27. Поверхностный плазмонный резонанс

2.28. Оценка активности актин-миозиновой-S! АТФ-азы в восстановленном комплексе и силы сокращения изолированных миофибрилл

2.29. Определение аллелей и генотипов методом полимеразной

цепной реакции в реальном времени

2.30. Статистическая обработка данных

2.30.1. Статистическая обработка данных ПЦР в реальном

времени

2.30.2. Статистическая обработка данных генотипирования и сравнение частот единичных нуклеотидных полиморфизмов

2.30.3. Статистическая обработка данных расчета риска исхода

ХСН с применением расчетных шкал

Глава 3. Клиническая характеристика пациентов с идиопатической рестриктивной кардиомиопатией

3.1. Описание исследуемой когорты пациентов

3.2. Анализ кривых выживаемости пациентов с РКМП

3.3. Анализ возможности использования шкал прогноза ХСН

в когорте пациентов с идиопатической РКМП

Глава 4. Генетический спектр идиопатической рестриктивной кардиомиопатии

4.1. Качество проведенного секвенирования, глубина покрытия

и классификация новых и ранее описанных генетических вариантов

4.2. Анализ генетических вариантов в соответствии

с классификацией ACMG

4.3. Моделирование основных белковых взаимодействий

и сигнальных связей, ассоциированных с РКМП

4.4. Анализ влияния патогенных и вероятно-патогенных вариантов

в группе пациентов с РКМП на клиническое течение заболевания... 142 Глава 5. Исследование генетической этиологии РКМП в сочетании с признаками поражения нейромышечной системы

5.1. РКМП, ассоциированная с мутацией в гене DES

5.2. РКМП, ассоциированная с мутацией в гене BAG3

5.3. РКМП, ассоциированные с мутациями в гене FLNC

Глава 6. Разработка оптимальной схемы генетической диагностики

у пациентов с идиопатической РКМП

Глава 7. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями гена десмина DES

7.1. Оценка влияния мутантных форм гена десмина на изменение концентрации митохондриального Са2+ в первичной культуре мышечных клеток

7.2. Эффект мутаций гена десмина на внутримитохондриальный

захват кальция под воздействием электрического тока

7.3. Влияние мутаций гена десмина на внутримитохондриальный

захват кальция вследствие активации рианодинового рецептора

7.4. Эффект мутаций гена десмина на уровень цитоплазматического кальция

7.5. Оценка методом «Sea horse» функции клеточного дыхания в культуре миотрубок после трансдукции нормальными

и мутантными формами гена десмина

7.6. Оценка функции потенциалзависимых натриевых каналов (Nav1.5)

в кардиомиоцитах, несущих c.735+1G>A мутацию в гене DES

Глава 8. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями гена LMNA

8.1. Характеристика мезенхимных стволовых клеток и уровень экспрессии LMNA после лентивирусной трансдукции

8.2. Влияние мутации гена ламина на колониеобразующую способность ММСК

8.3. Влияние мутаций гена ламина на адипогенную и остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток

8.4. Влияние мутаций гена ламина на экспрессию маркеров адипогенной дифференцировки ММСК

8.5. Влияние мутаций гена ламина на экспрессию маркеров остеогенной дифференцировки ММСК

8.6. Влияние мутации LMNA на экспрессионный профиль при дифференцировке ММСК

8.7. Оценка влияния мутаций гена LMNA на дифференцировку сателлитных мышечных клеток в миогенном направлении

и формирование миотрубок

8.8. Влияние мутаций LMNA на экспрессию маркеров миогенной дифференцировки

8.9. Эффект мутаций LMNA на активность гистондеацетилазы

Глава 9. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития кардиомиопатий, ассоциированных с мутациями гена тропонина I (TNNI3)

9.1. Клиническая картина РКМП на фоне мутаций в гене TNNI3

9.2. Исследование взаимодействия мутантных форм тропонина I с белками тонких филаментов методом коседиментации и плазмонного резонанса

9.3. Оценка активности актин-миозиновой-S! АТФ-азы

9.4. Исследование ассоциации полиморфных вариантов генов, участвующих в регуляции функционирования саркомера,

с развитием рестриктивного фенотипа у пациентов с ХСН

Глава 10. Обсуждение

10.1. Особенности клинического течения и информативность шкал расчета риска ХСН при идиопатической РКМП в различных возрастных группах

10.2. Генетический спектр идиопатической рестриктивной кардиомиопатии

10.3. Исследование генетической этиологии РКМП, протекающей

в сочетании с поражением нейромышечной системы

10.4. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных

с патологическими вариантами в гене DES

10.5. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных

с патологическими вариантами в гене LMNA

10.6. Молекулярные механизмы кардиомиопатий, ассоциированных

с патологическими вариантами в гене TNNI3

10.7. Роль генетических детерминант в развитии рестриктивного фенотипа и диастолической дисфункции

Выводы

Практические рекомендации

Список условных сокращений

Список литературы

Список литературы

Кардиомиопатии и нейромышечные заболевания
Генетические исследования нейромышечных заболеваний (НМЗ) внесли существенный вклад в раскрытие генетических аспектов врожденной патологии сердечно-сосудистой системы, такой как кардиомиопатии и наследственные аритмические синдромы [21]. Прежде всего необходимо отметить, что первая мутация, описанная у пациента с ДКМП, была мутацией в гене DYS, который за несколько лет до этого стал известен как причинный ген развития мышечной дистрофии Дюшенна [5, 177]. Поражение миокарда в виде ДКМП при этом X-связанном варианте мышечной дистрофии инициировало поиск мутаций в гене дистрофина у пациентов мужского пола с изолированными вариантами ДКМП даже без мышечного фенотипа [129]. С тех пор было описано более 80 генов, ассоциированных с различными типами кардиомиопатий, около 25% из них также вызывают нейромышечные заболевания в качестве аллельных форм. Связь между возникновением сердечно-сосудистых и нейромышечных проявлений обусловлена одновременной экспрессией гена как в скелетной, так и сердечной мышце, а иногда и в клетках гладкой мускулатуры. Это особенно касается структурных белков миоцитов, таких как дистрофин (DYS) и саркогликаны, десмин (DES) и тайтин (TTN). Исходный список таких давно известных генов, как DYS, LMNA, DES, CRYAB, TAZ и CRYB в последнее время был значительно расширен благодаря внедрению технологии массового параллельного секвенирования, и в настоящее время включает также гены CAV3, BAG3, FLNC, ТТН, ZASP, FKTN, FKRP, FHL1, SYNE1, MYPN, CSRP, Т-САР, MYH7, MYBPC3 и ряд других [83, 97, 118, 210, 239, 259, 289, 292, 297, 348, 441]. Некоторые из этих генов, кодирующих структурные белки, например LMNA, LDB3 и MYOZ, также имеют регуляторную функцию, участвуя в модулировании экспрессии генов и механотрансдукции [110, 131, 135, 444]. Известно, что результирующий фенотип вследствие патогенных вариантов в данных генах может быть преимущественно либо мышечным, либо сердечным, либо и тем, и другим. Однако точная корреляция генотипа и фенотипа не всегда прослеживается. Иногда определенная мутация может привести к развитию всех фенотипических форм заболевания, часто даже в одной и той же семье, что, вероятно, может быть обусловлено ген-генными взаимодействиями и влиянием модифицирующих генов, факторов окружающей среды или образа жизни. В связи с этим пациент с предполагаемой генетически обусловленной кардиомиопатией всегда должен быть осмотрен на наличие субклинических нейромышечных симптомов, а каскадное обследование членов семьи должно включать целенаправленное неврологическое обследование и ряд биохимических и функциональных мышечных тестов. С другой стороны, обследование сердечно-сосудистой системы должно быть обязательной частью клинического обследования пациента и его родственников с нейромышечным расстройством. Наиболее частыми причинами развития кардиомиопатий с нейромышечной симптоматикой являются мутации в генах ламина, десмина и дистрофина.
Ламинопатии представляют собой группу заболеваний, вызванных мутациями в гене LMNA, кодирующего ламин А/С — основной компонент ядерной ламины. Ламинопатии охватывают широкий спектр расстройств с преимущественным поражением нейромышечной системы, часто с вовлечением миокарда и развитием фатальных нарушений сердечного ритма. Помимо этого ламинопатии могут проявляться в виде изолированной кардиомиопатии, липодистрофии, периферической нейропатии, а также прогерии Хатчинсона Гилфорда.
Основными формами мышечной дистрофии, ассоциированной с мутациями в LMNA, являются аутосомно-доминантная и аутосомно-рецессивная мышечная дистрофия ЭмериДрейфуса (EDMD2 и EDMD3) и конечно-поясная мышечная дистрофия 1B (LGMD1B). Миодистрофия ЭмериДрейфуса характеризуется клинически ранними контрактурами и медленно прогрессирующей дистрофией и атрофией проксимальных скелетных мышц. При обеих формах этой ламинопатии наблюдается поражение миокарда, как правило, в форме ДКМП или наджелудочковых и желудочковых нарушений ритма вплоть до развития АКМП с довольно поздним дебютом, примерно в 3040 лет. Однако недавно было описано несколько случаев РКМП на фоне мутаций в гене ламина [62, 275]. Наиболее типичной особенностью кардиомиопатий, связанных с ламинами A/C, является нарушение проводимости и ритма. Так, при метаанализе 299 пациентов с мутациями в LMNA, у 18% пациентов в возрасте до 10 лет имелись признаки замедленного атриовентрикулярного проведения, а среди пациентов старше 30 лет более 90% имели признаки нарушения проводимости, которые в 44% требовали постановки кардиостимулятора [402]. Важной для понимания фенотипического проявления кардиомиопатий, связанных с мутациями в гене LMNA, является работа M. Palled, в которой впервые показана возможность развития РКМП вследствие ламинопатии [306]. Суммируя вышесказанное, мутации в гене LMNA являются одними из наиболее частых причин КМП, ассоциированных с поражением нейромышечной системы, приводя к формированию дилатационной, аритмогенной или рестриктивной кардиомиопатии.
Десмин-ассоциированная кардиомиопатия — еще одна первичная генетическая кардиомиопатия, которая часто сочетается с нейромышечным фенотипом. Десмин-ассоциированные миопатии и кардиомиопатии связаны с мутациями в гене DES или других генах, влияющих на структуру или функцию промежуточных филаментов. Десмин является основным промежуточным филаментом всех типов мышечных клеток скелетной, сердечной и гладкой мускулатуры в постнатальном периоде, обеспечивающим структурно механические цитоскелетные функции и выступающим в качестве якоря для нескольких клеточных органелл [90, 172]. Филаменты десмина соединяют миофибриллы с ядерными и наружными клеточными мембранами, являясь частью десмосом и структуры костамера и, таким образом, обеспечивают механическую целостность и передачу силы в мышечные клетки.
В 1978 году Fardeau описал случай семейной миопатии с накоплением десмин-положительных гранулофиламентных агрегатов в мышечных клетках и связал эту патологию с десмином, что позже было подтверждено и другими авторами [122, 127]. В течение следующих 20 лет появилось большое количество публикаций о случаях наследственных миопатий и кардиомиопатий с внутриклеточным накоплением десмина. В 1998 году Goldfarb впервые продемонстрировал, что эти расстройства могут быть вызваны мутациями в гене DES [148]. К настоящему моменту описано более 50 мутаций в этом гене, и их число продолжает увеличиваться. Большинство описанных мутаций локализованы в последовательности, кодирующей С-концевую часть стержневого домена десмина, в экзонах 5 и 6. Из-за высокой экспрессии десмина во всех типах мышечных клеток у большинства пациентов с мутацией в этом гене обнаруживается нейромышечная симптоматика в сочетании с различными вариантами кардиомиопатий. Только у 22% пациентов выявляются изолированные проявления со стороны сердечно-сосудистой или мышечной системы, а в остальных случаях тщательное обследование пациентов приводит к выявлению сочетанной симптоматики [404]. Примерно в половине случаев кардиомиопатия имеет фенотип ДКМП, однако может проявляться и РКМП или ГКМП. Тот факт, что при десминовой кардиомиопатии средний возраст постановки диагноза ДКМП (46 лет) значительно выше, чем РКМП (33 года) или ГКМП (28 лет), наряду с нашими собственными наблюдениями свидетельствует о том, что гипертрофия миокарда или рестриктивный тип наполнения могут представлять собой более ранние стадии заболевания, которое потом трансформируется в ДКМП и тяжелую систолическую дисфункцию [404]. Дебют заболевания обычно происходит в возрасте от 20 до 40 лет при аутосомно-доминантном типе наследования, однако в редких случаях аутосомно-рецессивного типа наследования симптомы появляются в раннем детстве, а болезнь прогрессирует быстрее [319, 389, 404]. Симптомы миопатии могут включать дистальную и проксимальную мышечную слабость и атрофию [362]. Поскольку клиническая картина миопатии может развиваться вслед за проявлениями кардиомиопатии, все пациенты с подозрением на десминовую кардиомиопатию должны быть тщательно обследованы неврологом с применением и электромиографии. Для десминопатий характерно незначительное повышение уровня общей креатинфосфокиназы (КФК), в большинстве случаев не превышающее 24-кратного уровня нормальных значений. Однако даже в случаях изолированного мышечного фенотипа повышение KФК может отсутствовать, поэтому отсутствие биохимических маркеров скелетно-мышечного поражения не исключает наличия у пациентов десминовой миопатии.
Одними из наиболее типичных признаков десминовой кардиомиопатии являются нарушения проводимости и желудочковые аритмии, сходные с наблюдаемыми при мутациях в гене ламина A/C. Как и в случае ламинопатий, они могут предшествовать развитию дисфункции левого желудочка, но случаи изолированного расстройства проводимости не являются частыми, и в конечном итоге обычно развивается дилатационное ремоделирование миокарда. Наиболее частыми нарушениями ритма при десминовых кардиомиопатиях являются атриовентрикулярные блокады наряду с блокадой ножек пучка Гиса и аномалиями синоатриальной проводимости. Десмин-связанная кардиомиопатия может проявляться преимущественно в виде ДКМП с желудочковыми нарушениями ритма, в связи с чем, несмотря на низкую частоту мутаций в гене DES, случаи АКМП также могут рассматриваться как возможное проявление десминопатий [208, 305, 308, 406].
Описание исследуемой когорты пациентов
Исследуемая когорта пациентов с идиопатической рестриктивной кардиомиопатией включала 35 пациентов взрослой и детской группы, поскольку включение пациентов проходило вне зависимости от возраста дебюта заболевания (Таблица 9). В более чем половине случаев (22 пациента, 63%) заболевание дебютировало в возрасте до 18 лет, таким образом более половины исследуемой когорты на момент появления первых симптомов заболевания (ХСН и/или нарушения ритма) составляли пациенты детского возраста. В девяти случаях первые признаки заболевания проявились в возрасте до 3 лет, а в 14 случаях — до 5 лет. В 34% случаев отмечался семейный характер заболевания. Важно отметить, что у ряда пациентов отмечалась трансформация рестриктивного фенотипа в дилатационный или гипертрофический в течение времени, явления НЛЖ, а также трансформация гипертрофического фенотипа в рестриктивный — так называемая ундулирующая кардиомиопатия. Данный феномен, а также сочетание РКМП с врожденными пороками сердца, такими как ДМПП, ДМЖП и ОАП, наиболее часто наблюдался в группе пациентов с дебютом до 18 лет, встречаясь у 40% обследованных пациентов. Сходный феномен наблюдался и в семейных случаях заболевания и проявлялся сочетанием разных фенотипических форм КМП (рестриктивной, гипертрофической, дилатационной) у членов одной семьи, несущих одинаковую генетическую мутацию. Среди 12 случаев семейных формам заболевания, в 5 случаях заболевание у родственников пробанда проявлялось другими видами кардиомиопатии и структурных патологий сердца, нежели у пробанда (ГКМП, НЛЖ). У 10 (29%) из обследованных пациентов с идиопатической РКМП отмечались признаки нейромышечной патологии (Таблица 9). Пятерым пациентам была проведена трансплантация сердца, двое из которых имели дебют заболевания в возрасте до 18 лет.
Средний возраст дебюта заболевания в обследуемой группе составил 12 лет [1 мес. — 55 лет], при этом среди пациентов детской группы с дебютом до 18 лет он составлял 3 года [1 мес. — 16 лет], а среди пациентов взрослой группы 31 год [22 года — 55 лет]. Для группы пациентов с признаками НМЗ возраст дебюта заболевания был меньше по сравнению с группой пациентов без признаков НМЗ (4 года [0,5 года — 32 года] и 19 лет [1 мес. — 55 лет], p = 0,0388, Рисунок 4а). При анализе длительности заболевания и его исходов в качестве конечных точек рассматривалась смерть пациентов от сердечно-сосудистых заболеваний или трансплантация сердца. Для пациентов с дебютом заболевания до 18 лет медиана возраста достижения конечной точки составила 11 лет [1,5 года — 33 лет], а для пациентов взрослой группы (дебют после 18 лет) 50 лет [38 лет — 60 лет] (p = 0,0001, Рисунок 4б). Продолжительность жизни после постановки диагноза для всех достигших конечной точки пациентов составила 2,4 года [1 год — 26 лет], при этом для пациентов детской группы она была меньшей и составляла 2,2 года [1 год — 18 лет], а для пациентов взрослой группы — 5,6 лет [1 год — 26 лет]. При раздельном анализе группы с дебютом заболевания в детском возрасте для пациентов с дебютом заболевания до 5 лет время достижения конечной точки составляло 2,0 [1,43,25] лет, а для пациентов с дебютом от 5 до 18 лет — 10,5 [1 18] лет (p = 0,05; Рисунок 4в). Эта же тенденция сохранялась и при раздельном анализе всех пациентов по группам с дебютом до 5 лет и после 5 лет, соответственно, 2,0 [1,43,25] лет и 10 [127,25] лет (p = 0,029; Рисунок 4г). При анализе влияния ФП на время достижения конечной точки нами было выявлено, что в группе пациентов с постоянной формой ФП оно составило 4,3 [126] лет, а в группе пациентов без постоянной формы ФП 2,9 [127,25] лет (p = 0,9; Рисунок 4д). Время достижения конечной точки во взрослой группе было существенно ниже среди пациентов с дебютом заболевания с постоянной формой ФП по сравнению с группой пациентов без постоянной формы ФП в дебюте заболевания, соответственно, 2,1 [14] лет и 17 [727,25] (p = 0,014; Рисунок 4е).