Ефективність трансплантації амніотичної оболонки при неінфекційних виразках рогівки

summary

Матеріали й методи дослідження. Експериментальні дослідження.  Вивчення бар’єрної функції АО для запальних клітин проводили in vitro. АО закривали отвір пробірки і щільно фіксували її. Пробірку перевертали і розміщували таким чином, щоб АО знаходилася в посудині з живильним середовищем. З однієї сторони амніотичної оболонки у пробірці знаходилися запальні клітини в живильному середовищі, з іншої – чисте живильне середовище такого ж об’єму. Оцінку проникності запальних клітин через АО проводили через 24 та 36 годин з допомогою імерсійної мікроскопії.

Всі експериментальні дослідження проводили на кроликах породи шиншила, віком 6-8 міс, масою 2,5-3 кг.

Вивчення реакції рогівки на інтерламелярну ТАО в поверхневі шари рогівкової строми  проводили на 10 очах 5 кроликів. Для цього під епібульбарною анестезією 0,25% розчину дикаїну у центральній частині рогівки проводили її розшарування на 1/3 товщини діаметром 6 мм. В розшаровану рогівку заправляли трансплантат АО. Спостереження проводили на протязі 1 місяця.

Модель неінфекційної виразки рогівки розробляли на 20 очах 10 кроликів шляхом інтрастромального введення інсуліновою голкою хімотрипсину 0,02 мл в концентрації 0,1 мг/мл в поверхневі шари центральної частини рогівки. На третій день експерименту лізовані тканини поверхневих шарів строми  висікали ножицями, внаслідок чого утворювалась типова «чиста» виразка рогівки без ознак інфекційного запалення (Пат. 38672 А Україна, МКВ9 А61F9/00. №2000084857).

З метою вивчення впливу ТАО на перебіг і наслідки експериментальної неінфекційної виразки рогівки проводилися дослідження на 52 очах 26 кроликів. Операцію ТАО виконували на 26 очах і стільки ж очей (26) склали контрольну групу, в якій після моделювання неінфекційної виразки рогівки ТАО не проводили. ТАО здійснювали у вигляді реконструкції поверхні рогівки з фіксацією трансплантата в шарах рогівки у нашій модифікації (безшовний спосіб фіксації трансплантата амніотичної оболонки - Пат. 46208 А Україна, МКВ9 А61F9/00. №2000116430). На 3, 7 і 14 добу проводився посів вмісту кон’юнктивальної порожнини для контролю наявності мікрофлори. Оцінку перебігу патологічного процесу проводили за швидкістю епітелізацїі виразки (початок і завершення), розсмоктування інфільтрату та за інтенсивністю помутніння рогівки.

 Гістоморфологічне вивчення ефективності ТАО при експериментальній виразці рогівки на інфільтрацію рогівкової строми запальними клітинами проводилося через 15 і 30 днів після початку експерименту. Відповідно на 15-й і 30-й дні вилучали по 3 тварини з експерименту шляхом повітряної емболії під час кетамінового наркозу. Гістоморфологічні препарати готували стандартним способом з зафарбуванням за Гімза-Романовським (всього по 12 очей, 36 препаратів основної і контрольної груп).

 Дослідження  на лабораторних тваринах проводились при дотриманні принципів біоетики у відповідності до Закону України № 3447-ІV „Про захист тварин від жорстокого поводження”, Загальних етичних принципів експериментів на тваринах, ухвалених Першим Національним конгресом України з біоетики (2001).

Клінічні методи дослідження. Вивчення ефективності ТАО як реконструкції рогівкової поверхні проводилося у 28 хворих (30 очей) неінфекційними виразками рогівки.

Цю групу хворих склали різноманітні за етіологією і патогенезом виразки рогівки, характерними особливостями яких були торпідний рецидивуючий перебіг з персистуючим дефектом, сповільненою регенерацією рогівкового епітелію і строми, неоваскуляризацією рогівки, ознаками кон’юнктивізації рогівкового епітелію, при чому інфекційний фактор на час проведення ТАО не мав значення.

Вік хворих основної групи коливався від 22 до 86 років. Серед них жінок було 12 і чоловіків - 16. Тривалість лікування до операції становила від 3 місяців до 4 років. Термін спостереження  після операції – від 6 місяців до 5 років. Контрольну групу склали 30 хворих з аналогічними за етіологією і важкістю процесу виразками рогівки.

У контрольній групі лікування хворих з неінфекційними виразками рогівки поєднувало використання препаратів, які покращують епітелізацію рогівки та регенерацію рогівкової строми, протизапальну, вітаміно- та тканинну, загальностимулюючу і десенсибілізуючу терапію,  застосування судинопоширюючих, антиоксидантних препаратів та засобів, які підтримують механічну та функціональну стабільність слізної плівки ока. З метою профілактики вторинної бактеріальної інфекції до місцевого лікування включали антибактеріальні препарати.

В основній групі показами для ТАО була неефективність вищезгаданих консервативних методів лікування на протязі одного місяця. ТАО у всіх випадках проводили як реконструкцію рогівкової поверхні у нашій модифікації з фіксацією трансплантата в шарах рогівки. В післяопераційному періоді хворі отримували антибактеріальні краплі для профілактики вторинної бактеріальної інфекції, а також продовжували отримувати протизапальну, епітелізуючу, загальнозміцнюючу, вітамінотерапію тощо.

Ефективність операцій оцінювали за швидкістю епітелізації (початок та завершення) та стабільністю епітелізації, часом суб’єктивного та об’єктивного покращення, часом розсмоктування інфільтрату рогівки, інтенсивністю помутніння рогівки, прозорістю трансплантату, гостротою зору, чутливістю рогівки, ліжкоднем та визначенням стабільності слізної плівки (тест Ширмера, час руйнування слізної плівки, забарвлення флюоресцеїном, оцінка слізного меніска). Для цього проводилися загальноофтальмологічні методи дослідження (офтальмоскопія, біомікроскопія, флюоресцеїнова проба, визначення чутливості рогівки, візометрія тощо), бактеріологічні методи дослідження, фотореєстрація патологічного процесу.    

Біохімічні дослідження проводилися у 14 хворих (14 очей) основної групи і у 9 добровольців (18 очей). Серед досліджуваних ферментів у сльозі хворих ми визначали активність СОД, Кат, ГлП. СОД визначалася за ступінню сповільнення реакції окислення супероксидним радикалом кисню хромогенного субстрату (Макаренко Е.В., 1988). Глутатіонпероксидаза вивчалася з допомогою системи, в якій вона відновлює окислений           глутатіон за допомогою нікотинамідного коферменту: нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату відновленого (НАДФ-Н) (Модель М.А., 1989). Каталазу визначали за швидкістю зменшення концентрації перекису водню, яка вимірювалась спектрофотометрично (Королюк М.А. та ін., 1988).

 Нами досліджувались також ферменти  ЛДГ і МДГ, активність яких визначали за допомогою оптичного тесту Варбурга (Bergmeyer H.U., Be t E., 1970).

Статистична обробка отриманих даних проводилась з використанням статистичних програм STATISTICA for Windows 5.0 і визначенням достовірності за показником Ст’юдента,  критерієм Манна-Уітні, Уілкоксона та Мак-Немара.

Лікувальний ефект трансплантації амніотичної оболонки при неінфекційних виразках рогівки в експерименті та клініці.

Ефективність трансплантації амніотичної оболонки при експериментальних неінфекційних виразках рогівки. При дослідженні  in vitro проникності амніотичної мембрани для запальних клітин у чистому живильному середовищі Т-лімфоцитів не виявлено у жодному випадку. Таким чином, АО є непроникною для запальних клітин, що є підставою для її застосування у лікуванні неінфекційних виразок рогівки у вигляді реконструктивної трансплантації, тому що вона блокує один з шляхів проникнення запальних клітин з кон’юнктивальної порожнини в рогівкову строму через поверхню виразки.

Оскільки за даними літератури АО при її трансплантації у вигляді реконструктивної операції інкорпорується в шарах рогівки, дослідження реакції рогівки і інших тканин ока проводили на інтерламелярну ТАО. Результати дослідження показали, що АО не викликає запальної реакції рогівки і переднього відрізку ока, а також реакції відторгнення трансплантата. Рогівкова строма у всіх випадках була прозорою, лише візуалізувалася АО. Таким чином АО може бути використана для трансплантації у вигляді реконструктивної операції рогівки.

При моделюванні неінфекційної виразки рогівки після введення хімотрипсину у рогівковій стромі утворювався диск сірого кольору з чіткими межами діаметром біля 5 мм. До третього дня експерименту утворювався інфільтрат, що на 0,5-1,0 мм перевищував попередній діаметр внаслідок запальної реакції навколишніх тканин. Після висікання поверхневих шарів строми на третій день експерименту утворювалась виразка рогівки без ознак інфекційного запалення, що підтверджується відсутністю патогенної мікрофлори при бактеріологічному обстеженні. Таким чином модельована виразка рогівки відповідала необхідним для запланованих досліджень вимогам: запальний процес мав неінфекційний характер зі сповільненою епітелізацію та регенерацією рогівкової строми.