МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ ТА АДАПТАЦІЙНО-КОМПЕНСАТОРНІ РЕАКЦІЇ В ОРГАНІЗМІ СОБАК ЗА ДИРОФІЛЯРІОЗУ

summary

З метою виявлення наявності мікрофілярій у крові тварин були використані собаки різного віку, статі та породи, спонтанно інвазовані  дирофіляріями. Крім того, нами було обстежено 21 собака породи кавказька і німецька вівчарки віком 1,5-4 роки, що знаходилися в розпліднику військової частини №3001 МВС України в м. Києві та  71 собака із притулку для бродячих тварин в м. Бородянці Київської області.

Для проведення гематологічних та імунологічних досліджень було сформовано 3 групи собак: І – низький ступінь мікрофіляремії (1-50 мікрофілярій в 1 мл крові); ІІ – високий ступінь мікрофіляремії (більше 100 мікрофілярій в 1 мл крові); ІІІ – контроль (амікрофіляремія).

За симптоматичною характеристикою підібрано 4 групи тварин: інтоксикаційна форма (36); шкірна форма (49); форма псевдопухлинних розростань (17); форма гепато-кардіо-ренальної недостатності (18).

Всі дослідні тварини перед дослідженнями були імунізовані полівалентними вакцинами проти чуми м’ясоїдних, інфекційного гепатиту,  аденовірусної інфекції, парагрипу м’ясоїдних, парвовірусного ентериту собак, лептоспірозу і сказу, а також дегельмінтизовані комплексними препаратами широкого спектру дії. Ефективність дегельмінтизації перевіряли за 3 дні до початку досліджень шляхом копроскопії.

Кров для дослідження на дирофіляріоз відбирали з підшкірної вени передпліччя у одноразові шприци з антикоагулянтами (гепарин або цитрат натрію) вранці або ввечері, під час найвищої активності мікрофілярій в периферичному судинному руслі. Для збільшення ймовірності виявлення мікрофіляремії у собак проводили повторне двократне   дослідження крові з інтервалом 7 діб. Виготовлені мазки крові забарвлювали за Папенгеймом.

Мікрофіляремію визначали різними способами: за методом Кнотта в модифікації I. Lindsey, I. Russel, 1965 (цитовано за Котельниковим Г. А., 1984), у препараті “товста крапля” (цитовано за Котельниковим Г.А., 1984), у сироватці крові (цитовано за Поживілом А.І., Горжеєвим В.М.,1999), за методикою кількісного підрахунку мікрофілярій у лічильній камері за Denham та ін. (цитовано за ВОЗ, 1975).

Видову належність мікродирофілярій визначали за активністю кислої фосфатази за Goldberg A.F., Barka T. (1962). За цим методом вдавалось ідентифікувати мікродирофілярій на видовому рівні: D. immitis – по забарвленню анальної та екскреторної пори; D. drancunculoides – анальної пори та основного тіла; D. repens – по забарвленню тільки анальної пори; D. reconditum – по дифузному забарвленню основного тіла (Ortega-Mora L., Gomez-Bautista M., Rojo-Vazquez F., 1989; Schrey C.F., Trautvetter E., 1998).

З метою встановлення наявності мікрофілярій та гістопатологічних змін тканин у собак з мікрофіляремією проводили цитологічне дослідження пунктатів (черевної порожнини, новоутворень) і мазків-відбитків з виразкових уражень шкіри і м’яких тканин, а також гістологічне дослідження тканин внутрішніх органів, пофарбованих гематоксиліном та еозином (Меркулов Г.А.,1961).

В одержаних пробах крові визначали: кількість еритроцитів та лейкоцитів шляхом підрахунку в камері Горяєва; вміст гемоглобіну - гемоглобін-ціанідним методом; у мазках, пофарбованих за Папенгеймом, проводили підрахунок лейкоцитів, виводили лейкограму; вміст білірубіну визначали методом Ієндрашика, Клеггорна і Грофа (1975); вміст сечовини і азоту сечовини - за кольоровою реакцією з диацетилмонооксимом; креатинін - за кольоровою реакцією Яффе (метод Поппера) (1978); аланінамінотрансферазу (АлАТ), аспартатамінотрансферазу (АсАТ) - колориметричним динітрофенілгідразиновим методом (за Райтманом-Френкелем, 1957); загальний білок -  за біуретовою реакцією (за методом Кінгслея–Вейксельбаума); глюкозу - в реакції з ортотолуїдином; вміст калію і натрію - методом полум’яної фотометрії (фотометр “ПАЖ”, Україна); кількість Т-лімфоцитів – у тесті спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РУК); кількість В-лімфоцитів – у тесті спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана (ЕАК-РУК); кількість теофілінрезистентних Т-лімфоцитів (Т-хелперів), кількість теофілінчутливих Т-лімфоцитів (Т-супресорів) та кількість Т-активних лімфоцитів – у тесті спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана; фагоцитарну активність (ФА, %) та фагоцитарний індекс (Фİ, мікробних клітин) – за методикою Чумаченка В.Ю., (1975), тест-культура Staphylococcus aureus, штам 209-Р; кількість циркулюючих імунних комплексів (ЦİК) в крові – спектрофотометричним методом з поліетіленгліколем – 6000 (Гриневич Ю. А., Алферов А. Н., 1981).

Для корекції патологічних змін в організмі собак за дирофіляріозу було проведено дві серії дослідів: у першій серії використали піддослідних собак, яких сформували в групи на основі симптоматичної класифікації дирофіляріозу; їм призначали мікрофілярицидну, патогенетичну і симптоматичну терапію; у другій серії дослідів була сформована група собак із симптомами враження шкіри; в цій групі застосували макрофілярицидну, мікрофілярицидну і патогенетичну терапію.

Собакам порівняльної групи призначали загальноприйняту мікрофілярицидну, макрофілярицидну і патогенетичну терапію, а собакам дослідної групи – додатково призначали симптоматичну терапію із застосуванням комплексних гомеопатичних препаратів фірми “Heеl” (Гамальчик П., 1997).

З мікрофілярицидною метою застосовували івомек (Ivomec, Merial) – мікрофілярицид, діюча речовина івермектин, який одержують шляхом ферментації гриба Streptomyces avermitylis. Як макрофілярицид використовували Potassium arsenite, представлений для досліджень доктором W. Tarello (Італія). Для патогенетичної терапії застосовували фраксіпарін (попереджує тромбоутворення під час масової загибелі мікрофілярій) та розчин Рінгер-Лока (з метою дезінтоксикації).

Контроль за мікрофіляремією здійснювали за методом Кнотта та методикою кількісного визначення мікрофілярій у лічильній камері по Denham та ін. (1971) до початку лікування, а потім на десяту, двадцяту і тридцять п’яту добу від початку лікування.

Проби крові для гематологічних досліджень при проведенні обох серій дослідів відбирали до початку лікування, а потім на десяту і тридцять п’яту добу від початку лікування. У крові визначали: кількість еритроцитів та лейкоцитів шляхом підрахунку їх в камері Горяєва; вміст гемоглобіну - гемоглобін-ціанідним методом.

Наявність залишкової кількості ДНК паразита в організмі собаки визначали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (Favia G., Lanfrancotti A., Della Torre A., 1996; Favia G., Lanfrancotti A., Della Torre A., et al., 1997; Favia G., Cancrini G., Ricci I., et al., 2000). Олігонуклеотидні праймери Rep1 і Rep2 синтезували на приладі “Gene Assembler” (“Pharmacia”, Швеція) фосфоамідним методом у відповідності з відомими нуклеотидними послідовностями (Favia G., Lanfrancotti A., Della Torre A., 1996; Favia G., Lanfrancotti A., Della Torre A., et al., 1997; Favia G., Cancrini G., Ricci I., Bazzocchi C., et al., 2000).

Для експериментального зараження мікрофіляріями D. repens використовували комарів трьох видів: Culex pipiens mоlestus F.,  Anopheles maculipennis atroparvus Mg. і Aedes aegypti L.. В експерименті використовували гоноактивних самок комарів, яких вирощували й утримували в лабораторних умовах і які не були заражені багатоклітинними паразитами.

Для експериментального зараження комарів використано собак із притулку для бездомних тварин у Київській області, з попереднім діагнозом дирофіляріоз (собака №1 з мікрофіляремією – 2400 мікрофілярій в 1 мл крові і собака №2 з мікрофіляремією 6300 мікрофілярій в 1 мл крові).

Контроль за розвитком личинок здійснювали періодичним розтином комарів усіх видів з підраховуванням кількості виявлених личинок D. repens та реєстрували їх локалізацію і зміну морфологічної будови.

Отриманий цифровий матеріал опрацьований статистично методом Монцевічюте-Ерінгене Е.В. (1964), з використанням ПК ІВМ-486 (програма Vetstat, О.В. Левчій, 1997).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Визначення видової приналежності дирофілярій та їх локалізації в організмі собаки. Для визначення видової приналежності дирофілярій проводили видоспецифічне фарбування виявлених мікрофілярій на кислу фосфатазу, а також морфологічне дослідження статевозрілих дирофілярій.

При цитохімічному дослідженні мікрофілярій, виявлених у мазках периферичної крові та в пунктатах уражень шкіри, встановлено, що в усіх випадках їх тіло має характерну яскраву пляму активності тартрат-резистентної кислої фосфатази в зоні анальної пори. Активність лужної фосфатази була відсутня, PAS-позитивні речовини не визначались.  Така цитохімічна характеристика є типовою для дирофілярій виду  D. repens (Schrey C.F., Trautvetter E., 1998). Статевозрілі дирофілярії виявляли набагато рідше, ніж мікрофілярії. Більшість із них знаходили під час оперативних втручань у собак (видалення пухлин, кастрація, герніотомія та ін.). Серед знайдених 23 екземплярів дирофілярій   виявилось 3 самці та 20 самок. За морфологічними ознаками виявлених дирофілярій віднесено до виду Dirofilaria repens.

Встановлено, що гельмінти локалізувались в основному у підшкірній клітковині і міжм’язових прошарках, активно рухались і вільно переміщувались по м’яких тканинах собаки. При патологоанатомічному розтині двох собак 70% виявлених статевозрілих дирофілярій локалізувалась у підшкірній клітковині в ділянці ліктьового і колінного суглобів.

Необхідно відмітити, що вперше в світі нами виявлені в Україні статевозрілі D. repens, які локалізувались у мошонці і в сім’яному канатику кота. Цей випадок слід враховувати при вивченні поширення дирофіляріозу в Україні.

Результати виявлення мікродирофілярій у собак. Мікрофіляремія є найбільш часто діагностованою ознакою дирофіряріозу собак. Розміри мікродирофілярій становлять: довжина 337 ± 31 мк, ширина 7 ±0,16 мк (n = 24).

Серед використаних методів діагностики мікрофіляремії найбільш простим, доступним і швидким є метод прямої мікроскопії краплі нативної крові. Метод дослідження сироватки крові також не потребує додаткових пристроїв, але  у зв’язку із повільним виходом мікрофілярій із кров’яного згустку, необхідно більше часу. Модифікований метод Кнотта найбільш чутливий, оскільки дозволяє концентрувати мікрофілярії, підвищуючи точність діагностики, проте потребує наявності в лабораторії центрифуги.

Для визначення інтенсивності інвазії (İİ) собак мікрофіляріями проводили підрахунок личинок у крові за допомогою лічильної камери. Ступінь мікрофіляремії оцінювали за кількістю мікрофілярій у 1 мл нативної крові (мф/мл): наявність мікрофілярій від 1 до 50 екземплярів в 1 мл крові визначали як низький ступінь мікрофіляремії; 50-100 мф/мл – середній ступінь; більше 100 мф/мл - високий ступінь.

Серед 157 собак, спонтанно інвазованих дирофіляріями, було виявлено 50,3% з низьким ступенем мікрофіляремії, 38,9% тварин з середнім ступенем мікрофіляремії та 10,8% – з високим ступенем мікрофіляремії.

Слід відмітити, що İİ мікрофіляріями залежить від віку собак. Так, вища İİ реєструвалась переважно в собак віком 6,5±2,4 роки. Очевидно, щорічна реінвазія собак мікрофіляріями сприяла зростанню İİ за рахунок статевозрілих дирофілярій, і, відповідно, в послідуючі роки в крові реєстрували більшу кількість личинок.

Для визначення екстенсивності інвазії (Еİ) дирофіляріозу серед бездомних собак м. Києва було досліджено 71 собаку з притулку для бродячих тварин у м. Бородянці Київської області. У 21 тварини (30%) реєстрували мікрофіляремію. За даними Печерської районної в м. Києві державної лікарні ветеринарної медицини Еİ дирофіляріозу серед домашніх собак протягом 2000-2002 років становила 22%.

Особливості перебігу інвазії Dirofilaria repens у собак. За період дослідження з 2000 по 2002 роки було обстежено на дирофіляріоз 2657 собак, у 540 (20,3%) з них виявлена мікрофіляремія (табл.1).

Слід відмітити, що серед інвазованих D. repens собак у 84 (15,6%) тварин не відмічено ніяких клінічних ознак захворювання, лише за допомогою мікроскопічних досліджень периферичної крові вдавалося виявити мікрофіляремію.

На основі власних спостережень ми виділили 4 основні форми дирофіляріозу, який спостерігався у спонтанно інвазованих D. repens собак Київського регіону: інтоксикаційна, шкірна, форма псевдопухлинних розростань та форма  кардіо-гепато-ренальної недостатності.

Інтоксикаційну форму відмічали в 36 тварин. Захворювання характеризувалось неспецифічними або стертими клінічними ознаками. Тварини швидко втомлюються, у них знижується, а іноді і спотворюється апетит, спостерігається загальне виснаження і апатія, кашель, утруднене дихання,  іноді підвищення температури тіла до 40°С, відмічаються симптоми порушення нервової системи (тремтіння кінцівок, парези, паралічі).