ПЕЧІНКОВА ФОРМА ЕЙМЕРІОЗУ КРОЛІВ (біологія збудника, патогенез, заходи боротьби)

summary

Вибір напрямків досліджень, матеріали та методи виконання роботи

Клініко-експериментальні дослідження проводились на базі кафедри паразитології, а також хірургії та акушерства  Полтавської державної аграрної академії і в господарствах Полтавської області. Гістологічні зрізи виготовляли на кафедрі гістології, цитології та ембріології Української медичної стоматологічної академії. Біохімічні показники сироватки крові визначалися в умовах лабораторії 4-ї міської лікарні м. Полтави.

Чисту культуру збудника отримували з печінки хронічно хворих на еймеріоз кролів методом послідовних промивань. Розміри ооцист визначали за допомогою окуляр-мікрометра МОВ-1-15^х. Культивування ооцист проводили у чашках Петрі, у термостаті при температурі 27^○С. Для пригнічення росту мікрофлори ооцисти щоденно зрошували 2%–м розчином калію біхромату. Процес споруляції контролювали мікроскопічно.

Для детальнішого вивчення біології збудника і патогенезу захворювання внаслідок ураження кролів E. stiеdae та пошуку ефективних засобів боротьби, дану роботу умовно поділили на кілька етапів.

Перший етап був присвячений  вивченню біології збудника і проводився у 3 підетапи.

На першому було проведено експериментальне зараження тварин. Для вивчення морфології ендогенних форм E. stiеdae та визначення патогенного впливу паразита на тканини макроорганізму проводили евтаназію тварин і гістологічні дослідження на 3, 6, 10, 16–17 добу експерименту. Гістологічні зрізи отримували на ультрамікротомі УМПТ-7 за методикою В.Я. Карупу (1984). Для забарвлення використовували розчин толуїдинового синього за методикою J.A.Lynn (1965).

Ультратонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі УМТП-4, монтували їх на сітки і контрастували цитратом свинцю й уранілацетатом за Reinolds. Вивчали їх в електронному мікроскопі МБР-100 з прискорюючою напругою 75 кВт.

На другому підетапі вивчали шляхи міграції збудника в організмі кролів. Були сформовані дві групи по три тварини півторамісячного віку в кожній. Кроленятам першої групи проводили оперативне втручання з метою перев’язування жовчної протоки; друга група слугувала контролем.

Після оперативного втручання, кроленят обох піддослідних груп перорально інвазували чистою культурою ооцист E. stiedae. У період загибелі тварин першої групи для одночасного дослідження проводили евтаназію кролів другої. Були вивчені патолого-анатомічні зміни та мазки-відбитки, зроблені з печінок піддослідних тварин.

На третьому підетапі було проведено експериментальне інвазування п’яти кроленят ооцистами E. stiedae. Локалізацію збудника визначали на 2, 3, 6, 10 та 16-ту добу експерименту шляхом дослідження мазків-відбитків із таких органів: печінки, селезінки, легень, головного та спинного мозку, шлунка, кишківника, серця, а також великих судин, жовчних протоків і соматичної мускулатури.

На другому етапі досліду вивчали клінічний стан за експериментального зараження тварин чистою культурою збудника (у дозах 20000, 10000, 6000, 4000 ооцист). Після інвазування щоденно проводили термометрію та огляд слизових оболонок; спостерігали за поведінкою кролів. Макроскопічні зміни фіксували при патолого-анатомічних розтинах трупів, які проводили методом евісцерації на 3, 6, 10, 16-17-ту добу після інвазування тварин. На 3, 6, 10-ту добу гістологічно досліджували кишківник, печінку і жовчовивідні шляхи. На 16-17-ту добу, в період виражених клінічних ознак і загибелі тварин, окрім вищевказаних структур досліджували шлунок, нирки, селезінку та міокард. Печінку та жовчовивідні шляхи піддавали ультрамікроскопічним дослідженням.

На третьому етапі досліджували біохімічні зміни сироватки крові на 3, 6, 10, 16-ту добу після експериментального інвазування (доза – 4000 ооцист). У клінічно здорових тварин відбір проб крові здійснювали двічі – на 3 та 16-ту добу експерименту. Матеріалом для біохімічних досліджень була сироватка крові, яку отримували з камер серця.

У сироватці крові визначали: вміст загального білка, альбуміну, білірубіну (загального, прямого, непрямого), активність ферментів АлАТ, ЛДГ, АсАТ, лужної фосфатази, ГГТП, вміст креатиніну, сечовини, глюкози, холестерину, тригліцеридів, а також неорганічного фосфору та загального кальцію. Дані показники визначали за допомогою біохімічного аналізатора Super Z.

Четвертий етап досліджень був спрямований на вивчення епізоотології захворювання в Полтавській області. Спочатку вивчали сезонність і вікову динаміку еймеріозу кролів у приватних господарствах Полтавського, Хорольського і Глобинського районів. Протягом року проби фекалій відбирали у трьох вікових групах: 1–2, 2–6 та 6–24 місяців. Зважаючи на те, що клінічні ознаки хвороби і найвища екстенсивність та інтенсивність інвазії була зареєстрована у віковій групі 2–6 місяців у травні–червні, то в подальшому вивчалося розповсюдження еймеріозу в інших районах Полтавської області (Решетилівському, Зіньківському, Диканському, Котелевському, Гадяцькому) у зазначений період у цієї вікової групи кроленят. Інтенсивність інвазії визначали в індивідуальних пробах.

Для вивчення поширення збудника печінкової форми еймеріозу були досліджені печінки клінічно здорових дорослих кролів (зовнішній вигляд, мазки-відбитки).

На п’ятому етапі було визначено дію бровадезу-20 та бровадезу-плюс на ооцисти еймерій.

У першій серії експерименту вивчали дію засобів дезинфекції на неспорульвані ооцисти E. stiedae, які отримували методом послідовних промивань із печінки загиблих кролів, хронічно хворих на  еймеріоз.

Дезінвазійну активність бровадезу-20 та бровадезу-плюс визначали в концентраціях 1, 2, 3, 6, 10 % шляхом зрошення ними ооцист. Розчини відповідних концентрацій готували згідно з рекомендаціями виробника. Для контролю в інших пробірках знаходилася суспензія ооцист, які не контактували з дезінфектантами.

У другій серії дослідів вивчали дію даних препаратів на змішану культуру ооцист еймерій, що виділялися з фекаліями хронічно хворих кролів. Ооцисти зрошувалися 1, 2, 3, 6 та 10 %-ми водними розчинами дезінфектантів, а в контролі – звичайною водою. Дезінвазійну дію препаратів визначали на 2, 3 і 5-ту добу після обробки.

На шостому етапі вивчали лікувальні властивості препаратів бровасептол, ампролінвет та байкокс 2,5 % за спонтанного еймеріозу кролів. Для цього було сформовано чотири групи піддослідних тварин, по 10 голів у кожній. Тварини всіх груп були спонтанно інвазовані еймеріями. Інтенсивність інвазії становила, в середньому, 1769 паразитів у 20 полях зору.

Для визначення екстенсивності інвазії після застосування лікувальних препаратів проби фекалій відбирали індивідуально, а інтенсивності –груповим методом від кожної групи тварин і досліджували за методом Котельнікова-Хренова.

Тваринам першої групи застосовували бровасептол. Препарат задавали з комбікормом протягом трьох днів поспіль у дозі 1 г на 10 кг маси тіла. Тваринам другої піддослідної групи випоювали ампролінвет у дозі 0,3 мл/кг маси тіла впродовж двох діб. Тваринам третьої піддослідної групи випоювали байкокс 2,5 % у дозі 0,3 мл/кг маси тіла впродовж двох діб.

Отриманий цифровий матеріал обробляли статистично за допомогою комп’ютерної програми Miсrosoft Excel.

Уся експериментальна частина була проведена з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції „Про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей” (Страсбург, 1986), норм біомедичної етики та відповідних законів України.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Біологія E. stiedae

Екзогенний розвиток еймерій. Виділені з печінки хворих кролів   ооцисти були світло-коричневого кольору та мали розміри
33,72±5,35 × 21,29±1,35 мкм. У нативному мазку вони розташовувалися суцільним шаром. Процес розвитку продовжувався до дев’ятої доби. На цей час спорулювало близько 85,0 % ооцист. Ооцисти, в яких зародковий матеріал дифузно розподілявся під оболонкою клітини, або розташовувався ексцентрично, в процес дозрівання не вступали.

Отже, згідно з результатами наших досліджень, лише 1,0 % виділених із печінки ооцист E. stiеdae мали виражене мікропіле, а при забезпеченні оптимальних параметрів у навколишньому середовищі їх екзогенний розвиток продовжувався до дев’ятої доби.

Ендогенний розвиток. На третю добу після інвазування збудник виявляли в тканинах кишківника, на шосту добу трофозоїтів E. stiedae ідентифікували в тканині печінки. На десяту добу збудник на стадії мерогонії та ендодіогенії локалізувався в епітеліальних клітинах жовчних шляхів.

При електронномікроскопічному дослідженні клітин печінки і жовчовивідних шляхів на 16-ту добу експерименту визначали такі форми паразита: трофозоїти, меронти І, ІІ та ІІІ генерацій, мікро- та макрогаметоцити.

Трофозоїти локалізувалися у цитоплазмі епітеліоцитів жовчних проток. Вони мали овальну форму, темну цитоплазму й досить виражене ядро. Паразит знаходився всередині паразитофорної вакуолі, що мала вигляд електронносвітлого обідка різної товщини. Меронти І генерації були схожими на трофозоїти, але мали більші розміри та сегментовані ядра.

За морфологічними ознаками меронти ІІ та ІІІ генерацій суттєво відрізнялися: перші були неправильної форми, мали велику паразитофорну вакуоль, локалізувалися в епітеліоцитах жовчних проток.