Сокол Анатолій Анатолійович Біотехнологічні основи отримання біоімпланту для використання у кардіохірургії

summary

У вступі викладено загальну характеристику роботи, обґрунтовано актуальність теми дисертації, описано зв’язок роботи з науковими програмами і темами, сформульовано мету і основні задачі дослідження, визначено особистий внесок здобувача, наукову новизну та практичне значення роботи, представлено дані апробації та публікації результатів і структуру дисертації.
Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
У цьому розділі представлено аналітичний огляд наукової літератури щодо технологій отримання тканинних імплантів й актуальності їх застосування в кардіохірургії. Здійснено опис біотехнологічних схем створення біоімпланту.
Проаналізовано особливості використання перикарда ВРХ, переваги та недоліки його технологічної обробки децелюляризуючими розчинами. Визначено актуальність пошуку нових способів біотехнологічної трансформації при створенні біоімплантів для застосування в регенеративній медицині.
Розділ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
У розділі представлено загальну характеристику об’єктів, методів і матеріалів досліджень. Матеріалом для дослідження слугував перикард ВРХ. Перикардіальну сумку вилучали у безпорідних 12-18-місячних биків протягом 20 хв після забою на підприємстві ТОВ «Антонівський м’ясокомбінат». Усі тварини пройшли ветеринарний огляд і мали ветеринарний сертифікат. У процесі вилучення органа дотримувалися правил асептики з максимально доступною атравматичністю і врахуванням анатомічних особливостей тварин, а також відповідно до основних положень біоетики та біоетичної експертизи, які узгоджуються з положеннями Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, Франція, 1986) та згідно із Законом України № 3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження» (2006, остання редакція 2009).
Процес децелюляризації проводили на клаптях перикарда розміром 40*40 мм.
Метод крос-лінкінгу реалізувався за допомогою обробки зразків розчином EDC/NHS (10 mM 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл) карбодиімід, 10 mM гідроксисукцинімід-2) та MES-розчином, pH 5,6 (0,05 M етансульфонова кислота) протягом 12 год за температури 24 °С, 50 об/хв.
Значення міцності тканини на розрив вимірювали за допомогою універсальної деформаційної машини для проведення механічних випробувань «IMADA» (MX2-110, Японія). Швидкість деформації V становила 60 мм/хв, максимальне навантаження F - 4,0 кг. Максимальну силу розтягнення (Fmax) визначали до моменту порушення цілісності матриксу.
Морфологічний аналіз тканини перикарда ВРХ проводили після процесу децелюляризації. Мікропрепарати забарвлювали гематоксиліном та еозином, Конго, триколором за Масоном [Коржевський Д.Е. й ін., 2010; Ліллі Р., 1960]. Комплекс світлооптичних досліджень забарвлених мікропрепаратів проводили на мікроскопах «Olympus BX51» та «Olympus BX40» (Японія), мікрофотографування - камерою «Olympus DP 12» (Японія), обробляли мікрофотографії за допомогою програми «Olympus DP-SOFT Version 3.2». Парафінові зрізи товщиною 5 мкм фарбували за методикою DAPI, дотримуючись стандартних протоколів фіксації, дегідратації, заливки, депарафінізації, регідратації та фарбування люмінесцентним барвником 4',6-діамідино-2-феніліндолом.
Кількісне визначення концентрації нуклеїнових кислот (нг/мг) у сухому залишку тканини проводили за допомогою стандартного набору для екстракції ДНК «DNA Easy Blood and Tissue kit» (Qiagen, Німеччина), попередньо обробивши її протеїназою К. Вимірювання флуоресценції проводили за кімнатної температури, використовуючи спектрофлуориметр Qubit 3.0. Межа виявлення ДНК становила 0,2 нг/мг нуклеїнової кислоти.
Для визначення цитотоксичності проводили культивування зразків децелюляризованого позаклітинного матриксу в суспензії фібробластів людини. Культивування проводили протягом 2-х місяців за стандартних умов - t = 37 °С та 5 % CO2 - використовуючи CO2-Incubator INCO 2 108.
Для оцінки біосумісності проводили імплантацію зразків децелюляризованого позаклітинного матриксу експериментальним тваринам підшкірно в ділянку міжлопаткового простору за методом Fishbein M. et al. (1982). Експеримент проводили на 4-5-місячних самцях щурів лінії Вістар (п = 15) масою 190-230 г. З поверхні шкіри щурів у зоні операційного поля видаляли шерсть і обробляли 70 %-ним розчином етилового спирту. Операцію проводили в стерильних умовах під внутрішньом’язовим наркозом із використанням ксилазину (Alfasan, Нідерланди) в дозі 1 мг/кг маси тіла в комбінації з кетаміном (Біолік, Україна) в дозі 10 мг/кг. У просвіт кишені поміщали підготовлені імпланти розміром 1x1 см, які фіксували по кутах до м’язової тканини вузловими швами «Polypropylene» (Golnit, Україна). Розріз шкіри зашивали обвивним безперервним швом, ниткою, яка не розшаровувалася, обробляли антисептиком - 1 %-ним розчином брильянтового зеленого. Після завершення хірургічної маніпуляції всі тварини зберігали фізичну активність. Проводили щоденне спостереження за загальним станом тварин після операції, а також за станом післяопераційного шва, яке не показало реакцій запалення, гнійних ускладнень або інших відповідей організму на імплантовані матеріали.
У встановлений термін після імплантації зразків (через 3 місяці) дослідних і контрольних тварин виводили з експерименту декапітацією під ефірним наркозом. Комплекс тканин лопаткової ділянки щурів (разом з імплантованою структурою) вилучали та досліджували мікроскопічно.
Аналіз результатів дослідження проводився із використанням методів біостатистики [Петрі А., 2003; Гур’янов В.Г., 2018]. Для кількісних показників проводився аналіз розподілу на нормальність із використанням критерію Шапіро- Уілка, розраховувалися їх середнє значення (М) та стандартне відхилення (±SD). Для оцінки середнього значення розраховувався його 95 %-ний довірчий інтервал (95 % ДІ). Для якісних показників розраховувалася частота (%) та, в разі необхідності, 95 % ДІ. При проведенні порівняння кількісних ознак у більше ніж двох груп використано однофакторний дисперсійний аналіз [Гур’янов В.Г., 2018], постеріорні порівняння проводилися з використанням критерію Шеффе (закон розподілу не відрізнявся від нормального). Для порівняння якісних ознак використовувався критерій хі-квадрат, постеріорні порівняння для більше ніж двох груп проводилися з урахуванням поправки Бонферроні [Гур’янов В.Г., 2018]. При проведенні аналізу використані критерії з двосторонньою критичною областю, критичний рівень значимості покладався за 0,05. Статистичний аналіз результатів дослідження проводився в статистичному пакеті EZR v. 1.54 (Saitama Medical Center, Jichi Medical University, Saitama, Japan, 2020), що представляє графічний інтерфейс до R (The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria).
Розділ 3. РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ВИГОТОВЛЕННЯ БІОІМПЛАНТУ
Розробка протоколів отримання децелюляризованого позаклітинного матриксу перикарда ВРХ. Для створення біоімпланту з перикарда ВРХ з наукових джерел було відібрано найпоширеніші методи децелюляризації. Технологія виготовлення децелюляризованого позаклітинного матриксу (ДПМ) складалася з таких етапів: осмотичний шок, децелюляризація, детоксикація, стабілізація та фіксація, відмивання. Описані в літературі [Simoes I.N., 2017; Williams K.J., 2015; White L.J., 2017; Ramm R., 2019; Naso F. et al., 2004; Simsa R., 2017] протоколи не забезпечували відтворюваних результатів і призводили до неприпустимої деградації структури перикарда ВРХ, тому постала задача синтезу оригінальних модифікацій протоколу виготовлення біоімпланту. Таким чином, ми створили оптимальні умови для всіх технологій і внесли такі модифікації (рис. 1):
• осмотичний шок - тривалість до 3-х днів;
• децелюляризація - підбір оптимальних концентрацій детергентів, тривалості та температурного режиму процесу;
• детоксикація;
• стабілізація та фіксація;
• крос-лінкінг - стабілізація ДПМ методом зшивання NHS/EDC - MES (10 mM 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл) карбодиімід, 10 mM гідроксисукцинімід-2, 0,05 M етансульфонова кислота), що забезпечує підтримання архітектоніки та біомеханічних властивостей децелюляризованого перикарда ВРХ;
• відмивання.
Отже, для подальших експериментальних досліджень було сформовано 5 модифікованих технологій (рис. 1).
Характеристика біомеханічних властивостей децелюляризованого матриксу. При дослідженні біомеханічних властивостей децелюляризованого матриксу спостерігали найнижчий рівень міцності (Fmax) у зразках Технології 3 (1,33 ± 0,75 кгс), що в 5 разів нижче (р < 0,01), ніж показники нативного перикарда (6,84 ± 0,70 кгс) у продольному напрямку, та майже в 4 рази нижче у поперечному (0,88 ± 0,19 кгс) порівняно з контролем (3,78 ± 0,36 кгс) (рис. 2). Порушення архітектоніки колагенових та еластинових волокон унаслідок дії детергенту SDS у досить високій концентрації за кімнатної температури відносно тканин перикарда може бути причиною таких низьких результатів біомеханічних тестів. Усі інші використовувані підходи для децелюляризації забезпечили більш відповідні біомеханічні властивості. Значення міцності тканини на розрив у зразках Технологій 1 і 2 були приблизно однаковими, але відповідно в 1,5 та 1,8 разу нижче, ніж у контролі (р < 0,05). Крім того, маємо відзначити, що зразок Технології 5 показав найвищий рівень Fmax (9,55 ± 0,66 кгс, р < 0,05), що може бути пов’язано з менш тривалим впливом децелюляризованих розчинів. Значення максимальної міцності на розрив у зразках Технології 5 були в 1,5 разу вищими, ніж у контрольній групі. На думку автора, зменшення концентрації SDS і проведення крос-лінкінгу для децелюляризованих тканин визначає міцність отриманого скафолду