Сюмка Внутрішньовидова мінливість Cercospora Beticola Sacc. Та вдосконалення методів оцінки стійкості цукрових буряків до церкоспорозу

summary

Огляд літератури

В огляді літератури проаналізовано та узагальнено інформацію про збудника церкоспорозу буряків – гриб Cercospora beticola, а саме: описано ознаки хвороби та її шкідливість, встановлено молекулярно-біохімічні особливості патогенезу C. beticola та причини низької стійкості цукрових буряків до хвороби. Висвітлено історію пошуку стійких до C. beticola форм цукрових буряків та дано оцінку методам визначення стійкості буряків до церкоспорозу. Наведено інформацію щодо існуючих методів визначення внутрішньовидової мінливості C. beticola.

Методи та умови проведення досліджень

Дослідження проводили протягом 2001-2007 рр. у лабораторії вірусних хвороб та імунітету Інституту цукрових буряків Української академії аграрних наук, Верхняцькій дослідно-селекційній станції ІЦБ та с. Крупець Рівненської області.

Матеріалами досліджень були 32 ізоляти C. beticola, які було відібрано при маршрутних обстеженнях фабричних посівів цукрових буряків у 2001-2006 рр. з різних грунтово-кліматичних зон України та Росії.

Культуральні та морфометричні показники ізолятів на агаризованих живильних середовищах визначали згідно з описаними методиками (Билай, 1982, Jenns, 1989, Almeida, 2005).

Вміст церкоспорину в культурі ізолятів C. beticola визначали спектрофотометричним методом за Jenns et al. (Jenns, 1989) із внесеними нами модифікаціями (Сюмка та ін., 2007). Оптичну густину екстрактів вимірювали на планшетному спектрофотометрі Sumal PE-2 C. Zeiss при довжині хвилі 480 нм.

Рівень пероксидного окислення ліпідів в культурі ізолятів визначали методом хемілюмінесценції (Владимиров, 1972). Рівень Н₂О₂-ініційованої хемілюмінесценції визначали з застосуванням хемілюмінометра ХЛМ1Ц-01 (Росія) із фотоелектропомножувачем ФЕП 130.

Для визначення молекулярно-генетичного поліморфізму ізолятів C. beticola проводили полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), а саме – RAPD-ПЛР з декануклеотидними праймерами виробництва Syntol. Виділення ДНК ізолятів C. beticola проводили згідно з Almeida et al. (Almeida, 2005). Умови ампліфікації: початкова денатурація – при 94 °С, протягом 3,5 хвилин; 33 цикли, що включають такі кроки: денатурація – 94 °С, протягом 1 хвилини; відпал праймеру – 53 °С, протягом 1,5 хвилин; подовження ланцюгів – 72°С, протягом 2 хвилин; заключний синтез ланцюгів – 72 °С, 7 хвилин. Продукти ПЛР розділяли у 2% агарозному гелі в 1.0^Х TBE, гель фарбували бромідом етидію. Електрофорез проводили в умовах постійної напруги 2 В/см² гелю протягом 2,5 годин. Після закінчення електрофорезу гель аналізували на трансілюмінаторі, який випромінює хвилі в ультрафіолетовому діапазоні (254-310 нм). На основі отриманого електрофоретичного розподілу ампліконів розрахували генетичні дистанції та побудували дендрограму, що відображає генетичну спорідненість досліджуваних об’єктів (Сиволап, 1984).

Повторність польових досліджень чотирикратна. Розмір ділянок складав 13,5 м² та 33,75 м². Розташування ділянок відбувалось шляхом рендомізації. В процесі вирощування дослідних посівів цукрових буряків використовували загальноприйняті технології для кожної окремої зони (Доспехов, 1979).

Створення інфекційного фону збудника церкоспорозу проводили шляхом штучної інокуляції рослин цукрових буряків ізолятами гриба за власною методикою (Сюмка, 2005). В польовому досліді було використано чотири ізоляти C. beticola з двох регіонів України. Оцінку ступеня ураження рослин проводили з використанням шкали з інтервалами від 1 до 9 балів (Буренин, 1989).

З метою визначення специфічності дослідних ізолятів C. beticola по відношенню до фунгіцидів, проводили обробку штучно заражених рослин фунгіцидами альто супер, 40% с.п. (ципроконазол) та фундазол, 50% с.п. (беноміл).

Визначення вмісту цукру проводили як в індивідуальних коренеплодах, так і у середніх зразках. Одночасно в зразках встановлювали вміст натрію та калію. Визначення цукристості та вмісту Na і K в коренеплодах проводили на автоматизованій лінії “ВЕНЕМА”.

Статистичний аналіз експериментальних даних обробляли за допомогою прикладного пакету Statistica 6.0.

Культуральні особливості ізолятів

Cercospora beticola

Виділення та ідентифікація ізолятів C. beticola. На етапі ідентифікації культур було виявлено істотні недоліки в загальних методиках із визначення гриба C. beticola. Так, на звичайних живильних середовищах C. beticola не утворює конідій, які є необхідною умовою для систематичного визначення, а для процесу спороутворення, переважно, потребує середовища на основі екстракту бурякового листя. Проте, як було встановлено, навіть в результаті отримання спорового матеріалу ізолятів гриба виникає складність із його ідентифікацією – конідії церкоспори, по-перше, характеризуються значною морфологічною мінливістю навіть в межах культури одного ізоляту, по-друге, виявляють широкі розбіжності в порівнянні з описаною для виду C. beticola морфологією. Крім того, під час ідентифікації культур виділених ізолятів методом світлової мікроскопії, було виявлено міцелій та споровий матеріал гриба роду Drechslera. Ні культуральними ознаками, ні забарвленням колонії дана культура не відрізнялась від ряду ізолятів C. beticola. Виявлення в тканинах листя цукрових буряків представника роду Drechslera може мати наступне пояснення. Або гриб Drechslera sp. через “ворота інфекції” зайняв в якості суперпаразиту тканини листя буряку, які були ослаблені попереднім ураженням C. beticola, або представникам Drechslera sp. притаманні ще недосліджені патогенні властивості.