Любич Лариса Дмитрівна Імунобіологічні властивості нейрогенних клітин фетального мозку

brief description

Любич Лариса Дмитрівна, старший науковий співро­бітник відділу нейроімунології ДУ «Інститут нейрохірургії імені академіка А. П. Ромоданова НАМН України»: «Імунобіологічні властивості нейрогенних клітин фетального мозку» (03.00.09 - імунологія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шев­ченка

Державна установа «Інститут нейрохірургії ім.акад. А.П.Ромоданова Національної
академії медичних наук України»
Національна академія медичних наук України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
ЛЮБИЧ ЛАРИСА ДМИТРІВНА
УДК 611-013.7/.8-018.8:612.017.1:57
ДИСЕРТАЦІЯ
ІМУНОБІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО
МОЗКУ

03.00.09 – імунологія
(шифр і назва спеціальності)
Подається на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей, результатів
і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
___________________________Л.Д. Любич
(підпис, ініціали та прізвище здобувача)
Науковий консультант Лісяний Микола Іванович, д.мед.н., професор, Заслужений
діяч науки і техніки України, член-кореспондент НАМН України
Київ - 2017

З М І С Т
ПЕРЕЛІК СКОРОЧЕНЬ, УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ І
ТЕРМІНІВ.....................................................................................................................................28
ВСТУП………………………………………………………………………………….30
РОЗДІЛ 1 СУЧАСНІ УЯВЛЕННЯ ЩОДО ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ
ВЛАСТИВОСТЕЙ НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ…….....40
1.1. НСК / НПК протягом пренатального розвитку…...……………………………...40
1.2. Експресія нейрогенними клітинами фетального мозку молекул з імунними
властивостями……………………………………………………………....……..44
1.2.1. Експресія антигенів системи гістосумісності НСК / НПК……………………..46
1.2.2. Експресія НСК / НПК поверхневих антигенів та костимуляторних
молекул……………………………………………………………………………57
1.2.3. Продукція НСК / НПК біологічно активних молекул……………..…………....59
1.3. Імунні реакції при сумісному культивуванні НСК / НПК та клітин імунної
системи in vitro……………………………………………………....…………….62
1.4. Еволюція уявлень щодо імунної відповіді в ЦНС та особливості розвитку
імунних реакцій при трансплантації клітин фетального мозку………………….67
1.5. Протипухлинна дія НСК / НПК………………………………………………....81
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ………………………………....89
2.1. Виділення і культивування клітин………..………………………………………..92
2.2. Отримання кондиційованого середовища нейрогенних клітин (КСНК) фетального
мозку і дослідження його властивостей in vitro та in vivo…………………...........94
2.3. Визначення експресії мРНК генів за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції
із зворотною транскрипцією……………………………………………………...98
2.4. Відтворення експериментальних моделей in vivo………………………………..100
2.4.1. Відтворення алоспецифічних і нейроспецифічних імунних реакцій за умов
внутрішньоочеревинного і внутрішньомозкового введення клітин………........100
2.4.2. Відтворення моделі гліоми головного мозку у щурів………………………….102
2.4.2.1. Дослідження впливу КСНК на пухлиноіндукувальну здатність клітин гліоми
101.8 у щурів………………………………………………………………….......102
24
2.4.2.2. Дослідження впливу КСНК та фетальних НПК на перебіг експериментально
змодельованої гліоми головного мозку щурів 101.8…………………………....103
2.4.2.3. Дослідження впливу алогенної вакцини, модифікованої КСНК, на перебіг
експериментально змодельованої гліоми головного мозку щурів 101.8…….....104
2.5. Імунологічні методи досліджень…………………………………………………105
2.5.1. Дослідження експресії антигенів на клітинах імунофлуоресцентним
методом…………………………………………………………………………..105
2.5.2. Дослідження вмісту цитокінів у супернатантах клітин………………………..105
2.5.3. Дослідження стану ефекторної ланки алоспецифічної імунної відповіді
експериментальних тварин-реципієнтів різних типів клітин……...……………106
2.5.3.1. Дослідження алоспецифічної цитотоксичної активності імуноцитів мишейреципієнтів…..…………………………………………………………………...106
2.5.3.2. Дослідження цитотоксичної активності алоспецифічних сироваток МТТколориметричним методом…………………….……………………..…………109
2.5.4. Дослідження цитотоксичної активності імуноцитів щурів з гліомою…...….....109
2.5.5. Визначення кількості антитіл до нейроспецифічних білків (НСБ) у сироватці
крові мишей-реципієнтів...…………...…………...……………………………...110
2.5.6. Імуноцитохімічне дослідження експресії специфічних маркерів……..…….....113
2.6. Морфологічні методи досліджень…….………………………………………..116
2.7. Статистичні методи досліджень….…………………………………………….119
РОЗДІЛ 3 ХАРАКТЕРИСТИКА БІОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ
НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ in vitro.……..…………..120
3.1. Вплив складу культурального середовища на нейрогенні клітини фетального
мозку при культивуванні………………………………...………………………120
3.2. Динаміка експресії віментину, GFAP, нестину та CD133 в процесі
культивування нейрогенних клітин фетального мозку………………………....123
3.3. Дослідження здатності нейрогенних клітин фетального мозку до
диференціювання in vitro………………………………………………………...127
3.4. Експресія TGF-1 нейрогенними клітинами фетального мозку…………...…136
25
РОЗДІЛ 4 ЕКСПРЕСІЯ АНТИГЕНІВ ГОЛОВНОГО КОМПЛЕКСУ
ГІСТОСУМІСНОСТІ НЕЙРОГЕННИМИ КЛІТИНАМИ ФЕТАЛЬНОГО
МОЗКУ…………………………………………………………………………..142
4.1. Експресія антигенів HLA нейроклітинами людини різного терміну гестації та
ступеня диференціації……………………………….…………………………..142
4.2. Експресія антигенів HLA нейроклітинами людини різного терміну гестації при
культивуванні in vitro……………………………………………………………149
4.3. Модуляція експресії антигенів HLA I та HLA II нейроклітинами фетального
мозку людини за умов впливу IFN- та IFN-………………………………......154
РОЗДІЛ 5 ІМУНОГЕННІСТЬ ФЕТАЛЬНИХ НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН ПРИ
ВВЕДЕННІ В ОРГАНІЗМ…………………………………………………...….158
5.1. Порівняльна характеристика імуногенності фетальних нейроклітин та клітинних
суспензій різних тканинних типів дорослого організму при
внутрішньоочеревинному введенні тваринам-реципієнтам……………………158
5.2. Порівняльна оцінка імуногенності фетальних нейроклітин та клітинних суспензій
різних тканинних типів дорослого організму при внутрішньомозковому введенні
тваринам-реципієнтам…………………………………………………………...168
5.3. Порівняльна оцінка інтенсивності імунної відповіді при внутрішньоочеревинному
і внутрішньомозковому введенні фетальних нейроклітин………..…………....176
5.4. Порівняльний аналіз розвитку нейроімунних реакцій до нейроспецифічних білків
при внутрішньомозковому введенні сингенних та алогенних фетальних
нейроклітин…………..…………………………………………………………..184
РОЗДІЛ 6 ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК ІМУННИХ РЕАКЦІЙ ТА СТРУКТУРНИХ ЗМІН
ГОЛОВНОГО МОЗКУ МИШЕЙ ПІСЛЯ ВНУТРІШНЬОМОЗКОВОГО
ВВЕДЕННЯ ФЕТАЛЬНИХ НЕЙРОКЛІТИН…….……………………..……..190
6.1. Структурні особливості змін тканини головного мозку мозку мишей-реципієнтів
у відповідь на внутрішньомозкове введення фетальних нейроклітин..……….190
6.1.1. Порівняльна оцінка морфологічних змін тканини мозку мишей-реципієнтів у
відповідь на внутрішньомозкове введення алогенних фетальних нейроклітин та
26
клітинних суспензій різних тканинних типів дорослого
організму………………………………..……………….………………………191
6.1.2. Порівняльна оцінка морфологічних змін тканини мозку мишей-реципієнтів у
відповідь на внутрішньомозкове введення алогенних і сингенних фетальних
нейроклітин………………..……………………………………………….……198
6.2. Імуноморфологічні співставлення у тварин-реципієнтів фетальних
нейроклітин….…………………………………………………………………..213
РОЗДІЛ 7 ІМУНОМОДУЛЮВАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ КОНДИЦІЙОВАНОГО
СЕРЕДОВИЩА НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ……….221
7.1. Вплив КСНК щура на мононуклеари периферичної крові людини в
короткострокових культурах in vitro…..……..………………………………….222
7.2. Вплив КСНК на продукцію та експресію цитокінів мононуклеарами
периферичної крові людини ………...…………………………………………..227
7.3. Імуномодулювальний вплив КСНК при введенні інтактним тваринам…...……230
РОЗДІЛ 8 ВПЛИВ КОНДИЦІЙОВАНОГО СЕРЕДОВИЩА НЕЙРОГЕННИХ
КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ НА ПУХЛИННІ КЛІТИНИ ТА
МОНОНУКЛЕАРИ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ХВОРИХ З ПУХЛИНАМИ
ГОЛОВНОГО МОЗКУ in vitro……………………………..…………………...235
8.1. Вплив КСНК на МНПК хворих з гліомами головного мозку в короткострокових
культурах in vitro….……………………………………………………………..236
8.1.1. Вплив КСНК на продукцію та експресію цитокінів МНПК хворих з гліомами
головного мозку ……………………………………………..………….…….....256
8.2. Вплив КСНК на пухлинні клітини хворих з гліомами головного мозку in vitro..263
8.2.1. Вплив КСНК на експресію та продукцію імуносупресивних цитокінів
пухлинними клітинами хворих з гліомами головного мозку………...………...276
8.3. Протипухлинна дія КСНК у довгострокових первинних культурах гліом
головного мозку людини ………………..…………………………………...….283
27
РОЗДІЛ 9 ВПЛИВ КОНДИЦІЙОВАНОГО СЕРЕДОВИЩА НЕЙРОГЕННИХ
КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ ЩУРА ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО
ЗМОДЕЛЬОВАНОГО ПУХЛИННОГО ПРОЦЕСУ ГОЛОВНОГО МОЗКУ...300
9.1. Вплив КСНК на пухлиноіндукувальну здатність клітин гліоми 101.8 у
щурів………..……………………………………………………………………300
9.2. Вплив фетальних НПК на перебіг експериментально змодельованої гліоми
головного мозку щурів 101.8……………………………………………………305
9.3. Вплив КСНК на перебіг експериментально змодельованої гліоми головного
мозку щурів 101.8 при різних режимах введення……………..…………….….308
9.4. Вплив алогенної вакцини, модифікованої КСНК, на виживаність та цитотоксичну
функцію імуноцитів щурів з гліомою головного мозку 101.8………………….313
РОЗДІЛ 10 ВПЛИВ КОНДИЦІЙОВАНОГО СЕРЕДОВИЩА НЕЙРОГЕННИХ
КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ ЩУРА У КУЛЬТУРАХ КЛІТИН
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ГЛІОМ….…….………………...…………………318
10.1. Вплив КСНК на клітини гліоми 101.8 in vitro……………………………..……318
10.2. Вплив КСНК на клітини гліоми С6 in vitro……………………….…..………...324
10.3. Вплив КСНК на проліферативну активність і вміст CD133+
-клітин у культурах
гліоми С6……………….................................................................................................330
10.5. Ефекти впливу КСНК на експресію TGF-1 та р53 клітинами гліоми С6...…..338
УЗАГАЛЬНЕННЯ....................................................................................................................347
ВИСНОВКИ…………………………………………………………………………..367
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ.............................................................................371
ДОДАТОК 1 РЕЗУЛЬТАТИ КОРЕЛЯЦІЙНОГО АНАЛІЗУ………………….443
ДОДАТОК 2 РЕЗУЛЬТАТИ МОРФОМЕТРИЧНОГО АНАЛІЗУ ТКАНИНИ
НЕОКОРТЕКСУ ГОЛОВНОГО МОЗКУ МИШЕЙ-РЕЦИПІЄНТІВ ПІСЛЯ
ВНУТРІШНЬОМОЗКОВОГО ВВЕДЕННЯ АЛОГЕННИХ І СИНГЕННИХ
НЕЙРОГЕННИХ КЛІТИН ФЕТАЛЬНОГО МОЗКУ……………………...450
ДОДАТОК 3 СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
ТА ВІДОМОСТІ ПРО АПРОБАЦІЮ РЕЗУЛЬТАТІВ ДИСЕРТАЦІЇ................455
ДОДАТОК 4 АКТИ ВПРОВАДЖЕННЯ ………………………………………...465
28
ПЕРЕЛІК СКОРОЧЕНЬ, УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ І
ТЕРМІНІВ
АПВ алогенна пухлинна вакцина
АПК антиген-презентувальні клітини
ВЗ вентрикулярна зона
ГЕБ гематоенцефалічний бар’єр
ГІ гліальний індекс
ДК дендритні клітини
ЕАЕ експериментальний алергічний енцефаломієліт
ЕСК ембріональні стовбурові клітини
ЗФР забуферений фізіологічний розчин
КСНК кондиційоване середовище нейрогенних клітин
ІФА імуноферментний аналіз
іПСК індуковані плюрипотентні стовбурові клітини
МІ мітотичний індекс
МНПК мононуклеари периферичної крові
МСК мезенхімальні стовбурові клітини
мРНК матрична рибононуклеїнова кислота
МТТ 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифенилтетразоліум бромід
ОБМ основний білок мієліну
НПК нейрогенні прогеніторні клітини
НСБ нейроспецифічні білки
НСК нейрогенні стовбурові клітини
НЦ нюхова цибулина
ПІ проліферативний індекс
ПААГ поліакриламідний гель
ПК природні кілери
СВЗ субвентрикулярна зона
СГЗ субгранулярна зона
СКПМ стовбурові клітини пухлин мозку
СМР спинномозкова рідина
СТЖ середня тривалість життя
ФІТЦ флуоресцеїну ізотіоціанат
ФТС фетальна теляча сироватка
ФФ фактор форми
ЦА цитотоксична активність
ЦІ цитотоксичний індекс
ЦНС центральна нервова система
ЦТЛ цитотоксичні лімфоцити
ЧМТ черепно-мозкова травма
29
ЧЩГ чисельна щільність гліоцитів
ЧЩН чисельна щільність нейронів
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) нейротрофічний фактор мозку
BMPs (bone morphogenetic proteins) кісткові морфогенетичні протеїни
CNTF (ciliary neurotrophic factor) циліарний нейротрофічний фактор
EGF (epidermal growth factor) епідермальний ростовий фактор
FGF (fibroblast growth factor) фактор росту фібробластів
G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) гранулоцитарний колонієстимулювальний фактор
GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor) гранулоцитарний-макрофагальний колонієстимулювальний фактор
GFAP (glial fibrillary acidic protein) гліальний фібрилярний кислий білок
GFР (green fluorescent protein) зелений флуоресцентний протеїн
HLA (human leucocyte antigens) антигени головного комплексу
гістосумісності людини
HGF (hepatocyte growth factor) ростовий фактор гепатоцитів
IFN (interferon) інтерферон
IGF (insulin-like growth factor) інсуліноподібний ростовий фактор
IL (interleukin) інтерлейкін
Кі-67 маркер проліферації
LIF (leukemia inhibitory factor) лейкеміє-інгібіторний фактор
МСР (monocyte chemoattractant protein) моноцитарний хемотаксичний
протеїн
МНС (major histocompatibility complex) головний комплекс
гістосумісності
NCAM (neural cell adhesion molecule) молекула адгезії нервових клітин
NGF (nerve growt factor) фактор росту нервів
NSE (neuronspecific enolase) нейронспецифічна єнолаза
PSA-NCAM (polysialic acid neural cell adhesion molecule) полісиальована
молекула адгезії нервових клітин
RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) – полімеразноланцюгова реакція із зворотною транскрипцією
SCF (stem cell factor) фактор стовбурових клітин
SDF (stromal cell-derived factor) cтромальний клітинний фактор
TGF (transforming growth factor) трансформувальний ростовий фактор
TNF (tumor necrosis factor) фактор некрозу пухлин
TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)
апоптозіндукувальний ліганд, пов’язаний з фактором некрозу пухлин
30
ВСТУП
Актуальність теми. Імунобіологічні властивості нейрогенних клітин
фетального мозку є важливою та недостатньо вивченою проблемою
імунології, яка потребує поглибленого дослідження для обґрунтування і
розробки новітніх підходів до лікування захворювань центральної нервової
системи (ЦНС). Актуальність цього напрямку досліджень визначається
інтенсивним розвитком технологій клітинної терапії різних уражень ЦНС із
застосуванням нейрогенних стовбурових клітин (НСК) та нейрогенних
прогеніторних клітин (НПК) [1-33]. Перспективність таких розробок
обумовлена здатністю НСК / НПК, отриманих з фетальних тканин, до
диференціювання у всі типи клітин нервової системи [4-6] та міграції до
місць уражень у ЦНС [3,7,8], у тому числі гліальних пухлин мозку [9-15]. На
експериментальних моделях патологій ЦНС продемонстровано
функціональне відновлення, клінічне поліпшення та подовження життя після
трансплантації НСК / НПК [1,16-23]; розпочато клінічні рандомізовані
контрольовані випробування (фаза І/ІІ) щодо безпечності та ефективності
застосування цих клітин при захворюваннях ЦНС [14,24-32]. Разом з тим
лише окремі дослідження на відповідному науковому рівні надають
переконливі докази достатньої клінічної ефективності застосування НСК /
НПК, яка б гарантувала їх прийняття в якості зареєстрованих сертифікованих
протокольних методів лікування [33].
Фундаментальні механізми впливу екзогенних нейрогенних клітин при
трансплантації на клітини мозку та імунної системи залишаються
недостатньо вивченими. Припускають, що трансплантовані НСК / НПК
можуть чинити ремоделювальну дію, розмножуючись у тканині мозку і
вбудовуючись у клітинні системи, або трофічну і нейропротекторну дію
[7,18], а також імуномодуляторний вплив [4,34-42]. Існують окремі
повідомлення про здатність НСК / НПК експресувати і продукувати досить
широкий спектр імуноактивних молекул [16,41,43-47]. Попри це механізми
31
взаємодії між імунною системою реципієнта і пересадженими клітинами,
зокрема в локальному мікросередовищі ЦНС, потребують поглиблених
досліджень [43,44]. Дискусійними та контроверсійними залишаються
питання гістосумісності алогенних НСК / НПК з організмом реципієнта:
інтенсивності експресії цими клітинами антигенів головного комплексу
гістосумісності I та II типів, довготривалого виживання алотрансплантатів та
механізмів відторгнення донорських НСК / НПК. Водночас досліджується
можливість застосування НСК / НПК як засобів таргетної терапії злоякісних
пухлин мозку [9,13,15,48-51] та індукції довгострокової протипухлинної
відповіді через стимулювання імунної системи і доставки в пухлини різних
біологічних агентів [14,52-57]. Зазначені підходи ґрунтуються на здатності
НСК / НПК мігрувати до злоякісних гліом та індукувати загибель пухлинних
клітин у тварин; пролонгуючи їх виживання та гальмуючи ріст пухлини
[52,56,58,59], однак механізми протипухлинних ефектів НСК / НПК
залишаються невизначеними.
З’ясування основних механізмів реалізації імуномодуляторного та
протипухлинного потенціалу НСК / НПК як складової перспективних
новітніх напрямків лікування патології ЦНС необхідне для об’єктивної
оцінки імунообумовлених наслідків післятрансплантаційних ефектів цих
клітин та пошуку шляхів оптимізації їх застосування у розробці способів біота імунотерапії пухлин головного мозку. Комплексні імунологічні
дослідження антигенних, імуногенних, імуномодулювальних та
протипухлинних властивостей нейрогенних клітин фетального мозку,
особливостей імунної відповіді на алотрансплантацію НСК / НПК та її ролі у
збереженні або загибелі алогенних клітин уможливлять аргументовану
оцінку їх використання при захворюваннях ЦНС та визначать необхідність
імуносупресії при нейротрансплантації. Надзвичайно важливим є
дослідження загальнобіологічних механізмів протипухлинної дії
нейрогенних клітин фетального мозку та продукованих ними гуморальних
медіаторів. До останнього часу продуковані НСК / НПК біологічно активні
32
речовини у складі кондиційованого середовища культивування цих клітин
практично не розглядались як чинники їх імуномодулювального і
протипухлинного впливу. Оскільки збагачене біологічно активними
факторами кондиційоване середовище НСК / НПК може вважатись
ключовим компонентом мікрооточення («ніші») цих клітин, то залежно від
етапу їх розвитку воно може відповідним чином впливати на процеси
проліферації, диференціації та виживання / або апоптозу пухлинних клітин
гліоми. Вкрай актуальною лишається проблема пошуку шляхів підвищення
ефективності комплексного патогенетичного лікування злоякісних гліом
головного мозку з використанням нейрогенних клітин фетального мозку у
складі таргетної індивідуалізованої терапії та удосконалення способів
імунотерапії гліом.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційне дослідження виконане в Державній установі «Інститут
нейрохірургії ім.акад.А.П.Ромоданова НАМН України» (ДУ «ІНХ НАМН») в
межах планових науково-дослідних робіт, в яких дисертант була виконавцем
окремих фрагментів або відповідальним виконавцем: «Вивчити нейробластні
шляхи диференціювання стовбурових клітин і розробити методи їх
регіонарного застосування при вогнищевих ураженнях нервової системи»
(№ держреєстрації 0102U003252 (2002-2004 рр.) – відповідальний
виконавець); «Вивчити вплив внутрішньомозкової імплантації
гліальнозбагачених фракцій неокортексу, мозочка і стовбурових клітин на
морфофункціональну пластичність і метаболізм мозку та визначити
ефективність їх застосування при вогнищевих ураженнях ЦНС»
(№ держреєстрації 0102U003241 (2002-2004 рр.); “Вивчити модулюючий та
апоптичний вплив злоякісних пухлин головного мозку різного генезу на
імунну систему та розробити способи активації протипухлинного імунітету”
(№ держреєстрації 0104U000409 (2004-2006 рр.); "Дослідити
імуномодулюючу активність стовбурових нейроклітин в процесі їх
диференціювання in vitro" (№ держреєстрації 0105U000902 (2005-2007 рр.) -
33
відповідальний виконавець); “Дослідити порушення метаболізму негемового
заліза і оксиду азоту в головному мозку при формуванні епілептичного
вогнища” (№ держреєстрації 0105U000901 (2005-2007 рр.); "Дослідження
порушень протипухлинної ланки імунної системи при злоякісних пухлинах
головного мозку та їх корекція біологічними та імуномодулюючими
чинниками" (№ держреєстрації 0107U001191 (2007-2009 рр.); “Вивчити
значення стану імунної системи в реакціях імунного відторгнення алогенних
ембріональних клітин в експерименті" (№ держреєстрації 0107U012771
(2008-2010 рр.); "Дослідити вплив прогеніторних клітин на перебіг запальнодегенеративних уражень ЦНС та розробити диференційовані методи їх
лікування" (№ держреєстрації 0110U002191 (2010-2012 рр.); «Визначити
зміни рівня експресії трансформуючого фактора росту бета у клітинах
культивованих гліом за умов антипроліферативного впливу супернатанту
фетальних нейрогенних клітин щура» (№ держреєстрації 0114U006179 (2014-
2015 рр.) – відповідальний виконавець).
Мета дослідження: визначення імунобіологічних і протипухлинних
властивостей нейрогенних клітин фетального мозку та їх гуморальних
чинників.
Завдання дослідження:
1. Розробити спосіб отримання та культивування нейрогенних
клітин з фетального головного мозку.
2. Дослідити експресію маркерних протеїнів (нестину, промініну-1
(CD133), віментину, гліального фібрилярного кислого білка (GFAP),
нейронспецифічної єнолази (NSE), основного білка мієліну (ОБМ))
нейрогенними клітинами фетального мозку в процесі культивування in vitro.
3. Дослідити експресію антигенів гістосумісності I та II типів
нейрогенними клітинами фетального мозку в динаміці культивування in vitro.
4. Порівняти імуногенність нейрогенних клітин фетального мозку
та клітин лімфовузлів і головного мозку дорослих тварин при різних
способах їх введення в експерименті.
34
5. Оцінити вплив імуносупресії на інтенсивність алоспецифічних і
нейроспецифічних імунних реакцій у тварин-реципієнтів алогенних
фетальних нейроклітин.
6. Дослідити морфологічні зміни головного мозку тваринреципієнтів у відповідь на внутрішньомозкове введення алогенних і
сингенних фетальних нейроклітин та кореляційні співвідношення з
системними імунними реакціями.
7. Вивчити імуномодулювальні властивості гуморальних факторів у
складі кондиційованого середовища нейрогенних клітин фетального мозку
щура in vitro та in vivo.
8. Дослідити вплив кондиційованого середовища нейрогенних
клітин фетального мозку щура на клітини пухлин головного мозку in vitro.
9. Визначити ефекти кондиційованого середовища нейрогенних
клітин (КСНК) фетального мозку щура in vivo у тварин з експериментальною
гліомою головного мозку при різних режимах введення.
10. Встановити чинники біологічних ефектів кондиційованого
середовища нейрогенних клітин фетального мозку щура.
Об’єкт дослідження – імунна та біологічна активність нейрогенних
клітин фетального мозку.
Предмет дослідження – фенотипові, антигенні та імуногенні
характеристики, імуномодулювальні та протипухлинні (цитотоксичні,
проапоптотичні, антимітотичні, антипроліферативні) ефекти нейрогенних
клітин фетального мозку.
Методи дослідження: імунологічні (імуноцитохімічне та
імунофлуоресцентне визначення експресії фенотипових маркерів;
імуноферментний аналіз вмісту цитокінів та антитіл до нейроспецифічних
антигенів; визначення цитотоксичної активності імуноцитів та
алоспецифічних антитіл), молекулярно-біологічні (визначення експресії мРНК
генів гістосумісності, цитокінів за допомогою полімеразно-ланцюгової
реакції із зворотною транскрипцією), біохімічні (отримання фракціонуванням
35
нейроспецифічних білків, електрофоретичне визначення складу
кондиційованого середовища нейрогенних клітин фетального мозку щура),
цитологічні (цитофлуориметричне визначення життєздатних та апоптичних
клітин), метод культивування клітин, морфологічні методи (світлова
мікроскопія (оглядові і спеціальні методики) цитологічних препаратів
культур клітин та гістологічних препаратів головного мозку дослідних
тварин, морфометричний аналіз), методи експериментального моделювання
(відтворення та моніторинг алоспецифічних імунних реакцій у лінійних
тварин, перещеплення гліоми з наступною оцінкою виживаності),
статистичні методи. Усі дослідження проведено з дотриманням норм
біологічної безпеки та принципів біоетики (протокол № 2 від 2.04.2007 р.
Комітету з біоетики ДУ «ІНХ НАМН»).
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на основі
проведених досліджень визначено роль імунобіологічних і протипухлинних
властивостей нейрогенних клітин фетального мозку та їх гуморальних
чинників у формуванні системних реакцій трансплантаційного і
протипухлинного імунітету.
Розширено існуючі уявлення щодо імуногенності нейрогенних клітин
фетального мозку та експресії ними антигенів гістосумісності. Показано
зниження їх експресії за умов культивування клітин in vitro в присутності
ретинола ацетату.
Отримано нові дані про здатність нейрогенних клітин фетального мозку
викликати реакції трансплантаційного та нейроспецифічного імунітету in
vivo. Продемонстровано зменшення проявів алоімунної агресії у відповідь на
введення нейрогенних клітин за умов імуносупресії циклоспорином А.
Уперше в експерименті у тварин-реципієнтів після
внутрішньомозкового введення фетальних алогенних нейроклітин показано,
що розвиток нейроспецифічної імунної відповіді асоційований з
морфологічними змінами тканини головного мозку, що доводить участь
антитіл до нейроантигенів, поряд з антитілами до алоантигенів, у механізмах
36
імунного відторгнення трансплантованих клітин в
імунонескомпроментованому організмі.
Вперше доведено, що КСНК фетального мозку щура чинить
дозозалежний цитотоксичний, антимітотичний та антипроліферативний
вплив на культивовані клітини гліом, знижує здатність клітин гліоми до
індукції пухлини in vivo, посилює імунну реактивність тварин з пухлинами та
подовжує їх тривалість життя. Доведено протипухлинну ефективність
алогенної пухлинної вакцини, модифікованої КНСК, у тварин з
експериментальною гліомою головного мозку.
Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих в
дисертаційному дослідженні даних розроблено спосіб отримання клітинної
суспензії, збагаченої НСК / НПК (Деклараційний патент України на винахід
71388 А від 15.11.2004). Розроблено способи оцінки алоспецифічних
клітинних імунних реакцій та нейроспецифічних аутоімунних реакцій у
відповідь на трансплантацію нейрогенних клітин (Патенти України на
корисну модель № 75057, № 75059 від 26.11.2012), які можуть бути
рекомендовані для моніторингу імунообумовлених наслідків
післятрансплантаційних ефектів цих клітин. Встановлене зниження проявів
реакцій трансплантаційного імунітету за впливу циклоспорину А
обґрунтовує показання до застосування імуносупресивних препаратів при
нейротрансплантації алогенних клітин фетального мозку.
Експериментально доведено, що первинні культури гліом головного
мозку є адекватною моделлю для оцінки протипухлинної дії кондиційованого
середовища, отриманого від фетальних нейрогенних клітин, і можуть бути
використані для визначення індивідуальної чутливості пухлинних клітин до
його впливу. Встановлені в дисертаційному дослідженні протипухлинні
ефекти кондиційованого середовища нейрогенних клітин in vitro та in vivo
створюють підґрунтя для розробки способів застосування біопрепаратів,
одержаних з фетальних нейрогенних клітин, у комплексній патогенетичній
терапії хворих з гліомами.
37
Наукові розробки дисертаційної роботи впроваджено в роботу відділу
нейроімунології та лабораторії культивування тканин ДУ «ІНХ НАМН».
Основні наукові результати дослідження включені у лекційний курс з
нейрохірургії кафедри нейрохірургії Національного медичного університету
імені О.О.Богомольця.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним
науковим дослідженням. Здобувачем особисто запропоновано ідею
дослідження, сформульовано мету і завдання, проведено патентноінформаційний пошук та аналіз наукової літератури щодо імунобіологічних
властивостей нейрогенних клітин фетального мозку. Дисертантом самостійно
виконані експериментальні дослідження на тваринах та лабораторні
імунологічні, молекулярно-генетичні, біохімічні, цитологічні дослідження,
проведено культивування нейрогенних фетальних клітин. Дисертантом
особисто проведено первинну обробку результатів досліджень, їх аналіз,
інтерпретацію та статистичну обробку, сформульовано висновки. Всі розділи
дисертації написано та оформлено автором особисто.
Матеріали та положення кандидатської дисертації автора не
використовувалися в її докторській дисертації.
Автор висловлює щиру подяку співробітникам лабораторії
культивування тканин та відділу нейропатоморфології ДУ «ІНХ НАМН» за
методичну допомогу у виконанні морфологічних досліджень. Автор
висловлює щиру подяку науковому консультанту д.мед.н., професору,
члену-кореспонденту НАМН України Лісяному М.І. за участь у обговоренні
результатів дослідження, наукових положень та висновків дисертації.
Апробація матеріалів дисертації. Основні положення та результати
дисертаційної роботи оприлюднено на XIIІ Всеросійській конференції
«Нейроиммунология» 24-27 травня 2004 р. (м. С.-Петербург, РФ),
міжнародному симпозіумі з біології клітини в культурі “Стволовые клетки,
регенерация, клеточная терапия” 25-27 жовтня 2004 р. (м. С.-Петербург, РФ);
Всеросійському симпозіумі «Биология клетки в культуре» 17-19 жовтня
38
2006 р. (м. С.-Петербург, РФ); XVI Всеросійській конференції
«Нейроиммунология» 23-26 травня 2007 г. (м. С.-Петербург, РФ); ІІ з’їзді
Товариства клітинної біології сумісно з ювілейною конференцією,
присвяченою 50-річчю Інституту цитології РАН, 16-19 жовтня 2007 р. (м. С.-
Петербург, РФ); IV з’їзді нейрохірургів України 27-30 травня 2008 р.
(м. Дніпропетровськ); науково-практичній конференції за участі
міжнародних спеціалістів «Трансплантація органів, тканин та клітин» 20-21
листопада 2008 р. (м. Київ); Всеросійському симпозіумі з біології клітини в
культурі «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» 12-14
жовтня 2009 р. (м. С.-Петербург, РФ); науково-практичній конференції
нейрохірургів України за участю НДІ нейрохірургії ім. акад. М.Н. Бурденка
РАМН «Проблеми реконструктивної та відновної нейрохірургії» 7–8 жовтня
2010 р. (м. Партеніт, АР Крим); X Ювілейній Всеросійській науковопрактичній конференції «Поленовские чтения» 19-22 квітня 2011 р. (м. С.-
Петербург, РФ); ХІІ з’їзді онкологів України 20-22 вересня 2011 р. (м. Судак,
АР Крим); конференції «Клеточные технологии для регенеративной
медицины» 17-25 жовтня 2011 р. (м. С.-Петербург, РФ); 3-му з’їзді
Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом
16-20 травня 2012 р. (м. Ялта, АР Крим); науковій конференції "Актуальные
вопросы криобиологии и криомедицины" 18-19 жовтня 2012 р. (м. Харків);
VI щорічному міжнародному симпозіумі «Актуальные вопросы генных и
клеточных технологий» 11-12 жовтня 2013 р. (м. Москва, РФ);
Всеросійському симпозіумі з біології клітини в культурі 23-25 жовтня 2013 р.
(м. С.-Петербург, РФ); XX Всеросійській конференції «Нейроиммунология.
Рассеянный склероз» 28-31 травня 2015 р. (м. С.-Петербург, РФ);
міжнародній конференції “Advances in cell biology and biotechnology” 11-13
жовтня 2015 р. (м. Львів); 5-му з’їзді Українського товариства клітинної
біології з міжнародним представництвом 2-6 жовтня 2016 р. (м. Одеса); 7-й
міжнародній Вайглівській конференції 26-29 вересня 2017 р. (м. Львів);
39
міжнародній науковій конференції «Normal and cancer stem cells: discovery,
diagnosis and therapy» 5-6 жовтня 2017 р. (м. Київ).
Апробація відбулася на спільному засіданні Вченої ради Державної
установи «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова НАМН України»,
кафедр нейрохірургії Національного медичного університету імені
О.О.Богомольця та Національної академії післядипломної освіти
ім.П.Л.Шупика 24 травня 2017 р., протокол № 13.
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 62 наукові праці, у
тому числі 36 статей (6 одноосібних), з яких 24  у фахових періодичних
виданнях (біологічні науки), рекомендованих МОН України, серед них 11 – у
виданнях, включених до міжнародних наукометричних баз (1  Web of
Science, 7  Scopus; 3 – Index Сopernicus), 6  у наукових періодичних
іноземних виданнях, 6  у фахових виданнях (медичні науки), 1  розділ
монографії (одноосібний), 1 деклараційний патент України на винахід, 3
патенти України на корисну модель, 21 тези доповідей на з’їздах,
симпозіумах, конференціях (18 – вітчизняних з міжнародною участю або за
кордоном).
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з анотації,
вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, восьми розділів
власних досліджень, узагальнення, висновків, 4 додатків. Загальний обсяг
дисертації становить 472 сторінки; основну частину роботи викладено на 299
сторінках, ілюстровано 78 рисунками, 55 таблицями. Список посилань
містить 529 найменувань, з них 106  кирилицею та 423  латиною.

bibliography

УЗАГАЛЬНЕННЯ
Імунобіологічні властивості нейрогенних клітин фетального мозку -
НСК/НПК  є актуальною проблемою імунології, яка визначається інтенсивним
розвитком технологій клітинної терапії захворювань ЦНС із застосуванням цих
клітин. На експериментальних моделях уражень ЦНС показано, що НСК/НПК,
отримані з фетальних тканин, при трансплантації виявляють патотропізм до
специфічних місць ураження, сприяють функціональному відновленню і
клінічному поліпшенню, виявляючи нейропротекторну і протизапальну дію. Але
повне розуміння механізмів, за допомогою яких ці клітини реалізують свій
терапевтичний потенціал, досі відсутнє.
Припускають, що трансплантовані НСК/НПК можуть чинити клітиннозамісну, нейротрофічну або імуномодулювальну дію, встановлюючи
функціональний взаємообмін молекулярними сигналами з різними типами клітин
мікрооточення за рахунок вивільнення клітинних регуляторів (морфогенів,
нейротрофінів, цитокінів, хемокінів – т.зв. «bystander» ефект) [4,13,31-38,41-43].
Але питання імунологічної взаємодії між реципієнтом і пересадженими клітинами,
гістосумісності алогенних НСК/НПК з організмом реципієнта, а також
необхідності імуносупресії при нейротрансплантації потребує поглиблених
досліджень. Нез’ясованим залишається механізм протипухлинних властивостей
НСК/НПК.
У зв’язку з цим метою дисертаційного дослідження було визначення
імунобіологічних і протипухлинних властивостей нейрогенних клітин фетального
мозку і їх гуморальних чинників.
Нами запропоновано стандартизований спосіб отримання з фетального мозку
життєздатної популяції недиференційованих клітин (НСК/НКП) за допомогою
тривалого культивування у безсироватковому селективному середовищі з
наступним додаванням ретинола ацетату (Спосіб отримання збагаченої суспензії
стовбурових нейральних клітин // Деклараційний патент на винахід 71388 А).
348
При культивуванні нейрогенних клітин фетального мозку у безсироватковому
середовищі DМЕМ показано, що до 9-ї доби спостереження відбувається зниження
кількості клітин у 2,5 рази, а протягом наступних 10  14 діб – стабілізація їх
кількості, що засвідчує наявність у культурі життєздатної популяції
недиференційованих клітин (НСК/НПК). Введення в культиваційне середовище
додаткових факторів стимулює проліферацію НСК/НПК (ретинола ацетат,
нейротрофічний фактор S-100) та сприяє збереженню їх кількості (EGF, FGF).
Присутність ретинола ацетату в поживному середовищі культур нейрогенних
клітин фетального мозку забезпечує виживання і розмноження нейроклітин
(НСК/НПК), індукує формування багатоклітинних нейросфер. Поєднання інсуліну
і ретинола ацетату сприяє нейрональному диференціюванню (8,5 ± 0,5) % клітин.
Послідовний вплив ретинола ацетату і ретиноєвої кислоти викликає появу чітко
виражених ознак цитотипового нейронального диференціювання у (25,0 ± 0,5) %
клітин, які набувають найбільш виразного прояву при послідовному додаванні в
культиваційне середовище ретинола ацетату, ретиноєвої кислоти та 10 % ФТС.
За умов культивування нейрогенних клітин фетального мозку в середовищі
DМЕМ із збільшенням тривалості культивування зростає частка клітин, що
експресують віментин (маркер НСК/НПК), із (28,6 ± 3,6) % на 2-у добу
культивування до (77,0 ± 13,9) % на 16-у добу. Водночас експресія GFAP (маркер
гліобластів і астроцитів) в процесі культивування нейрогенних клітин фетального
мозку в середовищі DМЕМ не змінюється і становить 80 %. Частка клітин,
позитивних на нестин (білок проміжних філаментів, маркер НСК) становить майже
50 %, позитивних на CD133 (промінін-1, маркер НСК)  38  40 %. У зв’язку з цим
слід зазначити, що коекспресія фетальними нейроклітинами нестину, віментину і
GFAP пояснюється властивою для НСК астроцитарною мімікрією [57,59,60,96].
Упродовж культивування кількість нестин-позитивних клітин дещо зменшується
(до 38 %), а CD133-позитивних клітин  збільшується до 45  50 %, засвідчуючи,
що не менше 40  50 % клітин у культурі фетальних нейрогенних клітин є
НСК/НПК.
349
Імуноцитохімічне забарвлення на маркерні протеїни основних популяцій
нейроклітин (NSE, GFAP, ОБМ) підтверджує, що нейроклітини фетального мозку
при культивуванні зберігають мультипотентні властивості у набутті фенотипових
ознак нейронів (експресія NSE), астроцитів (експресія GFAP) та олігодендроцитів
(експресія ОБМ). Послідовне застосування таких умов культивування, як наявність
ростового фактора (ретинола ацетату), адгезії до субстрату (пересівання клітин на
скельця, покриті поліетиленіміном), додавання індуктора диференціювання
(ретиноєвої кислоти) дозволяє отримати культури з 20  30 % вмістом нейронів,
імунопозитивних на NSE. Наші спостереження відповідають даним щодо ефектів
ретинолу та ретиноєвої кислоти як сполук групи вітаміну А на ріст, розмноження і
диференціювання клітин нейроепітеліального походження та індукції
нейрогенного напряму диференціювання НСК/НПК внаслідок впливу ретиноєвої
кислоти, що обумовлено послідовною активацією транскрипційних факторів
ядерних рецепторів ретиноєвої кислоти (RAR,, та X-рецепторів ретиноїдів
(RXR,, утворенням гетеродимера RXR–RAR і запуском сигнальної мережі,
яка координує численні молекулярні події протягом процесу диференціювання
[264-266].
Під час культивування клітин фетального мозку частка клітин, позитивних на
TGF-1, становить від (22,04 ± 2,33) % до (15,27 ± 9,80) % з 2-ї по 37-у добу, що
відповідає даним літератури [43,45,46,58,315] і засвідчує потенційні
імуномодуляційні властивості цих клітин.
В даний час в науковій літературі не існує усталеної думки щодо експресії
антигенів головного комплексу гістосумісності (МНС) НСК/НПК. За нашими
даними, нейроклітини мозку людини 5-9-го тижнів гестації містять (15,7 ± 2,4) %
HLA-A,B,C-позитивних клітин та (17,7 ± 4,0) % HLA-DR-позитивних клітин.
Частка HLA-A,B,C
+
та HLA-DR+
-клітин найменша серед нейроклітин людини 5-го
тижня гестації і поступово зростає до 89 тижнів гестації. Клітини НЦ людини
містять (5,05 ± 1,51) % HLA-A,B,C
+
-клітин і (10,72 ± 2,69) % HLA-DR+
-клітин.
Експресія мРНК генів HLA-A1а, HLA-DRa1, HLA-DQb1, CIITA нейроклітинами
фетального мозку відсутня або незначна. Виявлено тенденцію до зростання
350
експресії мРНК HLA-A1а, і особливо, HLA-DRa1 від повної відсутності або
незначних кількостей у нейроклітинах людини 59-го тижнів гестації (НСК/НПК)
до часткової експресії у регіонарних НСК/НПК зрілого мозку (клітини НЦ) і до
значної експресії у клітинах білої речовини і кори зрілого мозку. Експресія мРНК
HLA-DQb1 також демонструє тенденцію до зростання у диференційованих
клітинах зрілого мозку (кори і білої речовини), порівняно з недиференційованими
нейроклітинами фетального мозку. Отримані результати відповідають даним щодо
широкого діапазону експресії НСК людини HLA-А,В,С та HLA-DR - від
незначного до суттєвого рівня [39,87-89,94,99,102]. Слід зазначити, що ми
досліджували рівень експресії випадково вибраних алелів HLA (HLA-A1а, HLADRa1, HLA-DQb1), які відзначаються дуже високим поліморфізмом, що сягає
найвищого рівня в локусах DRB1, DQB1, DQA1 [78,83]. Дещо різні кількісні дані,
отримані при дослідженні експресії антигенів HLA на рівні мРНК і на
протеїновому рівні, пояснюються різницею чутливості методів RT-PCR та
імуноцитохімії та є свідченням необхідності комплексного їх застосування.
При вивченні впливу складу культурального середовища встановлено, що в
процесі культивування нейроклітин людини 59-го тижнів гестації в середовищі
DMEM з додаванням ретинола ацетату відбувається зменшення кількості і відсотка
клітин, що експресують антигени HLA І і ІІ класу на протеїновому рівні, тоді як
присутність у середовищі факторів росту сприяє збереженню (FGF) або зростанню
(EGF) кількості таких клітин. При культивуванні у DMEM кількість клітин НЦ, що
експресують антигени гістосумісності І та ІІ класу, зменшується з 10-ї по 20-у добу.
Культивування упродовж 14 діб у середовищі DMEM та при додаванні ростових
факторів (ретинола ацетат, EGF, FGF) суттєво не впливає на експресію мРНК генів
HLA нейроклітинами людини. Дані літератури з цього питання є
контроверсійними. За одними даними, при культивуванні НСК/НПК людини
експресія HLA І і ІІ класу з’являлась [99] або збільшувалась [89,131], за іншими –
не змінювалась [86,87] або знижувалась [88].
У наших дослідженнях експресія антигенів гістосумісності нейроклітинами
фетального мозку людини змінюється за впливу ІNF- та ІNF- як на рівні мРНК,
351
так і на протеїновому рівні: за впливу ІNF- індукується або зростає експресія
мРНК HLA-DRa1 та збільшується кількість HLA-DR+
і HLA-A,B,C
+
-клітин; за
впливу ІNF- зростає кількість клітин, які експресують антигени HLA-A,B,C, що
відповідає відомим даним [70,76,85,96,98,99,102,106,277]. У диференційованих
клітинах індукція IFN- молекул HLA I класу значно більша, ніж у
недиференційованих (НСК) [76,69,85], що пояснює дещо нижчий від очікуваного
вплив IFN- на нейроклітини фетального мозку в умовах культивування.
Наступне завдання дослідження полягає у визначенні здатності нейрогенних
клітин фетального мозку викликати алоспецифічні і тканинноспецифічні імунні
реакції при різних способах введення лінійним тваринам у порівнянні з клітинами
дорослих тварин, та оцінці впливу імуносупресії на інтенсивність імунних реакцій
у тварин-реципієнтів алогенних фетальних нейроклітин.
В результаті досліджень встановлено, що клітинні алоімунні реакції
розгортаються з 6-ї по 37-у добу після внутрішньоочеревинного введення
фетальних НПК (Е13-15), нейроклітин та клітин лімфовузлів дорослих тварин з
максимальним рівнем на 6-у добу і подальшим зниженням до 37-ї доби.
Інтенсивність клітинної алоімунної відповіді на фетальні НПК нижча за відповідь
на клітини лімфовузлів дорослих тварин. При внутрішньоочеревинному введенні
всіх досліджуваних типів клітин гуморальні алоімунні реакції зростають до 12-ї
доби з різною інтенсивністю залежно від типу введених клітин: найвищий рівень
алоантитіл зареєстровано у групі тварин із введенням клітин лімфовузлів дорослих
тварин, статистично значуще нижчий  у групах тварин із введенням фетальних
НПК та нейроклітин дорослих тварин. Після системного введення фетальних НПК
зафіксовано підвищений рівень антитіл до ОБМ та S-100 (18-37-а доба), що
свідчить про потенційну можливість розвитку нейроспецифічних імунних реакцій
у реципієнтів фетальних нейроклітин.
Після внутрішньомозкового введення фетальних НПК, нейроклітин та клітин
лімфовузлів дорослих тварин генеруються клітинні алоімунні реакції з 6-ї по 12-у
добу з наступним зниженням на 37-у добу, що спростовує уявлення про те, що
головний мозок є імунопривілейованим органом, де імунні реакції не індукуються.
352
При внутрішньомозковому введенні всіх досліджуваних типів клітин гуморальні
алоцитотоксичні реакції зростають з 12-ї по 18-у добу з різною інтенсивністю
залежно від типу введених клітин: найвищий рівень алоантитіл зареєстровано у
групі тварин із введенням клітин лімфовузлів дорослих тварин, достовірно нижчий
 у групах тварин із введенням фетальних НПК та нейроклітин дорослих тварин. У
тварин із внутрішньомозковим алотрансплантатом фетальних НПК розвивається
гуморальна аутоімунна відповідь до нейроспецифічних антигенів, яка сягає
найвищого рівня у віддалений період (37-а доба) після трансплантації, що дозволяє
стверджувати, що поряд з антитілами до алоантигенів в реакціях імунного
відторгнення можуть брати участь також антитіла до нейроантигенів.
Системне (внутрішньоочеревинне) введення фетальних НПК викликає більш
виразну клітинну і гуморальну алоімунну відповідь, порівняно із локальним
(внутрішньомозковим). Водночас у тварин із внутрішньомозковим введенням
фетальних НПК генерується більш значуща специфічна імунна відповідь на
маркерні антигени клітин нервової системи (ОБМ і NSE). У тварин з
внутрішньомозковим сингенним трансплантатом фетальних НПК не зареєстрована
гуморальна аутоімунна відповідь до нейроспецифічних антигенів.
Вочевидь, після внутрішньоочеревинного введення фетальних НПК частина
клітин потрапляє у лімфовузли та селезінку, де вони контактують з АПК та
індукують специфічні антитілопродукуючі клітини. У результаті здійснення
ефекторної функції алоцитотоксичних лімфоцитів та антитіл інша частина
фетальних клітин гине, вивільняючи НСБ, які зв’язуються циркулюючими
природними аутоантитілами, і таким чином відтерміновують наростання титрів
нейроаутоантитіл, чим пояснюється розвиток нейроаутоімунної гуморальної
відповіді у більш пізній термін (18-37-а доба), ніж алоцитотоксичної (6-18-а доба), а
також зменшення нижче контролю рівнів аутоантитіл до S-100 (6-а доба) та NSE
(12-18-а доба).
При внутрішньомозковому введенні фетальних НПК результатом деструкції
загиблих імплантованих клітин внаслідок розвитку реакції алоспецифічного
імуноцитолізу, а також активізації функції та проліферації різних популяцій клітин
353
в ділянці введення та на віддаленні від неї, вочевидь, є зростання вивільнення НСБ.
Далі НСБ у тканині мозку можуть захоплюватись ДК (із міжклітинної та
спинномозкової рідини), а також поглинатись тканинними макрофагами і
деградуватись тканинними протеазами [278]. Вихід НСБ через лікворні простори у
периферичну кров призводить до контакту з АПК, їх активації та індукції
специфічних антитілопродукуючих клітин і генерації нейроспецифічних антитіл. У
ранні строки після введення НПК циркулюючі природні нейроаутоантитіла можуть
зв’язувати НСБ, що вивільняються, і таким чином дещо відтерміновувати
наростання титрів нейроантитіл, чим пояснюється розвиток нейроаутоімунної
гуморальної відповіді у більш пізній термін, ніж алоцитотоксичної. Це припущення
підтверджується зафіксованою динамікою рівня антитіл до НСБ у тваринреципієнтів НПК: на 18-у добу після імплантації фетальних нейроклітин
знижується рівень антитіл до трьох досліджених НСБ, порівняно з 12-ю добою, що,
вочевидь, пояснюється зв’язуванням вільноциркулюючих нейроантитіл з
розчинними НСБ, які надійшли в кровоток в результаті імуноцитолізу нейроклітин
цитотоксичними імуноцитами (пік ЦА припадає на 6-у добу) і алоспецифічними
антитілами (пік генерації  18-а доба). До 37-ї доби рівень антитіл до НСБ значуще
підвищується, що свідчить про нарощування їх продукції антигенспецифічними Влімфоцитами у відповідь на антигенний стимул (НСБ).
Розвиток специфічної імунної відповіді на маркерні антигени клітин нервової
системи у тварин із трансплантатами алогенних фетальних НПК і відсутність такої
відповіді у тварин із трансплантатами сингенних НПК пояснюється, вочевидь, тим,
що для початку запуску нейроспецифічної імунної відповіді необхідно ініціальне
вивільнення НСБ в результаті імуноцитолізу алоцитотоксичними імуноцитами і
антитілами, який стає можливим у разі експресії донорськими НПК антигенів
МНС, відмінних від антигенів МНС реципієнта (у нашому випадку – при
імплантації алогенних НПК). Крім того, розпізнавання антигенних детермінант
НСБ відбувається у комплексі з антигенами гістосумісності.
Отримані результати засвідчують наступний механізм розвитку
нейроспецифічної імунної відповіді у тварин-реципієнтів фетальних НПК після
354
внутрішньомозкового введення: контакт імуноцитів з НПК → розпізнавання
антигенів МНС → активація клітин імунної системи (ПК, ЦТЛ, В-лімфоцитів) →
генерація цитотоксичних клонів ПК і ЦТЛ і продукція алоцитотоксичних антитіл
→ імунолізис частини НПК → демаскування нейроспецифічних антигенів,
вивільнення НСБ → розпізнавання НСБ імуноцитами (Тh2-, B-лімфоцити) →
генерація нейроспецифічних антитіл → антитілозалежний лізис клітин-мішеней
(власних клітин ЦНС реципієнта) → масоване вивільнення НСБ → активація
антигенспецифічних клонів лімфоцитів (Т-, В-лімфоцити) → підтримання
продукції нейроспецифічних антитіл.
Порівняльний аналіз клітинно-структурних реакцій тканини головного мозку
тварин-реципієнтів у відповідь на внутрішньомозкове введення клітинних суспензій
різних ліній тварин-донорів клітинного матеріалу показує, що після
внутрішньомозкового введення алогенних суспензій фетальних НПК, лімфоцитів
лімфовузлів, а також нейроклітин з дорослого мозку спостерігається подібна
динаміка реактивних змін тканини мозку навколо пункційного каналу: ознаки
перицелюлярного набряку та лімфоцитарна інфільтрація, які виявляються у
прилеглих ділянках мозку на 12-18-у добу, зменшуючись до 37-ї доби. Введені
алогенні фетальні НПК зберігаються до 18-ї доби спостереження та виявляють
ознаки початкового нейронального диференціювання. За умов імуносупресії
циклоспорином А виявлено ознаки фенотипового диференціювання НПК та ознаки
їх інфільтрації у суміжні відділи мозку. На 37-у добу імплантовані НПК не
виявляються.
Встановлено, що вогнищеві реакції гліального компоненту мозку на
імплантовані НПК зменшуються швидше після нейроімплантації сингенних НПК
(до 18-ї доби), ніж при нейроімплантації алогенних НПК (до 37-ї доби). Кількісні
морфометричні показники тварин цих груп статистично значуще відрізняються: ЧЩ
незмінених нейронів неокортексу у реципієнтів сингенних НПК перевищує
показник реципієнтів алогенних НПК, і, навпаки, ЧЩ гіперхромних і
вакуолізованих нейронів, ЧЩГ та ГІ у реципієнтів сингенних клітин значно нижчі за
показники реципієнтів алогенних клітин. Зафіксовані структурні реакції в тканині
355
мозку мишей-реципієнтів є морфологічним відображенням розвитку алоспецифічної
імунної відповіді реципієнта на введені алогенні НПК.
Отриманий факт виживання введених алогенних НПК у тканині мозку тваринреципієнтів до 18-ї доби відповідає даним щодо досить тривалого виживання
алотрансплантатів НПК в інтактній ЦНС  від 3 тижнів до 2 міс після введення
[148,149,180,290,291]. За нашими даними, більш активна проліферація введених
НПК спостерігається при відсутності несумісності за антигенами MHC, тобто у
випадку сингенних НПК, що відповідає даним дослідження Tarasoff-Conway J.M.
et al. (2015) [176] та підтверджує, що повна сумісність за антигенами МНС впливає
на виживання та проліферативний потенціал трансплантованих у мозок НПК.
У нашому дослідженні в місці введення на 12-у добу імплантовані НПК
прослідковуються вздовж пункційного ходу у вигляді дифузного скупчення
недиференційованих клітин. На 18-у добу спостереження введені алогенні НПК
виявляють ознаки початкового нейронального диференціювання; а у тварин з
імуносупресією циклоспорином А – фенотипового диференціювання різного
ступеня. Ми припускаємо, що надалі, до 37-ї доби, частина введених клітин гине, а
частина проходить шлях диференціювання за нейрональним чи гліальним
фенотипом, що відповідає даним досліджень морфологічних змін при
трансплантації НПК в інтактний мозок [148,149,180,291].
Встановлено імуноморфологічні кореляції при внутрішньомозковій імплантації
фетальних НПК: пік прояву та інтенсивність алоспецифічних імунних реакцій
корелює з інтенсивністю і тривалістю морфологічних змін. Отримані дані доводять,
що рівень експресії антигенів гістосумісності фетальними НПК є достатнім для
розвитку алоспецифічної клітинно-гуморальної імунної відповіді при
внутрішньомозковій імплантації.
Імуносупресивний препарат циклоспорин А гальмує ало- та аутоімунну
відповідь на введення алогенних фетальних та зрілих нейроклітин, що відповідає
даним Ideguchi M. et al. (2008) [180], проте повного пригнічення імунної відповіді
не виявлено при використанні триразового введення препарату (5 мг/кг). В умовах
імуносупресії циклоспорином А морфологічно виявляються ознаки фенотипового
356
диференціювання у нейрональному напрямку введених алогенних НПК та їх
інтеграції у тканину мозку реципієнтів. Крім того, імуносупресія циклоспорином А
сповільнює зниження ЧЩ незмінених нейронів та гальмує нарощування ЧЩ
гіперхромних і вакуолізованих нейронів у неокортексі мишей-реципієнтів
алогенних НПК, а також знижує ГІ, порівняно з тваринами без імуносупресії.
Отримані нами результати доводять, що застосування циклоспорину А дозволяє
частково запобігти імунозалежній втраті пересаджених алогених фетальних НПК.
У зв’язку з трансформацією останніми роками уявлень щодо механізмів дії
трансплантованих НСК/НПК з акцентом на т.зв. «bystander» ефекти [4,13,31-38,41-
43], тобто функціонального взаємообміну молекулярними сигналами з різними
типами клітин мікрооточення за рахунок вивільнення клітинних регуляторів
(морфогенів, нейротрофінів, цитокінів, хемокінів), наступну частину досліджень
ми присвятили вивченню властивостей гуморальних факторів - кондиційованого
середовища нейрогенних клітин (КСНК) фетального мозку щура in vitro та in vivo.
Дослідження імуномодулювальних властивостей КСНК фетального мозку
щура in vitro проведені у короткострокових культурах МНПК осіб групи контролю
та хворих з гліомами головного мозку. Встановлено, що КСНК значуще не впливає
на життєздатність МНПК осіб групи контролю. КСНК не впливає на експресію
антигенів гістосумісності І (HLA-А,В,С) та ІІ класу (HLA-DR) на протеїновому
рівні та виявляє здатність до позитивної модуляції експресії мРНК генів HLA-A1a
та HLA-DRa1 МНПК осіб групи контролю. КСНК суттєво не впливає на кількісні
показники (співвідношення диференційних та активаційних антигенів) МНПК осіб
групи контролю у короткострокових культурах, але має тенденцію до деякого
підвищення експресії антигенів CD-25, CD-56, CD-95.
Показано, що за умов впливу КСНК щура вміст TNF- в супернатантах
МНПК осіб групи контролю зменшується, а вміст IL-1 та IL-10 зростає. КСНК
виявляє властивість до позитивної модуляції експресії мРНК TGF- МНПК
людини. Ймовірно, КСНК щура запускає сигнальні каскади у МНПК осіб групи
контролю, спрямовані на обмеження ймовірного запального процесу, зменшуючи
продукцію TNF-, збільшуючи синтез IL-1 та активізуючи імуносупресивну
357
функцію (через збільшення продукції імуносупресивного цитокіна IL-10 та індукції
експресії мРНК іншого імуносупресивного цитокіна  TGF-).
Встановлено, що на більшість зразків МНПК хворих з гліомами КСНК не
впливає цитотоксично або впливає несуттєво. Також не виявлено значущого
впливу КСНК на експресію досліджуваних генів HLA МНПК хворих з гліомами ні
на протеїновому рівні, ні на рівні мРНК. Вплив КСНК на відносну кількість CD95+
клітин в суспензійних культурах у хворих з гліомами ІІ та ІІІ ступеня злоякісності
несуттєвий, тоді як кількість CD95+ МНПК у суспензійних культурах хворих з
гліобластомами має тенденцію до дозозалежного зростання. Вплив КСНК на
кількість апоптичних РІ+ клітин у короткострокових культурах МНПК хворих з
гліомами різноспрямований: виявлено тенденцію до зниження кількості РІ+ клітин
за впливу 0,02 мг/мл КСНК та збільшення  за впливу 0,10 мг/мл КСНК. Індекс
CD25+
/CD95+ у МНПК хворих з гліомами (відображає параметр
«утворення/елімінація» та свідчить про переважання одного із шляхів розвитку:
готовності до FAS-опосередкованого апоптозу чи проліферації і диференціювання)
за впливу КСНК щура суттєво не змінюється, тоді як індекс HLADR+
/CD95+
(відображає параметр «дозрівання/елімінація» та свідчить про переважання
готовності до FAS-опосередкованого апоптозу чи набуття пізнього
диференціювального антигену) виявляє тенденцію до підвищення у МНПК хворих
з гліомами ІІ та ІІІ ступеня злоякісності за впливу 0,02 мг/мл КСНК. У
суспензійних культурах МНПК хворих з гліобластомами після 24-год інкубації з
0,02 мг/мл КСНК активаційний індекс HLADR+
/CD95+
значуще зменшується.
В результаті досліджень продемонстровано здатність КСНК фетального
мозку щура впливати на функційні показники імуноцитів, змінюючи експресію
цитокінів на протеїновому рівні (TNF-, IL-10, IFN-) та на рівні мРНК (IFN-,
TGF-). За умов впливу КСНК щура в супернатантах МНПК хворих з гліомами
головного мозку зменшується вміст TNF- та IL-10. У хворих з гліомами 2 і 3
ступеня злоякісності виявлено тенденцію до підвищення вмісту IFN- у
супернатантах МНПК після інкубації з КСНК; у хворих з гліобластомами
спостерігається тенденція до зниження продукції IFN- МНПК. КСНК модулює
358
експресію мРНК IFN- та TGF- МНПК хворих з гліобластомами (переважає
тенденція до зниження експресії). Вочевидь, це обумовлено властивістю КСНК
(продукованих нейроклітинами фетального мозку біологічно активних молекул)
впливати на сигнальні каскади в клітині, які задіяні в процесах регуляції активності
відповідних генів цитокінів. Зниження експресії мРНК TGF-, а також зниження
продукції IL-10 МНПК хворих з гліомами головного мозку після впливу КСНК,
ймовірно, обумовлені тим, що КСНК активує сигнальні каскади в імуноцитах
хворих осіб, спрямовані на обмеження імуносупресивного фенотипу цих клітин і
переключення на прозапальний фенотип (продукція IFN- у випадку хворих з
гліомами ІІ і ІІІ ступеня злоякісності). У МНПК хворих з гліобластомами експресія
IFN- знижується як на рівні мРНК, так і на рівні продукції білка, що, ймовірно,
обумовлено ступенем молекулярно-генетичних змін, зокрема, пригніченнням генів,
залучених у активацію та внутрішньоклітинну передачу сигналу [301]. Можливість
за допомогою впливу КСНК знижувати рівень продукції МНПК хворих з гліомами
IL-10, а також експресії TGF-,  цитокінів, що беруть участь в механізмах, за
допомогою яких пухлина пригнічує дію імунної системи, на наш погляд, можна
розцінювати як таку, що може знайти своє подальше практичне застосування.
Також проведено дослідження впливу КСНК щура in vivo після
внутрішньоочеревинного введення на ЦА імуноцитів інтактних тварин стосовно
пухлинних клітин в алогенній і ксеногенній системах. Після 1-кратного введення
КСНК щура виявлено тенденцію до підвищення ЦА імуноцитів мишей СВА у
ксеногенній системі на 5  10-у добу експерименту. Збільшення кількості КСНК і
кратності його введення призводить до значущого зростання ЦА імуноцитів мишей
у цитотоксичному тесті з ксеногенними пухлинними клітинами гліоми 101.8 щура.
3-кратне внутрішньоочеревинне введення КСНК інтактним щурам підвищує ЦА
імуноцитів стосовно алогенних пухлинних клітин гліоми. Вочевидь, за умов
впливу КСНК у ефекторних клітинах імунної системи активуються сигнальні
каскади, які призводять до підвищення експресії антигенів МНС І класу та
компонентів механізму їх процесингу, що сприяє ефективному розпізнаванню
359
алогенних чи ксеногенних пухлинних клітин і, відповідно, до підвищення ЦА
імуноцитів.
При дослідженні впливу КСНК фетального мозку щура на клітини пухлин
головного мозку in vitro виявлено цитотоксичну дію КСНК у короткострокових
культурах гліом головного мозку людини стосовно 72,9 % досліджених зразків з
тенденцією до посилення із збільшенням концентрації від 0,02 до 0,10 мг/мл.
Втрата здатності до експресії молекул MHC та компонентів механізму
процесингу антигенів є однією з патогенетичних ланок розвитку онкологічних
захворювань [309,310]. При гліомах головного мозку, особливо злоякісних,
відбувається часткова або повна втрата експресії антигенів І та/або ІІ класу HLA
[310,311,317], зниження експресії транспортних молекул LMP2, TAP1 та 2-
мікроглобуліну [309], що є однією з причин відсутності протипухлинної активності
CD4
+ Т-лімфоцитів. За умов впливу КСНК спостерігається тенденція до
збільшення відносної кількості HLA-А,В,С+
та HLA-DR+
-клітин у суспензійних
культурах гліом ІІ та ІІІ ступеня злоякісності. Найбільш значуще КСНК впливає на
суспензійні культури гліобластом: підвищує відносну кількість HLA-А,В,С+
та
HLA-DR+
-клітин. КСНК модулює експресію мРНК генів HLA-A1a, HLA-DRa1,
HLA-DQb1, CIITA пухлинними клітинами гліом головного мозку (переважає
тенденція до появи або зростання їх експресії). Отже, складові КСНК фетального
мозку щура впливають на експресію антигенів гістосумісності безпосередньо
клітинами пухлин, що на нашу думку, може сприяти розпізнаванню клітин гліом та
індукції ефективної протипухлинної імунної відповіді, оскільки експресія антигенів
МНС є важливою як для реалізації процесу розпізнавання, так і для набуття
пухлинними клітинами таких властивостей, як туморогенність та імуногенність.
Водночас КСНК щура у концентрації 0,02 мг/мл демонструє тенденцію до
збільшення відносної кількості CD25+
-клітин у суспензійних культурах гліом ІІ
ступеня злоякісності, а у концентрації 0,10 мг/мл – до її зменшення. КСНК в обох
концентраціях виявляє тенденцію до збільшення відносної кількості CD25+
-клітин
у суспензійних культурах гліом ІІІ ступеня злоякісності. У культурах гліобластом
вміст CD25+
-клітин збільшується із зростанням концентрації КСНК. Чіткого
360
проапоптотичного впливу КСНК у короткострокових культурах гліом ІІ та ІІІ
ступеня злоякісності не виявлено. У короткострокових культурах гліобластом за
впливу обох досліджених концентрацій КСНК виявляється тенденція до
збільшення відносної кількості РІ+
-клітин та зростає частка CD95+
-клітин.
Зростання кількості клітин у термінальній стадії апоптозу (РІ+
) у суспензійних
культурах анапластичних астроцитом (за впливу 0,10 мг/мл КСНК) та гліобластом,
а також кількості CD95+
-клітин (FASR апоптозу) у суспензійних культурах
гліобластом, на нашу думку, може розцінюватись як показник позитивного
проапоптотичного впливу біопрепарату.
Нами продемонстровано здатність КСНК щура змінювати експресію
імуносупресивних цитокінів пухлинними клітинами гліом (TGF- IL-10), а також
тенденцію до збільшення продукції прозапальних цитокінів IFN- TNF- За умов
впливу КСНК клітини гліобластом підвищують продукцію IFN- та TNF-. КСНК
модулює експресію мРНК TGF- та IL-10 у пухлинних клітинах гліом головного
мозку: переважає тенденція до зниження їх експресії мРНК у пухлинних клітинах
гліом ІІ та ІV ступеня злоякісності після впливу КСНК. Отже, нами показано, що
клітини гліом головного мозку експресують цитокіни TGF- IL-10, TNF-за
допомогою яких, вочевидь здійснюється зареєстрований нами проапоптотичний
вплив пухлинних клітин гліом на клітини імунної системи. Складові КСНК
фетального мозку щура демонструють здатність змінювати експресію
імуносупресивних цитокінів пухлинними клітинами гліом (TGF- IL-10), а також
тенденцію до збільшення продукції прозапальних цитокінів IFN- TNF- Це,
вочевидь, обумовлено властивістю складових біоактивних молекул КСНК
впливати на сигнальні каскади в клітині, що задіяні в процесах регуляції активності
відповідних генів цитокінів. Збільшення продукції прозапальних цитокінів IFN-
TNF- пухлинними клітинами гліобластом після впливу КСНК, на нашу думку,
слід вважати позитивним чинником, що може призвести до запуску на
транскрипційному і трансляційному рівні плейотропних ефектів: підвищення
експресії антигенів МНС І та ІІ класу пухлинними клітинами, пригнічення
361
експресії генів ангіогенезу, зниження експресії FasL. Зменшення експресії
імуносупресивних цитокінів пухлинними клітинами гліом на рівні мРНК (TGF-
 IL-10) після впливу КСНК також потенційно може обмежити супресивний
вплив пухлини на імуноцити. В кінцевому рахунку такі зміни цитокінового
балансу мікросередовища пухлини можуть призвести до ефективного
розпізнавання та імунолізису пухлинних клітин ЦТЛ та ПК.
Після інкубації з КСНК щура в первинних культурах гліом людини
встановлено дозозалежний цитотоксичний та антипроліферативний вплив та
зниження мітотичного індексу.