КУБАЙЧУК КАТЕРИНА ІГОРІВНА. ERN1-ЗАЛЕЖНА РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ, ЩО КОНТРОЛЮЮТЬ АНГІОГЕНЕЗ, У КЛІТИНАХ ГЛІОМИ ЛІНІЇ U87

brief description

КУБАЙЧУК КАТЕРИНА ІГОРІВНА. Назва дисертаційної роботи: "ERN1-ЗАЛЕЖНА РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ, ЩО КОНТРОЛЮЮТЬ АНГІОГЕНЕЗ, У КЛІТИНАХ ГЛІОМИ ЛІНІЇ U87"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА
На правах рукопису
КУБАЙЧУК КАТЕРИНА ІГОРІВНА
УДК 577.112.7:616
ERN1-ЗАЛЕЖНА РЕГУЛЯЦІЯ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ, ЩО
КОНТРОЛЮЮТЬ АНГІОГЕНЕЗ, У КЛІТИНАХ ГЛІОМИ ЛІНІЇ U87
03.00.04 – біохімія
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
Мінченко Олександр Григорович
доктор біологічних наук, професор
Київ 2015
2
ЗМІСТ Стор
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 5
ВСТУП 8
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 15
1.1. Ангіогенез та його роль у фізіологічних і патологічних процесах в
організмі 15
1.2. Молекулярні механізми регуляції ангіогенезу 16
1.3. Молекулярні основи посилення ангіогенезу у злоякісних пухлинах 19
1.4. Роль стресу ендоплазматичного ретикулуму в активації ангіогенезу 22
25
25
28
30
1.5. Гени, що кодують синтез про-ангіогенних факторів, їх експресія та
функціональне значення
1.5.1. Ендотеліальний фактор росту судин/Vascular endothelial growth
factor (VEGF)
1.5.2. Родина епідермального фактору росту EGF (HB-EGF і EREG)
та EGF рецептор
1.5.3. PLAU та PLAU рецептор
1.5.4. FGF2 (fibroblast growth factor 2/ фактор росту фібробластів) 31
32
32
33
35
1.6. Гени, що кодують синтез анти-ангіогенних факторів, їх експресія та
функціональне значення
1.6.1. TIMP (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases/тканинний
інгібітор матриксних металопротеїназ)
1.6.2. TSR (thrombospondin repeat)-вмісна суперродина протеїнів
1.6.3. Протеїни позаклітинного матриксу
1.7. Гени про-ангіогенних та анти-ангіогенних факторів як мішені для
розробки анти-пухлинних препаратів 36
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 38
2.1. Реактиви та обладнання 38
3
2.2. Культура клітин та умови культивування 39
2.3. Вивчення проліфераційної здатності клітин 41
2.4. Вивчення експресії мРНК генів 41
2.4.1. Виділення РНК із клітин гліоми 41
2.4.2. Синтез комплементарних ДНК методом зворотної транскрипції
мРНК 42
2.4.3. Ампліфікація комплементарних ДНК методом полімеразної
ланцюгової реакції 43
2.4.4. Аналіз ампліфікованих фрагментів ДНК електрофорезом в
агарозному гелі 43
44
2.4.5. Вивчення експресії мРНК методом кількісної полімеразної
ланцюгової реакції у реальному часі
2.4.6. Метод визначення мРНК по їх гібридизації з антисенсовою РНК
і захисту гібриду від рибонуклеази Т1
49
2.5. Вестерн блот аналіз протеїнів 50
2.6. Статистична обробка результатів 52
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ 53
3.1. Експресія альтернативного сплайс-варіанта транскрипційного
фактора XBP1 у клітинах гліоми з пригніченою функцією ERN1 53
56
56
3.2. Експресія генів VEGF у клітинах гліоми з пригніченою функцією
ERN1
3.2.1. Вивчення експресії генів VEGF методом кількісної ПЛР у
реальному часі
3.2.2. Визначення рівня протеїну VEGF методом Вестерн блот аналізу 58
4
60
60
3.3. Експресія генів інших про-ангіогенних генів у клітинах гліоми з
пригніченою функцією ERN1
3.3.1. Вивчення експресії генів EREG, HB-EGF, EGFR, FGF2, TIMP1,
TIMP4, PLAU та PLAUR методом ПЛР у реальному часі
3.3.2. Визначення рівня протеїну TIMP1 методом Вестерн блот аналізу 62
63
63
3.4. Експресія анти-ангіогенних генів у клітинах гліоми з пригніченою
функцією ERN1
3.4.1. Вивчення експресії генів TIMP2, TIMP3, THBS1, THBS2, CTGF,
BAI2, SPARC та LUM методом ПЛР у реальному часі
3.4.2. Визначення рівня протеїну CTGF методом Вестерн блот аналізу 65
3.5. Експресія про-ангіогенних генів у клітинах гліоми за умов гіпоксії
та її залежність від функції ERN1 66
3.6. Експресія анти-ангіогенних генів у клітинах гліоми за умов гіпоксії
та її залежність від функції ERN1 81
3.7. Вплив дефіциту глюкози та глутаміну на експресію про-ангіогенних
генів у клітинах гліоми в залежності від функції ERN1 91
3.8. Вплив дефіциту глюкози та глутаміну на експресію антиангіогенних генів у клітинах гліоми в залежності від функції ERN1 107
РОЗДІЛ 4. ОБГОВОРЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ 118
ВИСНОВКИ 133
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ЛІТЕРАТУРНИХ ДЖЕРЕЛ 135
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ADAMTS5 – ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif,
5 (металопротеїназа ADAM типу 1 з мотивом 5)
ASK1 – apoptosis signal-regulating kinase 1 (апоптичний сигналрегулююча кіназа 1)
ATF6 – activating transcription factor 6 (фактор активації
транскрипції 6)
BAI2 – brain angiogenesis inhibitor 2 (нейрональний інгібітор
ангіогенезу)
BiP – binding immunoglobulin protein (протеїн, що зв’язує
імуноглобуліни)
CCN2 – connective tissue growth factor (кислий і багатий за
цистеїном протеїн, що секретується)
DLL4 – delta-like ligand 4 (Дельта-подібний ліганд 4)
EGFR – epidermal growth factor receptor (рецептор до
епідермального фактора росту)
EREG – еpiregulin (епірегулін)
ERN1 – endoplasmic reticulum to nuclei 1 (ендоплазматичний
ретикулум – ядро 1)
FGF2 – fibroblast growth factor 2 (фактор росту фібробластів 2)
GRP78 – 78 kDa glucose-regulated protein (глюкозо-регульований
протеїн)
HB-EGF – heparin-binding EGF-like growth factor (подібний до EGF
фактор росту, що зв’язує гепарин) або DTR – diphtheria
toxin receptor
6
HIF1 – hypoxia inducible factor-1 (фактор, що індукується за
гіпоксії-1)
HSPA5 – heat shock 70 kDa protein 5 (протеїн теплового шоку 5)
IRE-1α – inositol requiring enzyme-1α (залежний від інозитолу
ензим-1α)
LUM – lumican (люмікан)
NICD – notch intracellular domain (внутрішньоклітинний домен
Notch)
PDGFC – plateled derived growth factor C (фактор росту
тромбоцитів C)
PERK – PKR-like ER kinase (подібна до PKR кіназа
ендоплазматичного ретикулума)
PLAU – urokinase type plasminogen activator (активатор
плазміногену урокіназного типу)
PLAUR – urokinase type plasminogen activator receptor (рецептор до
активатору плазміногену урокіназного типу)
SPARC – secreted protein acidic and rich in
cysteine/osteonectin/BM40
THBS1 – thrombospondin-1 (тромбоспондін-1)
THBS2 – thrombospondin-2 (тромбоспондін-2)
TIMP1 – tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (тканинний інгібітор
металопротеїнази-1)
TIMP2 – tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (тканинний інгібітор
металопротеїнази-2)
TIMP3 – tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (тканинний інгібітор
металопротеїнази-3)
7
TIMP4 – tissue inhibitor of metalloproteinase-4 (тканинний інгібітор
металопротеїнази-4)
TRAF2 – TNF receptor associated factor 2 (фактор 2 асоційований з
TNF рецептором)
VEGFA – vascular endothelial growth factor А (фактор росту
ендотелію судин А)
VEGFB – vascular endothelial growth factor В (фактор росту
ендотелію судин В)
VEGFC – vascular endothelial growth factor С (фактор росту
ендотелію судин С)
ЕР – eндоплазматичний ретикулум
п.н.з. – пари нуклеотидних залишків
ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція
ХВР1 – X-box binding protein 1 (протеїн, що зв’язується з X-box)
ХВР1s – X-box binding protein 1 spliced (протеїн, що зв’язується з
X-box, сплайс-варіант)
8
ВСТУП
Актуальність теми. Дослідження механізмів регуляції ангіогенезу в
нормі та за патологічних процесів на молекулярному рівні є дійсно
актуальним напрямком фундаментальних біохімічних та інших медикобіологічних досліджень. Впродовж останніх років інтенсивно вивчаються
молекулярні механізми різного роду захворювань, до розвитку яких залучені
процеси патологічного росту кровоносних та лімфатичних судин, оскільки
інтенсивний неоангіогенез спостерігається як за пухлинного росту, так і
запальних процесах у тканинах, ретинопатіях, атеросклерозі, ревматоїдному
артриті, ендометріозі та ін. [1-4]. На даний час ці захворювання складають
одну з найголовніших проблем охорони здоров’я і їх розвиток, в першу
чергу, пов’язують з порушеннями механізмів регуляції росту судин [5].
Однією з найбільш актуальних проблем медико-біологічних наук є
вивчення розвитку злоякісних новоутворень на молекулярному і клітинному
рівнях та пошук нових методів для запобігання і/або лікування цих
патологічних станів, адже вони характеризуються високим ступенем
летальності. Ми вивчали експресію генів про-ангіогенних та антиангіогенних факторів і механізми їх регуляції у клітинах гліоми лінії U87,
оскільки гліоми є найбільш агресивними видами злоякісних пухлин [6 - 8].
Згідно зі статистичними даними American Brain Tumor Association, гліома
посідає друге та п’яте місце по летальності з онкологічних захворювань у
світі серед чоловіків та жінок відповідно.
Відомо, що у злоякісних пухлинах, за умов гіпоксії та дефіциту
поживних речовин, індукується адаптивна реакція для виживання клітин, яка
представляє собою комплекс внутрішньоклітинних сигнальних подій на
порушення згортання (фолдингу) протеїнів і їх накопичення у
ендоплазматичному ретикулумі. Ці протеїни сприймаються трьома сенсорносигнальними системами: активуючого транскрипційного фактора 6 (ATF6),
9
протеїнкінази ендоплазматичного ретикулуму (PERК) та ензиму ERN1
(сигналювання від ендоплазматичного ретикулуму до ядра 1), який ще
називають залежним від інозитолу ензимом-1α (IRE-1α) [9, 10]. Остання
сенсорно-сигнальна система є найбільш консервативною і ключовою
сигнальною системою стресу ендоплазматичного ретикулуму [11].
В нормі, сенсорний домен ERN1, що локалізований у люмені
ендоплазматичного ретикулуму, є зв’язаним з шаперонами, основним із яких
є BiP/GRP78/HSPA5, а ензиматичні домени (кінази та ендорибонуклеази)
знаходяться у цитоплазмі. Встановлено, що за умов накопичення не
згорнутих або неправильно згорнутих протеїнів у люмені ендоплазматичного
ретикулуму шаперони відходять від сенсорної ділянки ERN1, і це ініціює
його димеризацію і активацію сигнальної системи ERN1 [12, 13]. Активація
ERN1 ініціює альтернативний сплайсинг пре-мРНК транскрипційного
фактора XBP1 (X-box binding protein 1) та деградацію низки мРНК [14, 15].
Транскрипційний фактор XBP1, що утворився внаслідок трансляції сплайсваріанту мРНК XBP1s, контролює експресію великої групи регуляторних
генів [14 - 17]. Гени, експресія яких контролюється транскрипційним
фактором XBP1s, є відповідальними як за згортання протеїнів та посилення
виживання клітин в умовах гіпоксії, так і за їх деградацію шляхом апоптозу.
До таких генів належать і ті, що кодують фактори які контролюють
ангіогенез. В результаті індукції стресу ЕР, пухлина може проростати новими
кровоносними та лімфатичними судинами, що як відомо, є необхідною
умовою постачання до неї достатньої кількості кисню та поживних речовин
[18].
На моделі хоріон-алантоїсної мембрани ембріона курчати було
показано, що за умов пригнічення активності сенсорно-сигнального ензиму
ERN1 призводить до зниження розмірів пухлин утворених клітинами гліоми
та їх васкуляризації. Наступним логічним кроком було дослідити як саме
10
пригнічення активності ензиму ERN1 буде впливати на рівень експресії
генів, що залучені до процесів контролю ангіогенезу.
Група факторів, що забезпечують неоангіогенез є чисельною, але за
своїми біологічними ефектами ці фактори можна умовно розділити на
активатори ангіогенезу та інгібітори цього процесу. До про-ангіогенних
факторів можна віднести членів родини ендотеліального фактора росту
судин (VEGFA, B, C, PDGFC) [19], гепарин-зв’язуючий фактор росту,
фактора, подібного до епідермального фактора росту (HB-EGF), рецептор
епідермального фактора росту (EGFR, ERBB або HER1), епірегулін (EREG)
[20, 21], активатора плазміногену урокіназного типу (PLAU) та рецептора до
нього (PLAUR) [22], а також фактор росту фібробластів 2 (FGF2) [23]. Ці
гени кодують фактори, що здатні індукувати ріст судин різними шляхами і
сприяють розвитку злоякісних новоутворень. До анти-ангіогенних факторів
відносяться тканинні інгібітори матриксних металопротеїназ-2 і -3 (TIMP2,
TIMP3) [24], тромбоспондин (THBS) [25], металопротеїназа з
тромбоспондиновим мотивом (ADAMTS5) [26], нейональний інгібітор
ангіогенезу (BAI), фактор росту сполучної тканини (CTGF) [27], остеонектин
(SPARC) [28] та люмікан (LUM) [29]. Ця група факторів, на відміну від проангіогенних, відповідає переважно за пригнічення пухлинного росту.
Таким чином, дослідження експресії генів, що контролюють ангіогенез
у клітинах гліоми, за умов пригнічення опосередкованого ERN1 стресу
ендоплазматичного ретикулуму та вивчення молекулярних механізмів
регуляції експресії цих генів дозволить вияснити їх можливу роль у
злоякісному рості в залежності від функції сенсорно-сигнального ензиму
ERN1 і що може бути важливим для ідентифікації генів-мішеней та розробки
нових стратегій профілактики і лікування онкологічних захворювань.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційну роботу виконано на кафедрі біохімії ННЦ «Інститут біології» у
Київському національному університеті імені Тараса Шевченка
11
МОН України в рамках науково-дослідної теми «Механізми реалізації
адаптаційно-компенсаторних реакцій організму за умов розвитку різних
патологій» № д/р 0111U004648 (2011-2015 рр.) та у відділі молекулярної
біології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук
України протягом 2012-2015 років у рамках проведення планових досліджень
за бюджетними темами: «Молекулярні основи взаємодії генів в механізмах
регуляції їх експресії», № д/р 0111U002234 (2011-2015 рр.) та „Механізми
регуляції внутрішньоклітинних сигнальних мереж, міжклітинних та
міжмолекулярних взаємодій”, № д/р 0112U002624 (2012-2016 рр.).
Мета і задачі роботи. Метою дисертаційної роботи було дослідити
експресію генів про-ангіогенних та анти-ангіогенних факторів у клітинах
гліоми лінії U87 за умов пригнічення функції ERN1, основного сенсорносигнального ензиму стресу ендоплазматичного ретикулуму, а також за умов
гіпоксії та дефіциту глюкози або глутаміну у середовищі, для виявлення
можливої ролі цих генів в опосередкованому ERN1 контролі процесів
ангіогенезу та проліферації.
Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
1) Вивчити рівень експресії генів VEGF та інших про-ангіогенних генів
у клітинах гліоми лінії U87 з пригніченою функцією ERN1 .
2) Дослідити рівень експресії основних анти-ангіогенних генів у
клітинах гліоми з пригніченою функцією ERN1 .
3) Вивчити рівень експресії генів VEGF та інших про-ангіогенних генів
у клітинах гліоми лінії U87 за умов гіпоксії в залежності від функції
ERN1.
4) Дослідити рівень експресії анти-ангіогенних генів у клітинах гліоми
лінії U87 за умов гіпоксії в залежності від функції ERN1.
5) Вивчити вплив дефіциту глюкози та глутаміну на рівень експресії
генів VEGF та інших про-ангіогенних генів у клітинах гліоми лінії
U87 в залежності від функції ERN1.
12
6) Вивчити вплив дефіциту глюкози та глутаміну на рівень експресії
анти-ангіогенних генів у клітинах гліоми лінії U87 в залежності від
функції ERN1.
Об’єкт дослідження: механізми ERN1-опосередкованого ангіогенезу у
клітинах гліоми.
Предмет дослідження: рівень експресії генів про-ангіогенних та антиангіогенних факторів за умов гіпоксії та дефіциту глутаміну або глюкози у
клітинах гліоми лінії U87 в залежності від функції сигнального ензиму ERN1.
Методи дослідження: культивування клітин, виділення РНК із клітин,
спектрофотометричні методи визначення кількості РНК, електрофоретичний
аналіз нуклеїнових кислот, синтез комплементарних ДНК за допомогою
зворотної транскрипції, методи полімеразної ланцюгової реакції, в тому
числі кількісної полімеразної реакції, метод визначення мРНК по їх
гібридизації з антисенсовою РНК і захисту гібриду від дії рибонуклеази Т1 та
вестерн-блот аналіз, а також комп’ютерний аналіз результатів, отриманих за
допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції, і методи статистичної
обробки результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було показано, що
експресія генів VEGFA, VEGFB, VEGFC, PDGFC, EREG, HB-EGF, EGFR,
PLAU, PLAUR, FGF2, TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4, THBS1, THBS2, CTGF,
BAI2, SPARC та LUM, серед яких є як про-ангіогенні, так і анти-ангіогенні,
залежить від функціональної активності ERN1, сенсорно-сигнального ензиму
стресу ендоплазматичного ретикулуму, і зміни в їх експресії корелюють з
пригніченням росту пухлин гліоми з клітин без функціонально активного
ERN1. Встановлено також, що рівень експресії більшості про-ангіогенних
факторів, таких як VEGFA, VEGFB, VEGFC, EREG, HB-EGF, PLAU, PLAUR,
FGF2, TIMP1 та TIMP4, знижується у клітинах гліоми з пригніченою
функцією ензиму ERN1, а за умов відсутності глюкози або глутаміну
експресія більшості із них посилюється. В той же час, рівень експресії генів
13
анти-ангіогенних факторів TIMP2, TIMP3, THBS1, THBS2, CTGF, BAI2,
SPARC та LUM підвищується у клітинах з пригніченим ERN1, а за дефіциту
глюкози або глутаміну спостерігаються здебільшого протилежно направлені
зміни в їх експресії. Виявлено, що гіпоксія різнонаправлено впливає на
експресію як про-ангіогеннних, так і анти-ангіогеннних генів. Отримані
результати розкривають молекулярні механізми участі ключових
регуляторних протеїнів і факторів росту у процесах росту кровоносних
судин, а також механізми взаємодії ішемічних чинників (дефіцит глюкози і
глутаміну) та гіпоксії на одну з основних сигнальних систем відповіді на
стрес ендоплазматичного ретикулуму - ERN1.
Практичне значення роботи полягає в тому, що детальне вивчення
молекулярних механізмів регуляції ангіогенезу шляхом дослідження
експресії генів ключових факторів росту та їхніх рецепторів буде сприяти
виявленню перспективних генів-мішеней для розробки нових терапевтичних
стратегій пригнічення росту злоякісних пухлин. Крім того, отримані
результати вказують на взаємозв’язок гіпоксії, ішемічних чинників та
сигнальної системи стресу ендоплазматичного ретикулуму в регуляції
експресії генів, залучених до контролю ангіогенезу у пухлинах, що потрібно
враховувати при розробці стратегічних підходів до боротьби зі злоякісним
ростом.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота – завершене
дослідження, виконано автором відповідно до програми експериментальних
досліджень, спланованих і проведених протягом 2012-2015 років.
Дисертантом було самостійно виконано аналіз даних літератури за темою
роботи, проведено експериментальні дослідження по вивченню експресії
низки генів про-ангіогенних та анти-ангіогенних факторів, а також
статистичну обробку отриманих результатів. Дослідження, по вивченню
експресії мРНК частини генів, що контролюють ангіогенез у лінії клітин
гліоми людини проводились за участі к.мед.н. Мінченка Д.О., к.б.н.
14
Ратушної О.О., м.н.с. Даніловського С.В., провідних інженерів
Харькової А.П. та Кривдюк І.В., розробка методології, аналіз та обговорення
результатів проведені за участі наукового керівника, д.б.н., проф.
Мінченка О. Г.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було
представлено на вітчизняних та міжнародних з’їздах та конференціях: Х та
ХІІ Всеукраїнській науковій конференції студентів, аспірантів та молодих
науковців «Біологічні дослідження молодих вчених в Україні» (Київ, 2010 та
2012); ХI та XII міжнародній міждисциплінарній науково-практичній
конференції молодих вчених «Шевченківська весна» (Київ, 2011 та 2012); VІІ
Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та
поступ біології» (Львів, 2011); The 6th and 7th International Conference of Young
Naturalists. From Biotechnology to Environmental Protection. The
interdisciplinary meeting of young naturalists (Zielona Gora, Poland, 2011 and
2012); FEBS Workshop «Molecular and Cellular Mechanisms in Angiogenesis»
(Capri, Italy, 2012); IX Jakub K. Parnas Conference «Proteins from Birth to
Death» (Jerusalem, Israel, 2013); XVIIth Gliwice Scientific Meeting (Glivice,
Poland, 2013); 15th International EMBL PhD Symposium (Heidelberg, Germany,
2013); 1st International Symposium «Young researchers in BioSciences» (ClujNapoca, Romania, 2014); ХІ Український біохімічний конгресс (Київ, 2014).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 робіт, з них 8
статей (5 експериментальних та 3 оглядові), які опубліковані у іноземних та
вітчизняних наукових фахових виданнях, що індексуються
науковометричними базами даних і входять до переліку, затвердженого ДАК
України. А також 10 тез доповідей у матеріалах міжнародних та вітчизняних
з’їздів і конференцій

bibliography

ВИСНОВКИ
У даній дисертаційній роботі наведено нове рішення актуальної
наукової задачі щодо з’ясування ролі сенсорно-сигнального ензиму ERN1 в
експресії генів, що залучені до процесу росту судин (ангіогенезу), та їх
регуляції за гіпоксії і дефіциту глюкози чи глутаміну. Отримані результати
розширюють уявлення про участь про-ангіогенних та анти-ангіогенних генів
у ERN1-опосередкованому сигнальному шляху відповіді на стрес
ендоплазматичного ретикулуму. Наукове завдання вирішено шляхом
експериментального вивчення експресії генів, що контролюють ангіогенез, у
клітинах гліоми людини з пригніченою функцією ERN1 за умов гіпоксії та
дефіциту глюкози і глутаміну.
1. Встановлено, що рівень експресії генів основних про-ангіогенних
факторів VEGFA, VEGFB, VEGFC, EREG, HB-EGF, PLAU, FGF2, PLAUR,
TIMP1 і TIMP4 у клітинах гліоми знижується за умов пригнічення активності
сенсорно-сигнального ензиму ERN1.
2. Показано, що рівень експресії генів анти-ангіогенних факторів
TIMP2, TIMP3, THBS1, THBS2, CTGF, BAI2, SPARC та LUM зростає у
клітинах гліоми за умов пригнічення ензиму ERN1.
3. Встановлено, що гіпоксія посилює експресію генів про-ангіогенних
факторів VEGFA, VEGFB, VEGFC, PLAUR, EGFR та TIMP1 і знижує –
FGF2, PLAU, HB-EGF та EREG у клітинах гліоми з нативним ERN1, а
пригнічення активності ERN1 змінює чутливість експресії більшості генів до
гіпоксії.
4. Показано, що гіпоксія збільшує рівень експресії генів THBS1, TIMP2,
TIMP3 та CTGF і зменшує THBS2, LUM та SPARC у клітинах з
функціонально активним ERN1, а пригнічення активності ERN1 переважно
змінює ефект гіпоксії.
134
5. Встановлено, що за умов дефіциту як глюкози, так і глутаміну,
рівень експресії про-ангіогенних генів VEGF-A, FGF2, HB-EGF, EREG та
TIMP4 підвищується у клітинах гліоми з нативним ERN1, але пригнічення
активності ERN1 змінювало залежність експресії більшості про-ангіогенних
факторів під впливом цих чинників.
6. Показано, що за умов дефіциту глюкози та глутаміну посилюється
експресія генів TIMP2, TIMP, CTGF та BAI2 і знижується – гена SPARC та
THBS1 в обох сублініях клітин гліоми, але у клітинах без функціональної
активності ERN1 інтенсивність впливу цих чинників на експресію більшості
анти-ангіогенних факторів змінювалась, що свідчить про залежність
регуляції експресії цих генів від стресу ендоплазматичного ретикулуму,
опосередкованого сигнальним ензимом ERN1. ВИСНОВКИ
У даній дисертаційній роботі наведено нове рішення актуальної
наукової задачі щодо з’ясування ролі сенсорно-сигнального ензиму ERN1 в
експресії генів, що залучені до процесу росту судин (ангіогенезу), та їх
регуляції за гіпоксії і дефіциту глюкози чи глутаміну. Отримані результати
розширюють уявлення про участь про-ангіогенних та анти-ангіогенних генів
у ERN1-опосередкованому сигнальному шляху відповіді на стрес
ендоплазматичного ретикулуму. Наукове завдання вирішено шляхом
експериментального вивчення експресії генів, що контролюють ангіогенез, у
клітинах гліоми людини з пригніченою функцією ERN1 за умов гіпоксії та
дефіциту глюкози і глутаміну.
1. Встановлено, що рівень експресії генів основних про-ангіогенних
факторів VEGFA, VEGFB, VEGFC, EREG, HB-EGF, PLAU, FGF2, PLAUR,
TIMP1 і TIMP4 у клітинах гліоми знижується за умов пригнічення активності
сенсорно-сигнального ензиму ERN1.
2. Показано, що рівень експресії генів анти-ангіогенних факторів
TIMP2, TIMP3, THBS1, THBS2, CTGF, BAI2, SPARC та LUM зростає у
клітинах гліоми за умов пригнічення ензиму ERN1.
3. Встановлено, що гіпоксія посилює експресію генів про-ангіогенних
факторів VEGFA, VEGFB, VEGFC, PLAUR, EGFR та TIMP1 і знижує –
FGF2, PLAU, HB-EGF та EREG у клітинах гліоми з нативним ERN1, а
пригнічення активності ERN1 змінює чутливість експресії більшості генів до
гіпоксії.
4. Показано, що гіпоксія збільшує рівень експресії генів THBS1, TIMP2,
TIMP3 та CTGF і зменшує THBS2, LUM та SPARC у клітинах з
функціонально активним ERN1, а пригнічення активності ERN1 переважно
змінює ефект гіпоксії.
134
5. Встановлено, що за умов дефіциту як глюкози, так і глутаміну,
рівень експресії про-ангіогенних генів VEGF-A, FGF2, HB-EGF, EREG та
TIMP4 підвищується у клітинах гліоми з нативним ERN1, але пригнічення
активності ERN1 змінювало залежність експресії більшості про-ангіогенних
факторів під впливом цих чинників.
6. Показано, що за умов дефіциту глюкози та глутаміну посилюється
експресія генів TIMP2, TIMP, CTGF та BAI2 і знижується – гена SPARC та
THBS1 в обох сублініях клітин гліоми, але у клітинах без функціональної
активності ERN1 інтенсивність впливу цих чинників на експресію більшості
анти-ангіогенних факторів змінювалась, що свідчить про залежність
регуляції експресії цих генів від стресу ендоплазматичного ретикулуму,
опосередкованого сигнальним ензимом ERN1.