ПАСТИРЯ АННА СЕРГІЇВНА МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВИЯВЛЕНИХ В УКРАЇНІ ІЗОЛЯТІВ ВІРУСУ ІНФЕКЦІЙНОЇ БУРСАЛЬНОЇ ХВОРОБИ

brief description

Київський національний університет імені Тараса Шевченка Міністерство освіти і науки України Київський національний університет імені Тараса Шевченка Міністерство освіти і науки України Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису ПАСТИРЯ АННА СЕРГІЇВНА УДК: 575.52+616-079.4 ДИСЕРТАЦІЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВИЯВЛЕНИХ В УКРАЇНІ ІЗОЛЯТІВ ВІРУСУ ІНФЕКЦІЙНОЇ БУРСАЛЬНОЇ ХВОРОБИ 03.00.06 вірусологія Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей, результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело ____________ А.С. Пастиря Науковий керівник: Будзанівська Ірина Генадіївна, доктор біологічних наук, професор Київ 2019

ЗМІСТ
Стор
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКРОЧЕНЬ______________________________ 16
ВСТУП______________________________________________________ 18
РОЗДІЛ 1.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВІРУСУ ІНФЕКЦІЙНОЇ
БУРСАЛЬНОЇ ХВОРОБИ ______________________________________ 25
1.1. Систематичне положення, структура та генетична організація
вірусу інфекційної бурсальної хвороби ___________________________ 25
1.2. Характеристика білків вірусу інфекційної бурсальної хвороби ____ 27
1.3. Особливості патологічного впливу вірусу ІБХ __________________ 31
1.3.1. Молекулярно-генетичні детермінанти вірулентності вірусу ІБХ _ 31
1.3.2. Механізми патогенезу та імуносупресивний ефект вірусу ІБХ ___ 33
1.3.3. Клінічні ознаки інфекційної бурсальної хвороби ______________ 36
1.3.4. Патотипи вірусу інфекційної бурсальної хвороби та
характеристика уражень, які вони викликають _____________________ 37
1.4. Особливості імунної відповіді на вірус ІБХ ____________________ 39
1.5. Генетичні передумови штамового різноманіття вірусу ІБХ _______ 40
1.6. Методи діагностики вірусу ІБХ ______________________________ 42
1.7. Загальна характеристика вакцин проти вірусу інфекційної
бурсальної хвороби ___________________________________________ 46
1.7.1. Особливості живих атенуйованих та інактивованих вакцин ____ 46
1.7.2. Характеристика субодиничних вакцин_______________________ 48
1.7.3. Властивості імунокомплексних вакцин______________________ 49
1.7.4. Характеристика ДНК-вакцин_______________________________ 50
1.7.5. Особливості векторних вакцин_____________________________ 51
РОЗДІЛ 2. ОБ’ЄКТИ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ___ 53
2.1. Об’єкт дослідження та його характеристика ___________________ 53
2.1.1. Загальна характеристика об’єкту дослідження ________________ 53
14
2.1.2. Аналіз морфолого-патологічного стану уражених курей та відбір
зразків для молекулярно-біологічних та гістологічних досліджень_____ 54
2.2 Реактиви, матеріали та обладнання, що були використані у роботі__ 56
2.3. Серологічні методи дослідження. Імуноферментний аналіз _______ 59
2.3.1. Приготування реагентів та зразків __________________________ 59
2.4. Молекулярно-біологічні методи дослідження вірусу інфекційної
бурсальної хворо _____________________________________________ 61
2.4.1. Підбір праймерів для проведення ПЛР_______________________ 61
2.4.2. Виділення РНК та ДНК з патологічного матеріалу_____________ 61
2.4.3. Проведення реакції зворотньої транскрипції__________________ 63
2.4.4. Проведення гніздової полімеразної ланцюгової реакції_________ 64
2.4.5. Проведення рестрикційного аналізу ампліфікованих
послідовностей кДНК _________________________________________ 66
2.4.6. Проведення електрофоретичного аналізу продуктів реакцій в
агарозному гелі_______________________________________________ 67
2.4.7. Очищення ампліфікатів з агарозного гелю____________________ 67
2.5. Секвенування нуклеїнової кислоти та філогенетичний аналіз ______ 68
2.5.1. Побудова філогенетичних дерев з використанням нуклеотидних
послідовностей за допомогою програми MEGA 6 ___________________ 68
2.6. Гістологічні методи дослідження змін, викликаних вірусом
інфекційної бурсальної хвороби _________________________________ 69
2.6.1. Виготовлення гістологічних зразків тканин бурс ______________ 69
2.6.2. Мікроскопічний аналіз гістологічних препаратів______________ 71
2.7. Статистична обробка даних _________________________________ 71
РОЗДІЛ 3. СЕРОЛОГІЧНИЙ МОНІТОРИНГ ПОШИРЕННЯ ВІРУСУ
ІНФЕКЦІЙОЇ БУРСАЛЬНОЇ ХВОРОБИ В ГОСПОДАРСТВАХ УКРАЇНИ В
ПЕРІОД З 2014 ДО 2016 РОКІВ _________________________________ 72
15
РОЗДІЛ 4. ВИЯВЛЕННЯ ТА ІДЕНТИФІКАЦІЯ ВІРУСУ ІБХ ЗА
ДОПОМОГОЮ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ ТА
ГІСТОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ ___________________________________ 76
4.1. Характеристика праймерів, які застосовували для проведення ПЛР
метою виявлення вірусу ІБХ ____________________________________ 76
4.2. Виявлення РНК вірусу ІБХ методом гніздової ПЛР ______________ 81
4.3. Виявлення патоморфологічних змін у лімфоїдній тканинні бурс
курей викликаних різними вакцинними та польовими штамами вірусу
ІБХ _________________________________________________________ 82
РОЗДІЛ 5. ВИЗНАЧЕННЯ ШТАМОВОГО РІЗНОМАНІТТЯ ВІРУСУ
ІБХ МЕТОДОМ РЕСТРИКЦІЙНОГО АНАЛІЗУ ___________________ 89
РОЗДІЛ 6. ФІЛОГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ ШТАМІВ ВІРУСУ ІБХ
ПОШИРЕНИХ В УКРАЇНІ _____________________________________ 97
6.1. Аналіз філогентичних зв’язків різних штамів вірусу ІБХ _________ 97
6.2. Філогенетичний аналіз вакцинних та польових штамів вірусу ІБХ__
6.3. Дослідження амінокислотних послідовностей гіперваріабельного
регіону гену VP2 вакцинних та польових штамів вірусу ІБХ __________
101
105
УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ_______________________________ 109
ВИСНОВКИ_________________________________________________ 119
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ___________________________ 121
ДОДАТОК А ________________________________________________ 139

bibliography

ВИСНОВКИ
На основі проведених досліджень охарактеризовано молекулярнобіологічні особливості ізолятів вірусу інфекційної бурсальної хвороби (ІБХ)
на території України, що дозволить здійснювати правильний підбір схеми
вакцинації для профілактики захворювання у місцях промислового
вирощування птиці.
1. Вперше показано широке розповсюдження вірусу ІБХ на території
України. Згідно з даними серологічного скринінгу сироваток крові,
відібраних від курей із 83 спеціалізованих господарств, 96,78% зразків були
позитивними на антитіла до вірусу ІБХ.
2. Показано, що польові високовірулентні ізоляти вірусу ІБХ, виявлені
в Україні, спричиняють специфічні зміни в тканинах бурси, які
супроводжуються крововиливами та лімфоцитарними інфільтратами у
міжфолікулярний простір, що дозволяє диференціювати поствакцинальну та
постінфекційну реакцію, викликану вірусом ІБХ.
3. Встановлено, що високовірулентні ізоляти вірусу інфекційної
бурсальної хвороби характеризувались наявністю унікального сайту
рестрикції SspI та відсутністю сайту BstEII. Це дає можливість
диференціювати їх від вакцинних штамів вірусу ІБХ.
4. У ході дослідження було розшифровано нуклеотидну послідовність
гіперваріабельного регіону гену VP2 ізолятів вірусу ІБХ, виявлених в
Україні, а також вакцинних штамів вірусу, що розширило базу для
порівняння генетичних особливостей вірусу ІБХ, виявленого в різних
регіонах.
5. За результатами філогенетичного аналізу доведено гетерогенність
ізолятів вірусу ІБХ. 50% польових ізолятів вірусу ІБХ були філогенетично
спорідненими із високовірулентними штамами, тоді як решта 50% були
близькі до класичних вірулентних штамів вірусу ІБХ.
121
6. Показано, що польові штами із різним ступенем вірулентності
групуються у відповідності до генетичної спорідненості із вакцинними
штамами, які належать до різних груп за ступенем залишкової вірулентності,
що дає можливість використовувати метод філогенетичного аналізу для
підбору найбільш ефективних схем вакцинації в господарствах України.
7. Результати аналізу консенсусних амінокислотних послідовностей
співпадають із даними філогенетичного аналізу та підтверджують
високовірулентну природу польових ізолятів вірусу ІБХ, виявлених в
Україні.