Стратегия повышения вирусной безопасности компонентов донорской крови Туполева Татьяна Алексеевна

brief description

Туполева Татьяна Алексеевна. «Стратегия повышения вирусной безопасности компонентов донорской крови»: диссертация ... доктора Медицинских наук: 14.01.21 / Туполева Татьяна Алексеевна;[Место защиты: ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2019
Стратегия повышения вирусной безопасности компонентов донорской крови Туполева Татьяна Алексеевна
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
доктор наук Туполева Татьяна Алексеевна
Введение

Основная часть

Глава 1. Обзор данных литературы. Вирусные гепатиты В и С

1.1 Вирусы, вызывающие гепатит у человека

1.2 Вирус гепатита В

1.3 Вирус гепатита С

1.4 Лабораторная диагностика вирусных инфекций

1.4.1 Иммуноферментный анализ (ИФА)

1.4.2 Иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА)

1.4.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1.5. Частная вирусологическая диагностика

1.5.1 Лабораторная диагностика вирусного гепатита В

1.5.2 Лабораторная диагностика вирусного гепатита С

1.6 Риск трансфузионного инфицирования ВГВ и ВГС

1.7. Латентные формы вирусных гепатитов

1.7.1. Латентная форма вирусного гепатита В (ЛГВ)

1.7.2. Латентная форма вирусного гепатита С (ЛГС)

1.8. Вирусные гепатиты у пациентов с заболеваниями системы крови

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Дизайн исследования

2.2. Материал исследования

2.3. Методы исследования

2.4. Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты

3.1. Разработка требований к обеспечению качества ПЦР-исследований

3.2 Лабораторные факторы риска неполного выявления инфицированных вирусами гепатитов В и С компонентов крови доноров

3.3.Скрининг образцов крови доноров на анти-НВс как инструмент повышения безопасности трансфузий

3.4 Построение математических моделей и расчет эпидемиологических показателей по результатам проспективного исследования

3.5 Лабораторные маркеры вирусов гепатитов у пациентов с заболеваниями системы крови

3.6 Проведение эпидемиологического расследования случаев возможного инфицирования реципиента компонентов донорской крови вирусом гепатита В и/или С

Обсуждение

Заключение

Выводы

Список сокращений

Список литературы

Приложения

Приложение

Приложение

Приложение

Введение

bibliography

Вирус гепатита В
Начало современного периода изучения вирусного гепатита В связано с обнаружением в 1965 г. поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) основного маркера вирусного гепатита В [108]. За это открытие американский исследователь Б. Бламберг получил Нобелевскую премию в 1976 г. [215]. Принципиально новая информация об этом заболевании была получена после обнаружения Д. Дейном в 1970 г. непосредственно возбудителя гепатита В (частицы Дейна) и его дальнейшего исследования.
ВГВ принадлежит к семейству Hepadnaviridae. Это -- гепатотропные ДНК-вирусы, способные заражать млекопитающих и обмениваться с хозяином большинством генетических структур [315]. ВГВ -- наименьший из всех ДНК-содержащих вирусов, поражающих человека, имеет очень компактный геномом [178].
Вирионы имеют сферическую форму, их диаметр 42 нм, обладают липидной оболочкой, которая содержит поверхностный протеин - HBsAg (австралийский антиген) [107], состоящий из полипептидов Pre-S1, Pre-S2 и S (рисунок 1).
Pre-S регионы HBsAg выполняют важные функции. Pre-S1 распознается рецепторами гепатоцита, недавно определен основной рецептор для крепления Pre-S1 [403]. К Pre-S1 вырабатываются вируснейтрализующие антитела, нарушение их синтеза способствует хронизации инфекции. Антитела к Pre-S2 могут иметь значение для элиминации вируса. В зависимости от размера области Pre-S HBsAg называют L (Pre-S1, Pre-S2 и S), M (Pre-S2 и S) и S. Количество молекул L, M и S в оболочке вирионов снижается в порядке нарастания их величины. Основой дрожжевых вакцин является S-белок [400]. Белок оболочки содержит основную группоспецифическую антигенную детерминанту а. Он также содержит две дополнительные субдетерминанты d/y и w/r. Таким образом, в результате их комбинации образуются следующие 4 антигенных фенотипа: adw, adr, ayw, ayr. Именно с антителами к групповой детерминанте , в основном, связаны протективные свойства [243].
Для вакцинопрофилактики существенное практическое значение имеют варианты вируса с мутациями антигенных детерминант, которые не нейтрализуются антителами к обычному антигену [34]. К изменениям последовательностей аминокислот в HBsAg и, как следствие, конформационным изменениям детерминанты (рисунок 2), приводят замены в S-гене, что влияет на характер взаимодействия с нейтрализующими антителами [393].
Вирусные штаммы, несущие такие замены, могут не детектироваться некоторыми коммерческими наборами реагентов. Продуктом участка S-гена между 124-147 позицией аминокислотных остатков является детерминанта, которая формирует 3 петли, удерживающиеся цистеиновыми мостиками [29].
При ВГВ-инфекции помимо инфекционных частиц (частиц Дейна) в большом количестве синтезируются структуры HBsAg сферические и филаментозные (рисунок 3) [204]. Они лишены ДНК ВГВ и нуклеокапсида (core-частиц), имеют размер от 17 до 25 нм (в среднем 20 нм), и число их более чем в 100 раз превышает число вирионов (в 103-105 раз при концентрации вируса в крови 50-300 мг/мл) [185].
Подобно оболочке, нуклеокапсид вируса состоит из единственного структурного протеина С (core). Этот белок способен самостоятельно структурироваться в икосаэдр. Обычно нуклеокапсид содержит вирусную нуклеиновую кислоту и обратную транскриптазу, а также белки-шапероны хозяина, в том числе белок теплового шока 90 [219]. Обратная транскрипция, в процессе которой синтезируется цепь ДНК на матрице вирусной РНК, происходит в цитоплазме пораженного гепатоцита. Таким образом, незрелые нуклеокапсиды содержат вирусную РНК, а в зрелом капсиде РНК заменена путем обратной транскрипции на ДНК. Обратная транскриптаза сохраняется в течение всего периода созревания нуклеокапсида вириона и может играть определенную роль в завершении формирования двух-цепочечной вирусной ДНК во время начала нового раунда инфекции.
В течение многих лет считалось, что pre-core образуется в результате посттрансляционной модификации и выделяется из зараженной клетки в виде растворимого белка, называемого HBeAg, который легко обнаруживается при помощи серологического анализа [266, 295, 298]. Наличие HBeAg являлось характерным маркером активной репликации вируса. В то же время, HBeAg не является существенным для вирусной репликации, и мутации, которые блокируют pre-core трансляцию и синтез HBeAg, не являются редкостью у хронических носителей. Если носители ВГВ перестают экспрессировать HBeAg, они могут продолжать продуцировать вирус [280]. Многие пациенты, у которых HBeAg уже не выявляется в крови, по-прежнему, страдают от прогрессирующего хронического гепатита В, поскольку вирус может быть не подвержен иммунному действию T- и B-клеток даже в отсутствие HBeAg [189].
Организация генома. Гепаднавирусы имеют частично двухцепочечный ДНК-геном (примерно 3 200 пар оснований), который организован в кольцо с помощью короткого, сплоченного перекрытия между 5 -концами двух нитей. Геном содержит четыре частично перекрывающиеся открытые рамки считывания, что обеспечивает его высокую информационную емкость: pre-S/S, pre-C/C, P и X (рисунок 4).
Три поверхностных белка вируса кодируются открытой рамкой считывания рre-S/S: L, M и S, которые соответствуют HBsAg. Открытая рамка считывания рrе-C/C кодирует ядерный антиген (HBcAg) и растворимый антиген е (HBeAg). Вирусная полимераза, кодируемая геном Р одновременно с терминальным белком, обладает ДНК-полимеразной активностью, обратной транскриптазной активностью и активностью РНК-азы Н. Еще одна открытая рамка считывания кодирует регуляторный X белок [186].
Ряд исследователей [95, 100, 114, 127, 128, 142, 157, 175, 177, 179, 220, 237, 249, 361, 372, 380] предполагает, что Х белок за счет воздействия на многие внутриклеточные процессы может влиять на выживаемость клеток, а также репликацию вируса. Экспрессия данного гена необходима для эффективной репликации вируса и в культуре клеток [115, 351, 401], хотя не все исследования подтвердили это наблюдение [106]. Показано, что ген Х повышает опухолевую инвазию клеток куриного эмбриона как in vivo, так и in vitro путем индукции экспрессии циклооксигеназы-2 с последующей активацией 1 матричной металлопротеиназы мембранного типа [247]. Ген Х повышает метастатический потенциал опухолевых клеток, увеличивая их способность разрушать внеклеточный матрикс, прохождение через эндотелиальный барьер и выход в кровяное русло.
Изучен контроль экспрессии вирусных генов ВГВ при использовании линий клеток как печеночного, так и внепеченочного происхождения [274, 371]. ВГВ человека хорошо реплицируются в клеточных линиях печени, в том числе HepG2 [191] и LMH [200], в отличие от клеточных линий внепеченочного происхождения, где репликация не происходит. Гепатотропность ВГВ связана с наличием в клетках печени факторов транскрипции, особо важных для транскрипции именно прегеномной матричной РНК [368], единственной вирусной РНК, необходимой для репликации генома. В результате культуральных исследований был сделан вывод, что репликация ВГВ происходит в гепатоцитах. Другие типы клеток могут быть инфицированы, но в них не происходит репликация вируса до образования ДНК в обнаруживаемых концентраций. Кроме того, нет доказательств того, что патологические изменения других тканей являются результатом инфицирования ВГВ [176].
Латентная форма вирусного гепатита В (ЛГВ)
Естественное течение хронического гепатита В схематично делится на пять необязательно последовательных фаз: фаза иммунной толерантности; иммуноактивная HBeAg-позитивная фаза; неактивное носительство вируса гепатита В (ВГВ); HBeAg-негативная фаза; HBsAg-негативная фаза [160]. Последняя из них ЛГВ при которой отсутствуют клинические проявления заболевания. Согласно мнению экспертов, ЛГВ это «наличие вирусной ДНК в печени (независимо от присутствия ДНК ВГВ в сыворотке крови) у HBsAg-негативных лиц» [325]. Таким образом, эта «фаза» с низким уровнем репликации ВГВ, когда ДНК ВГВ выявляется в печени в низких концентрациях ( 200 МЕ/мл) и может не обнаруживаться в сыворотке, в то время как могут присутствовать антитела к ядерному белку (анти-НВс) и/или поверхностному (анти-HBs) белку ВГВ [325].
Интерес к проблеме ЛГВ возник с момента открытия инфекционной природы «сывороточного» гепатита, но стал центральным вопросом гепатологии только в 1999 г., после опубликования результатов тестирования геномов ВГВ в биоптатах печени от большого числа HBsAg-негативных пациентов с хроническими заболеваниями печени. Это исследование показало, что ЛГВ может ускорять прогрессию цирроза у больных хроническим вирусным гепатитом С. Кроме того, латентное течение вирусного гепатита В не связано с наличием генетических мутаций ВГВ [122]. Однако существует и противоположное мнение, что наличие ЛГВ может быть связано как с массовой вакцинацией, так и с мутациями в S-гене [392].
Растущий интерес к проблеме ЛГВ наглядно представлен на рисунке 15, где ключевым моментом в изучении ЛГВ является 1999 г. [327]. За последующие пятнадцать лет стало известно [33, 238, 268], что ЛГВ обусловлена подавлением репликативной активности вируса, причем причины такого подавления еще не до конца выяснены, но очевидно, что в этот процесс вовлечены иммунный надзор и эпигенетические механизмы хозяина, а иммуносупрессивные состояния (в основном на фоне иммуносупрессивной или химиотерапии) приводят к его реактивации и развитию острого гепатита. ЛГВ может способствовать прогрессии фиброза, цирроза печени и развитию гепатоцеллюлярной карциномы. С другой стороны, ЛГВ сохраняет большую часть прямых трансформирующих свойств явной ВГВ-инфекции, например, способность интегрироваться в геном хозяина и синтезировать про-онкогенные белки [327].
В ряде случаев HBsAg невозможно выявить с помощью коммерческих тест-систем, несмотря на наличие эписомальных, свободных геномов ВГВ на внутрипеченочном уровне, либо за счет генетически измененных вариантов ВГВ в гене S и нарушения синтеза S белков (S-ускользающих мутантов), либо за счет мутаций ВГВ с повреждением репликативной активности [330]. В большинстве случаев ЛГВ вызвана вирусом, геномы которого репликативно компетентны и сопоставимы с генетической гетерогенностью изолятов вируса от лиц с HBsAg-позитивной инфекцией [314]. Считается, что ЛГВ является следствием сильного подавления репликации ВГВ и экспрессии его генов за счет других механизмов, а не мутаций. Прежде чем обсуждать эти механизмы, важно учитывать, что ЛГВ часто связана с наличием антител к белкам ВГВ (ядерному и поверхностному: анти-НВс и анти-НВs), но более чем у 20% лиц с латентным течением инфекции отсутствуют все маркеры ВГВ в сыворотке крови [375]. В соответствии с вышеизложенным, можно выделить серопозитивный (анти-НВс и/или анти-HBs положительный) и серонегативный (анти-HBc и анти-HBs отрицательные) варианты ЛГВ. При серопозитивной форме ЛГВ HBsAg может перестать определяться либо после быстрого разрешения острой формы инфекции, или через много лет хронической ВГВ-инфекции. При серонегативной форме ЛГВ все маркеры ВГВ либо постепенно перестают детектироваться, либо отсутствуют с начала инфекции, что было подтверждено в эксперименте на сурках [314]. Таким образом, ЛГВ развивается по сложному сценарию с различными вирусологическими и иммунологическими профилями.
В настоящее время нет доступных экспериментальных систем для адекватного изучения ВГВ-инфекции комплексного события, характеризующегося наличием различных и часто нестабильных фаз [159]. И хотя наши знания ограничены, существует много свидетельств, что именно факторы хозяина вовлечены в индукцию и поддержание латентных форм. Еще одно доказательство этого исследование in vitro, показавшее, что изоляты ВГВ, выделенные из ткани печени больного ЛГВ, полностью восстанавливают репликацию, транскрипцию и синтез белков в культуре клеток [314]. Многочисленные клинические исследования [375, 389, 420] показали, что любые условия, вызывающие иммуносупрессию (гематологические злокачественные новообразования, химио- или иммунотерапия и т.д.), могут спровоцировать реактивацию ЛГВ с появлением типичного серологического профиля активной инфекции. Этого достаточно для утверждения о причастности иммунного надзора организма больного к развитию ЛГВ. Кроме того, CD4 и CD8 клеточные ответы длительной памяти против антигенов ВГВ обнаруживаются и через несколько лет после выздоровления от острого гепатита В. В латентной фазе инфекции вирус синтезирует незначительное количество антигенов, которые не обнаруживаются с помощью имеющихся лабораторных методов, но их достаточно для поддержания ВГВ-специфического Т-клеточного ответа [302, 335]. В печени у лиц с латентной формой инфекции обнаружены как молекулы ковалентно замкнутой кольцевой ДНК и значительные количества матричной РНК ВГВ, так и все вирусные транскрипты [273, 316, 399]. Следовательно, клиническое разрешение болезни свидетельствует не о полной эрадикации ВГВ, а лишь о способности иммунной системы пациента держать под контролем репродукцию вирусов, оставшихся в печени [327].
У пациентов с ЛГВ отображаются разные профили ВГВ-специфического Т-клеточного ответа в зависимости от наличия или отсутствия анти-НВс [417]. Циркулирующие ВГВ-специфические Т-клетки обнаружены у серонегативных (анти-HBc отрицательных) и серопозитивных (анти-HBc положительных) пациентов с латентной формой инфекции в сравнимых количествах, но продукция интерферона этими клетками у серонегативных значительно слабее, чем у серопозитивных лиц. Доказательства получены в эксперименте на сурках [285], и была выдвинута гипотеза, что эти особенности клеточно-опосредованных иммунных реакции у серопозитивных и серонегативных пациентов с ЛГВ отражают различные механизмы передачи ВГВ. На той же модели показано, что воздействие низкой заражающей дозы ( 103 вирионов) приводит к хронической инфекции при отсутствии вирусных маркеров в сыворотке крови. У сурка с первично латентной формой ВГВ-инфекцией не формировался защитный иммунитет. Авторы [285] предположили, что T-клеточный ответ генерируется только после инфицирования более высокими дозами вируса. Исследование ВГВ-специфического иммунного ответа у доноров крови с латентной формой гепатита В в значительной степени подтвердило это наблюдение: зафиксирован мощный, ВГВ-мультиспецифический Т-клеточный ответ, причем количественно сильнее, чем у неактивных носителей и даже у пациентов с разрешившейся формой заболевания [101]. Эти данные привели к выводу, что иммунная система хозяина может подавлять репликацию ВГВ, что объясняет очень низкую, в ряде случаев невыявляемую, вирусную нагрузку и отсутствие обнаруживаемого HBsAg [101]. Соответствующие доказательства роли иммунной системы хозяина в управлении латентной ВГВ-инфекцией получены в исследованиях у ВИЧ-инфицированных пациентов [148]. У этих пациентов ВГВ-виремия в значительной степени связана с малым количеством CD4. У пациентов, имеющих более 500 CD4 клеток/мм3, не наблюдали латентного течения вирусного гепатита В. Таким образом, дефицит клеточного иммунитета, обусловленный снижением количества CD4 клеток при ВИЧ-инфекции, может привести к потере контроля над активностью ВГВ и активации репликации вируса до обнаруживаемых значений. Исследование экспрессии цитокинов у ВИЧ-инфицированных лиц с ЛГВ показало снижение количества интерлейкинов 8 и 10, секреторных вариантов рецепторов Fas и FasL [270]. Поскольку при латентном течении инфекции значительно снижены секреторные варианты рецепторов Fas, следовательно, понижено и ингибирование апоптоза, который, в свою очередь, ответственен за частичный клиренс вируса [270]. Не только адаптивный, но и врожденный иммунный ответ может играть роль в контроле вирусной репликации. Эксперименты на трансгенных мышах и шимпанзе [199] показали, что воспалительные цитокины, такие как интерферон типа 1 и фактор некроза опухолей , могут эффективно подавлять репликацию вируса через нецитотоксические иммуно-опосредованные механизмы. Клетки печени сами способны обеспечивать первичный иммунный ответ на ВГВ-инфекцию путем продукции интерферонов типа 1, которые подавляют репликацию вируса [265]. Следовательно, врожденный иммунный ответ также контролирует активность ВГВ, особенно при серонегативном варианте ЛГВ.