Белки множественной лекарственной устойчивости как фактор резистентности клеток млекопитающих к противотуберкулёзным препаратам Ерохина, Мария Владиславовна

brief description

Ерохина,МарияВладиславовна.Белкимножественнойлекарственнойустойчивостикакфакторрезистентностиклетокмлекопитающихкпротивотуберкулёзнымпрепаратам: диссертация ... доктора биологических наук : 03.03.04 /ЕрохинаМарияВладиславовна; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова]. - Москва, 2018. - 259 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
правах рукописи УДК 576.535ЕРОХИНАМАРИЯВЛАДИСЛАВОВНАБЕЛКИМНОЖЕСТВЕННОЙЛЕКАРСТВЕННОЙУСТОЙЧИВОСТИКАКФАКТОРРЕЗИСТЕНТНОСТИКЛЕТОКМЛЕКОПИТАЮЩИХКПРОТИВОТУБЕРКУЛЁЗНЫМПРЕПАРАТАМ03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

стр. 16
нанорифампицина ингибирует активностьбелкамножественнойлекарственнойустойчивостиPgp в провоспалительных макрофагах иклеткахмиелоцитарного происхождения человека. 6. Вклеткахмлекопитающихмитохондрии являются мишенью для рифампицина. 7.Факторытуберкулёзного воспаления ипрепаратпротивотуберкулёзнойтерапии рифампицин повышают уровень экспрессии генов основныхбелковмножественной...

стр. 18
формировании вклеткахчеловекалекарственнойустойчивостисразу к широкому спектрулекарственныхпрепаратов, получившую название применительно к опухолевымклеткам-множественнаялекарственнаяустойчивость. А самибелки-транспортёры Pgp, MRP1 и BCRP называют основнымибелками, формирующими МЛУ (далеебелкиМЛУ).

Оглавление диссертациикандидат наук Ерохина, Мария Владиславовна
ОГЛАВЛЕНИЕ.....................................................................................................2
ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................7
Актуальность темы исследования................................................................................7
Цель и задачи исследования.....................................................................................9
Научная новизна, теореическая и практическая ценность работы......................................10
Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем............................................12
Методы исследования............................................................................................ 13
Степень достоверности и апробация результатов..........................................................14
Положения, выносимые на защиту............................................................................16
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................17
1. Белки множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) - Р§р, МЯР1, БСЯР, ЬЯР:
их структура и субстратная специфичность............................................................. 17
1.1 Суперсемейство АТФ-связывающих транспортёров..............................................17
1.2 АТФ-связывающие-транспортёры, формирующие МЛУ....................................... 18
1.3 Структурная организация и функциональная активность белков МЛУ.......................22
1.4 Сайты связывания субстратов.........................................................................29
1.5 Модели транспорта субстратов........................................................................31
2. Локализация и функции основных белков МЛУ в клетках млекопитаю щих................................................................................................34
2.1 Респираторный отдел лёгких человека и других млекопитающих........................... 38
2.2 Белки МЛУ в клетках лёгких млекопитающих...................................................43
3. Белки МЛУ и воспаление.....................................................................................46
3.1 Туберкулёзное воспаление (туберкулома лёгких)..................................................46
3.2 Белки МЛУ и клетки иммунной системы............................................................49
3.3 Белки МЛУ и цитокины (медиаторы воспаления)..................................................51
3.4 Белки МЛУ и возбудитель..............................................................................52
3.5 Белки МЛУ и гипоксия...................................................................................53
4. Противотуберкулёзные препараты и их влияние на активность
белков МЛУ....................................................................................................53
4.1 Рифампицин и клетки эпителия........................................................................54
4.2 Рифампицин и клетки крови.............................................................................55
4.3 Противотуберкулёзные препараты: субстраты для белков МЛУ?........................................56
4.4 Противотуберкулёзные препараты как модуляторы эндоцитоза (фагоцитоза) и активности белков МЛУ.................................................................................58
4.5 Группы препаратов-субстратов для белков МЛУ...................................................59
5. Заключение к литературному обзору.......................................................................60
ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................63
1. Общая характеристика исследования....................................................................63
2. Материалы и методы анализа операционного материала...........................................64
2.1. Гистологическое исследование.......................................................................64
2.2 Выявление микобактерий по методу Циль-Нильсена............................................64
2.3 Иммуногистохимическое маркирование M.tuberculosis...............................................64
2.4 Определение уровней экспрессии генов MDR1, MRP1, BCRP, LRP
методом ОТ-ПЦР в реальном времени...............................................................67
3. Материалы и методы экспериментальной модели in vivo (туберкулёзное воспаление, химиотерапия инфицированных и неинфицированных животных).................................69
3.1 Модель экспериментального туберкулёза.............................................................69
3.2 Микробиологический анализ............................................................................69
3.3 Химиотерапия инфицированных животных........................................................ 70
3.4 Химиотерапия рифампицином неинфицированных (здоровых) животных...................70
3.5 Определение уровней экспрессии геновMdr1a/b, Mrp1, Bcrp, Lrp1 методом полуколичественной ОТ-ПЦР ........................................................................70
3.6 Гистологическое исследование.........................................................................71
4. Материалы и методы анализа культивируемых клеток млекопитающих..........................72
4.1 Культивируемые линии клеток.........................................................................72
4.2 Лекарственные препараты и наноматериал...........................................................73
4.3 МТТ-тест.....................................................................................................74
4.4 Окрашивание трипановым синим......................................................................74
4.5 Выявление активных форм кислорода................................................................75
4.5 Анализ ядерно-цитоплазматического соотношения.................................................75
4.7 Анализ целостности ДНК................................................................................75
4.8 Иммуногистохимическое выявление цитохрома с.................................................76
4.9 Цитохимическое окрашивание митохондрий.......................................................76
4.10 Анализ ультраструктуры митохондрий..............................................................76
4.11 Определение экспрессии гена MDR1 ПЦР в реальном времени................................77
4.12 Иммуноцитохимическое выявление Pgp.............................................................77
4.13 Оценка функциональной активности Pgp...........................................................77
4.14 Оценка трансмембранного потенциала митохондрий................................................77
4.15 Проточная цитофлуориметрия.........................................................................78
4.16 Культивирование бактерий.............................................................................78
4.17 Инфицирование макрофагов ТНР-1..................................................................78
4.18 Сканирующая электронная микроскопия...........................................................78
4.19 Трансмиссионная и аналитическая электронная микроскопия.................................79
4.20 Статистический анализ...................................................................................79
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................80
Раздел 1. Модуляция экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости
при туберкулёзном воспалении лёгких в экспериментальном и клиническом
материале............................................................................................................80
1.1 Динамика экспрессии генов МЛУ при экспериментальном прогрессирующем туберкулёзном воспалении лёгких.................................................................................................81
1.1.1 Гистологическая характеристика разных стадий прогрессирующего туберкулёзного воспаления у мышей..............................................................................................81
1.1.2 Изменение экспрессии генов МЛУ в лёгких мышей при прогрессировании туберкулёзного воспаления.....................................................................................87
1.2 Дифференциальная оценка экспрессии генов МЛУ при химиотерапии экспериментального туберкулёзного воспаления лёгких у мышей.....................................92
1.2.1 Гистологическая характеристика лёгких инфицированных мышей после проведения химиотерапии рифампицином или изониазидом...........................................................92
1.2.2 Определение экспрессии генов МЛУ в лёгких мышей после проведения химиотерапии.......................................................................................................94
1.3 Модуляция экспрессии генов МЛУ в лёгких интактных мышей рифампицином...........98
1.3.1 Гистологическая характеристика.......................................................................98
1.3.2 Сравнение экспрессии генов МЛУ.....................................................................99
1.4 Анализ экспрессии генов МЛУ в операционном материале больных туберкулёзом лёгких (туберкуломы с разной активностью воспалительного процесса)......................................105
1.4.1 Гистологическая характеристика туберкулом с разной активностью воспалительного процесса............................................................................................................105
1.4.2 Иммуногистохимическое выявление M. tuberculosis в разных зонах туберкулёзного воспаления..............................................................................................................................109
1.4.3 Уровень экспрессии генов МЛУ в туберкуломах лёгкого в зависимости от активности туберкулёзного воспаления....................................................................................116
1.5 Заключение к разделу 1.................................................................................123
Раздел 2. Активация Pgp в клетках миелоцитарного, эпителиального и соединительнотканного
происхождения под действием противотуберкулёзных препаратов................................125
2.1 Являются ли митохондрии мишенью для рифампицина?........................................................125
2.1.1. Выживаемость клеток СПЭВ при действии рифампицина и их морфологический анализ.............................................................................................................126
2.1.2 Индукция рифампицином окислительного стресса.............................................127
2.1.3 Оценка изменения структуры хондриома и митохондрий.........................................130
2.1.4 Индукция рифампицином апоптоза................................................................133
2.2. Моделирование функциональной активности Pgp рифампицином
в культивируемых эпителиальных клетках и фибробластах..........................................137
2.2.1 Получение резистентной к рифампицину сублинии клеток СПЭВ..........................138
2.2.2 Анализ структуры хондриома и митохондрий в клетках резистентной
сублинии СПЭВ.................................................................................................139
2.2.3 Анализ функциональной активности Pgp в клетках резистентной сублинии СПЭВ......140
2.2.4 Выживаемость фибробластов линии HET-SR-2SC-LNM с разными уровнями экспрессии гена MDR1 в возрастающих концентрациях рифампицина.............................................143
2.2.5 Анализ индукции рифампицином функциональной активности Pgp в исходных клетках
HET-SR-2SC-LNM................................................................................................144
2.3 Моделирование индукции активности Pgp рифампицином в клетках миелоцитарного происхождения с разными базовыми уровнями экспрессии гена MDR1............................146
2.3.1 Индукция экспрессии гена MDR1 возрастающими концентрациями рифампицина..............................................................................................147
2.3.2 Индукция экспрессии гена MDR1 и функциональной активности Pgp при длительном действии «терапевтической» концентрации рифампицина.............................................151
2.3.3 Оценка структуры и функциональной активности митохондрий при длительном действии «терапевтической» концентрации рифампицина..............................................155
2.3.4 Характеристика модели, изменение экспрессии гена MDR1 и функциональной активности Pgp в процессе прохождения клетками макрофагальной дифференцировки................................................................................................159
2.3.5 Влияние «терапевтической» концентрации рифампицина на уровень экспрессии гена MDR1 и функциональную активность Pgp при прохождении клетками макрофагальной дифференцировки................................................................................................171
2.3.6 Влияние «терапевтической» концентрации рифампицина на хондриом и функциональную активность митохондрий.................................................................174
2.3.7 Модуляция функциональной активности Pgp рифампицином.................................179
2.4 Ингибирование функциональной активности Pgp в провоспалительных макрофагах и клетках миелоцитраного происхождения человека при разных условиях эндоцитоза..........................................................................................................183
2.4.1 Экзогенный лёгочный сурфактант: его влияние на фагоцитарную активность макрофагов ТНР-1 и функциональную активность Pgp................................................................. 187
2.4.2 Нанорифампицин (рифампицин, инкапсулированный в полимер молочной кислоты):
его токсичность для макрофагов ТНР-1, микобактерий M. bovis BCG и влияние на функциональную активность Pgp.............................................................................194
2.4.3 Углеродные многостенные нанотрубки: их способность к биодеградации и влияние на функциональную активность Pgp.............................................................................213
2.5 Заключение к разделу 2....................................................................................221
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................224
ВЫВОДЫ..........................................................................................................230
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................231
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................235
БЛАГОДАРНОСТИ
259