Будаш Галина Володимирівна Оцінка морфо- функціональних характеристик плюрипотентних стовбуро­вих клітин та їх диференціювання у напрямку кардіоміоцитів в культурі клітин in vitro

brief description

Будаш Галина Володимирівна, асистент кафедри лабо­раторної діагностики біологічних систем Національного уні­верситету «Києво-Могилянська академія»: «Оцінка морфо- функціональних характеристик плюрипотентних стовбуро­вих клітин та їх диференціювання у напрямку кардіоміоцитів в культурі клітин in vitro» (03.00.11 - цитологія, клітинна біо­логія, гістологія). Спецрада Д 26.001.38 у Київському націо­нальному університеті імені Тараса Шевченка

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
«КИЄВО-МОГИЛЯНСЬКА АКАДЕМІЯ»
На правах рукопису
БУДАШ ГАЛИНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК: 576.32/.36:602.9
ОЦІНКА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНИХ ХАРАКТЕРИСТИК
ПЛЮРИПОТЕНТНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН ТА ЇХ
ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ У НАПРЯМКУ КАРДІОМІОЦИТІВ В КУЛЬТУРІ
КЛІТИН IN VITRO
03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник
завідувач кафедри лабораторної
діагностики біологічних систем
НУ«Києво-Могилянська академія»
МОН України
доктор медичних наук, професор
Білько Надія Михайлівна
Київ 2016
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 5
ВСТУП 7
РОЗДІЛ І. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 14
1.1. Характеристика плюрипотентних стовбурових клітин –
ембріональних стовбурових та індукованих плюрипотентних
стовбурових клітин
14
1.2. Диференціювання плюрипотентних стовбурових клітин в
кардіоміоцити
17
1.3. Фактори, що сприяють диференціюванню стовбурових клітин в
кардіоміоцити
22
1.3.1. Основні сигнальні шляхи, задіяні в процесах розвитку серця 27
1.4. Порівняння особливостей диференціювання ембріональних
стовбурових клітин та індукованих плюрипотентних стовбурових
клітин
34
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ 37
2.1. Клітинні лінії, використані у роботі та умови їх культивування 37
2.2. Культивування та підтримання недиференційованого стану
ембріональних стовбурових клітин та індукованих
плюрипотентних стовбурових клітин
40
2.3. Спосіб диференціювання ембріональних стовбурових клітин та
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин в кардіоміоцити
в суспензійній культурі з постійним перемішуванням
43
2.4. Диференціювання в кардіоміоцити методом «висячої краплі» 47
2.5. Диференціювання в кардіоміоцити в спеціальних планшетах
(AggreWell), які забезпечують гомогенність ембріоїдних тілець
49
2.6. Селекція диференційованих кардіоміоцитів 50
3
2.7. Підрахунок кількості живих клітин 50
2.8. Визначення GFP+ клітин методом проточної цитофлюориметрії 50
2.9. Світлова та флуоресцентна мікроскопія 51
2.10. Вимірювання трансмембранних струмів 51
РОЗДІЛ 3. 53
Особливості диференціювання плюрипотентних стовбурових
клітин в культурі тканин in vitro в залежності від умов
культивування
53
3.1. Вплив щільності посіву плюрипотентних стовбурових клітин миші
на ефективність їхнього диференціювання в кардіоміоцити
53
3.1.1. Вплив щільності посіву індукованих плюрипотентних стовбурових
клітин миші на ефективність їхнього диференціювання в
кардіоміоцити
55
3.1.2. Вплив щільності посіву ембріональних стовбурових клітин миші на
ефективність їхнього диференціювання в кардіоміоцити
60
3.2. Залежність ефективності диференціювання плюрипотентних
стовбурових клітин миші від часу прикріплення ЕТ методом
«висячої краплі»
61
3.3. Диференціювання ембріональних стовбурових клітин та
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин в культурі
тканин in vitro за умови постійного перемішування
66
3.4. Порівняння ефективність диференціювання плюрипотентних
стовбурових клітин методом «висячої краплі», в культурі тканин in
vitro за умови постійного перемішування та в спеціальних
планшетах, які забезпечують гомогенність сформованих
ембріоїдних тілець
71
РОЗДІЛ 4. 78
Диференціювання ембріональних стовбурових клітин та 77
4
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин миші в
кардіоміоцити в умовах впливу різних індукторів диференціювання
4.1. Вплив циклоспорину на процес диференціювання ембріональних
стовбурових клітин та індукованих плюрипотентних стовбурових
клітин в кардіоміоцити
78
4.2. Вплив ДМСО на процеси диференціювання ембріональних
стовбурових клітин та індукованих плюрипотентних стовбурових
клітин в кардіоміоцити
85
4.2.1. Застосування ДМСО для покращення диференціювання
ембріональних стовбурових клітин
85
4.2.2. Результати впливу ДМСО на процес диференціювання
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин
88
4.2.3. Порівняльний аналіз здатності до диференціювання ембріональних
стовбурових клітин та індукованих плюрипотентних стовбурових
клітин в умовах додавання ДМСО
91
4.3. Застосування QS11 для покращення диференціювання
ембріональних стовбурових клітин та індукованих
плюрипотентних клітин
93
4.4. Функціональні властивості кардіоміоцитів, які були отримані з
плюрипотентних стовбурових клітин з додаванням аскорбінової
кислоти та QS11 в середовище культивування
97
АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ 102
ВИСНОВКИ 117
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 119
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АК – аскорбінова кислота
ДПС – друге поле серця
ЕСК – ембріональні стовбурові клітини
ЕТ – ембріоїдні тільця
ІПСК – індуковані плюрипотентні стовбурові клітини
МЕФ – мишачі ембріональні фібробласти
ППС – перше поле серця
ПСК – плюрипотентні стовбурові клітини
СК – стовбурові клітини
ANF – атріопептин, передсердний натрійуретичний гормон, кардіонатрін
BMP – кістковий морфогенетичний білок
cTnT - кардіо тропонін Т
DMEM – Dulbecco’s modified Eagle medium (середовище Ігла, модифіковане
Дульбекко)
FBS – fetal bovine serum (фетальна теляча сироватка)
GFP – green fluorescent protein (зелений флуоресцентний білок)
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium (модифіковане середовище
Дульбекко)
IRES – Internal Ribosome Entry Site (ділянка внутрішньої посадки рибосоми)
Klf4 – Kruppel-like factor 4
LIF – інгібіторний фактор лейкемії
NEAA – non-essential amino acids (замінні амінокислоти)
Oct-4 - абревіатура від Octamer-4
QS11- хімічна назва (2S)-2-[2-(Indan-5-yloxy)-9-(1,1'-biphenyl-4-yl)methyl)-9Hpurin-6-ylamino]-3-phenyl-propan-1-ol
SCNT – переніс ядра соматичних клітин
Sox-2 - SRY [sex determining region Y]-box 2 – ділянка Y, яка визначає стать,
блок 2
6
TGF-β – трансформуючий фактор росту бета
α-MHC – важкий ланцюг α-міозину
7
ВСТУП
Актуальність теми. Ембріональні стовбурові клітини це – унікальні
клітини, які характеризуються здатністю проліферувати протягом тривалого
періоду в культурі і диференціюватися в будь-який тип тканин в організмі.
Можливість підтримувати лінії цих клітин миші в культурі дозволила дослідити
ранні стадії кардіогенезу ссавців [91], у тому числі отримати інформацію про
експресію генів [64], утворення міофібрил [38], розвиток і функціонування
іонних та кальцієвих каналів [111], розвиток рецепторів [48]. Однак висока
антигенність ксеногенних клітин, небезпека їхнього інфікування під час
використання, етичні проблеми та висока вірогідність формування імунної
відповіді організму реципієнта при трансплантації ембріональних стовбурових
клітин сприяли розвитку нових технологій їхнього отримання [3, 5]. Індукована
плюрипотентна стовбурова клітина вперше була отримана із соматичних клітин
миші у 2006 році [107]. У 2012 році за це відкриття S. Yamanaka та G. Gurdon
було присуджено Нобелівську премію з медицини та фізіології. Виявлено, що
індуковані плюрипотентні стовбурові клітини подібні до ембріональних
стовбурових клітин за морфологією, експресією генів, епігенетичним статусом
генів, які відповідають за плюрипотентність клітин; вони можуть
диференціюватись у клітини трьох зародкових шарів, як in vivo так і in vitro [45,
83]. Концептуально, диференціювання ембріональних стовбурових клітин не
відрізняється від диференціювання індукованих плюрипотентних стовбурових
клітин і залежить від спрямування сигнальних шляхів, які впливають на
ембріональний розвиток в природних умовах і вимагають виконання одних і
тих самих процедур [14, 54]. Тим не менше, було показано, що лінії
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин мають вищу мінливість
фенотипу, що може бути пов’язано з широким спектром методів індукції
плюрипотентності, а також джерел соматичних клітин та умов культивування
клітинних ліній [8, 102, 126]. Перевагою індукованих плюрипотентних клітин є
8
те, що вони після індукції і диференціювання в заданому напрямку можуть
бути повернені до хазяїна [1, 10, 107].
Майже одразу після народження серце ссавців втрачає велику частину
своїх регенеративних можливостей. Через постійну боротьбу зі стресом і
пошкодженням клітин відбувається втрата функціональних кардіоміоцитів
[115]; як наслідок, спостерігається гіпертрофія вже існуючих клітин та їх заміна
клітинами сполучної тканини, які нездатні до скорочення [128]. Важливість цієї
проблеми підтверджується тим, що у світі серцево-судинні захворювання
знаходяться на першому місці серед хвороб, які призводять до смерті пацієнта,
а в Україні вони є причиною смертності 6 з 10 мешканців країни [4].
Відновлення функції серцевого м’яза можливе завдяки застосуванню
методів клітинної терапії, які дозволяють отримувати кардіоміоцити в культурі
клітин in vitro [2]. Одержання великої кількості кардіоміоцитів є необхідною
умовою подальшого розвитку клітинних технологій. Найбільш перспективними
джерелами отримання кардіоміоцитів є стовбурові клітини з плюрипотентними
властивостями, а саме, ембріональні стовбурові клітини та індуковані
плюрипотентні клітини. Способи їхнього диференціювання, які на даний час
використовуються, мають ряд недоліків, головними з яких є недостатня
кількість диференційованих клітин, їхня функціональна незрілість, відсутність
стабільності у ефективності диференціювання та інші [53, 70, 73]. Тому
перспективним вважається дослідження процесів диференціювання
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин та ембріональних
стовбурових клітин для отримання ефективних способів накопичення
функціонально спроможних кардіоміоцитів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана відповідно до планів наукових досліджень
кафедри лабораторної діагностики біологічних систем на факультеті
природничих наук Національного університету «Києво-Могилянська академія»
за темою «Особливості диференціювання плюрипотентних клітин миші в
9
кардіоміоцити в залежності від умов культивування» № д/р 0112U000066
(07.2011 – 09.2013 р.р.).
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було визначення
особливостей проліферації та диференціювання ембріональних та індукованих
плюрипотентних стовбурових клітин миші в кардіоміоцити в умовах впливу
факторів диференціювання.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Отримати ембріоїдні тільця в культурі клітин in vitro для
подальшого визначення особливостей процесів проліферації та
диференціювання ембріональних стовбурових та індукованих плюрипотентних
клітин миші в кардіоміоцити.
2. Вивчити потенційні можливості використання ембріоїдних тілець у
якості моделі для дослідження процесу диференціювання в кардіоміоцитарному
напрямку.
3. Дослідити вплив умов на процес диференціювання ембріональних
стовбурових клітин та індукованих плюрипотентних стовбурових клітин в
культурі тканин in vitro, враховуючи розмір ембріоїдних тілець, наявність їх
адгезії до поверхні та рухливість.
4. Порівняти ефективність диференціювання плюрипотентних
стовбурових клітин методом «висячої краплі», в суспензійній культурі з
постійним перемішуванням та в спеціальних планшетах, які забезпечують
гомогенність сформованих ембріоїдних тілець.
5. Провести аналіз впливу малих молекул (QS11, циклоспорину,
ДМСО, дорзоморфіну, кардіодженолу та аскорбінової кислоти) на процес
диференціювання плюрипотентних стовбурових клітин.
6. Визначити найбільш ефективну схему підвищення ефективності
диференціювання плюрипотентних клітин в кардіоміоцити миші.
Об’єкт дослідження – ембріональні стовбурові клітини та індуковані
плюрипотентні стовбурові клітини миші.
10
Предмет дослідження – особливості диференціювання плюрипотентних
стовбурових клітин миші в кардіоміоцити в умовах впливу різних факторів
диференціювання.
Методи дослідження – культуральні, світлова та флуоресцентна
мікроскопія, проточна цитофлуориметрія, електрофізіологічні, методи
математичної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено вплив на
процес диференціювання ембріональних та індукованих плюрипотентних
стовбурових клітин in vitro розміру ембріоїдних тілець, адгезії ембріоїдних
тілець до поверхні та рухливості клітин. Виявлено, що найбільш ефективним
методом диференціювання, як для ембріональних стовбурових клітин, так і для
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин, є метод диференціювання в
суспензійній культурі з постійним перемішуванням. Вперше доведено
синергічний ефект додавання до культурального середовища аскорбінової
кислоти разом з QS11. Одержано пріоритетні дані щодо оптимальних термінів
додавання циклоспорину. Розроблено схему підвищення ефективності
диференціювання плюрипотентних клітин в кардіоміоцити миші.
Практичне значення одержаних результатів. У зв’язку з тим, що
розроблена схема отримання кардіоміоцитів суттєво підвищує ефективність
диференціювання, її використання може стати підґрунтям для базового
протоколу отримання кардіоміоцитів. Застосування циклоспорину або QS11
разом з аскорбіновою кислотою на перших етапах підтримки культури
кардіоміоцитів з ембріональних плюрипотентних стовбурових клітин та
індукованих стовбурових клітин забезпечить удосконалення як процесу
створення моделей серцево-судинних захворювань і методів їхнього лікування,
так і дослідження токсичності дії нових ліків.
Результати досліджень захищені патентом України № 75876 від 10.02.12
«Спосіб диференціювання стовбурових клітин в кардіоміоцити» і
використовуються при читанні курсів лекцій та під час проведення практичних
занять студентам на кафедрі лабораторної діагностики біологічних систем
11
Національного університету «Києво-Могилянська академія» із дисциплін
«Молекулярно-клітинні основи самовідновних систем», «Фізіологія
кровотворення».
Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає в
отриманні наукових результатів, викладених у дисертації, у проведені
патентно-інформаційного пошуку, підборі і обробці даних літератури,
проведенні експериментальних досліджень, дослідженні особливостей
проліферації та диференціювання ембріональних та індукованих
плюрипотентних стовбурових клітин миші в кардіоміоцити в умовах впливу
різних диференційних факторів, аналізі результатів та їх статистичній обробці,
написанні та оформленні дисертації. У наукових працях, що оформлені у
співавторстві, відображено результати спільного планування, проведення
експериментів та обговорення результатів. Формулювання мети, основних
завдань роботи, інтерпретація отриманих результатів та обґрунтування
наукових висновків зроблені разом з науковим керівником.
Автор висловлює глибоку вдячність професору Heschler J. та доктору
Saric T. (Інститут нейрофізіології, Кельнський університет, м. Кельн,
Німеччина) за координацію ключових етапів роботи та надану можливість для
продуктивної співпраці.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної
роботи доповідались і обговорювались на 6-й Міжнародній конференції
молодих науковців «Біологія від молекули до біосфери» (Харків, 2011),
Міжнародній науково-практичній інтернет-конференції «Роль інновацій у
підвищенні наявного потенціалу країни» (Тернопіль, 2011), на конференції,
присвяченій «Дням науки НаУКМА» (Київ, 2011), Науково-практичній
конференції «Актуальні проблеми регенеративної медицини (Київ, 2012), VIII
Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ
біології» (Львів, 2012), конференції-конкурсі робіт молодих учених «Актуальні
проблеми біохімії та біотехнології» (Київ, 2012), Науковій конференції з
міжнародною участю, присвяченій 40-річчю Інституту проблем кріобіології і
12
кріомедицини НАН України (Харків, 2012), VII Міжнародній конференції
молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2012), ІІ
Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых
ученых «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, Россия,
2012), конференції, присвяченій «Дням науки НаУКМА» (Київ, 2012), Науковій
школі МАН (Київ, 2012), BREATH summer school (Hannover, Germany, 2015),
конференції, присвяченій «Дням науки НаУКМА» (Київ, 2016), ІV
Міжнародній науковій конференції "Фундаментальні та прикладні
дослідження в біології та екології" (Вінниця, 2016), International Symposium on
Cell Biology jointly with 5th Ukrainian Congress for Cell Biology (Odesa, 2016).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць, з
яких 7 статей, серед яких 3 представлено в наукометричній базі даних
SCOPUS, в тому числі 1 стаття в іноземному міжнародному журналі, 4 статті
опубліковано в спеціалізованих фахових виданнях, рекомендованих ДАК
України, 1 патент України на винахід, 10 тез доповідей у матеріалах
міжнародних та національних конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів
досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку
використаних джерел, який містить 131 найменування, з них 10 – кирилицею та
121 – латиницею). Матеріали дисертаційної роботи викладені на 132 сторінках
друкованого тексту (з яких основна частина займає 118 сторінок, ілюстрована
43 рисунком і 2 таблицями).

bibliography

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та нове
вирішення актуальної задачі щодо визначення особливостей проліферації та
диференціювання ембріональних та індукованих плюрипотентних стовбурових
клітин миші в кардіоміоцити в умовах впливу різних диференційних факторів.
1. Отримано ембріоїдні тільця з ембріональних та індукованих
плюрипотентних стовбурових клітин миші в культурі клітин in vitro.
2. Показано, що розмір ембріоїдних тілець суттєво впливає на
ефективність диференціювання клітин. Найбільший відсоток GFP+ клітин
отримали з ембріоїдних тілець розміром 500 клітин; він становив 2,86 ± 0,30%
кардіоміоцитів від загальної кількості клітин (р˂0,05).
3. Прикріплення ембріоїдних тілець до поверхні субстрату покращує
ефективність процесів диференціювання. Проте, прикріплення ембріоїдних
тілець на більш ранніх етапах їх формування сповільнює процес
диференціювання.
4. Серед сполук, які сприяють диференціюванню (циклоспорин,
кардіодженол, дорзоморфін, ДМСО, аскорбінова кислота), найбільш
ефективним виявився циклоспорин. Додавання циклоспорину з 4-ї до 9-ї доби
формування ембріоїдних тілець призводило до збільшення кількості GFP+
клітин та площі скоротливих осередків в ембріоїдних тільцях у порівнянні з
контролем (р˂0,05).
5. Застосування QS11 разом з аскорбіновою кислотою мало
синергічний ефект, як для ЕСК, так і для ІПСК. Однак дія цих молекул можлива
лише в визначений проміжок часу.
6. Найбільш ефективною схемою підвищення ефективності
диференціювання плюрипотентних стовбурових клітин в кардіоміоцити є
культивування клітин з ембріоїдних тілець в суспензійній культурі з постійним
перемішуванням за умов додавання циклоспорину, що збільшує вихід
118
кардіоміоцитів удвічі для ембріональних стовбурових клітин та в 1,5 рази для
індукованих плюрипотентних стовбурових клітин.
7. Розроблений спосіб диференціювання плюрипотентних
стовбурових клітин є підґрунтям для створення протоколів отримання
визначеної кількості життєздатних кардіоміоцитів для трансплантології.