Гінсбах Марина Костянтинівна. ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ СИСТЕМИ ГЕМОСТАЗУ У ПАЦІЄНТІВ З РІЗНИМИ ПІДТИПАМИ ІШЕМІЧНОГО ІНСУЛЬТУ

brief description

Гінсбах Марина Костянтинівна. Назва дисертаційної роботи: "ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ СИСТЕМИ ГЕМОСТАЗУ У ПАЦІЄНТІВ З РІЗНИМИ ПІДТИПАМИ ІШЕМІЧНОГО ІНСУЛЬТУ"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
Гінсбах Марина Костянтинівна
УДК: 577.112.7:612.115
ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ СИСТЕМИ ГЕМОСТАЗУ У
ПАЦІЄНТІВ З РІЗНИМИ ПІДТИПАМИ ІШЕМІЧНОГО ІНСУЛЬТУ
03.00.04-біохімія
Дисертація
на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник
доктор біологічних наук, старший
науковий співробітник
Савчук Олексій Миколайович
Київ - 2015
2
ЗМІСТ
СПИСОК ВИКОРИСТАННИХ СКОРОЧЕНЬ……………………………. 5
ВСТУП…………………………………………………………………………... 6
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури………...…………………………………… 12
1.1. Загальна характеристика основних компонентів коагуляційної та
фібринолітичної систем крові ………………………………………… 12
1.2. Предиктори розвитку прокоагулянтного стану системи гемостазу.. 23
1.3. Сучасні уявлення щодо механізмів розвитку ішемічного інсульту… 29
РОЗДІЛ 2. Матеріали і методи………….…………………………………. 34
2.1. Характеристика груп, які досліджувалися………………………….… 34
2.2. Реагенти та матеріали………………………………………………….. 35
2.3. Обладнання………………………………………………..……..……... 36
2.4. Отримання плазми крові……………………………………………… 36
2.5. Отримання плазми крові, збагаченої тромбоцитами………………… 37
2.6. Отримання сироватки крові ………..………………………………... 37
2.7. Одержання еуглобулінової фракції плазми крові…………………….. 37
2.8. Імунізація кролів………………………………………………………… 38
2.9. Визначення тромбінового часу зсідання плазми крові……………… 38
2.10. Визначення протромбінового часу зсідання плазми крові…………. 38
2.11. Визначення активованого часткового тромбопластинового часу
зсідання плазми крові…………………………………………………. 38
2.12. Визначення анцистронового часу зсідання плазми крові…………… 39
2.13. Визначення часу лізису еуглобулінів плазми крові………………….. 39
2.14. Визначення часу Хагеман-залежного фібринолізу плазми крові ….. 39
2.15. Визначення активності плазміногена в плазмі крові………………… 40
2.16. Визначення активності α2-антиплазміну в плазмі крові……………… 40
3
2.17. Визначення вмісту розчинних фібрин-мономерних комплексів в
плазмі крові………………………………………………………..…… 41
2.18. Визначення фібриногену в плазмі крові…………………………….. 41
2.19. Визначення концентрації олігопептидів та рівня молекул середньої
маси в сироватці крові………………………………………………… 42
2.20. Очистка фракції імуноглобулінів класу G з сироватки крові………… 42
2.21. Отримання протромбіну………………………………………………. 43
2.22. Отримання Е-фрагменту фібрину…….……………………………….. 44
2.23. Виділення та характеристика фібриногену……………………………. 45
2.24. Отримання поліклональних антитіл до Е-фрагменту фібрину………. 46
2.25. Синтез афінних сорбентів………………………………………………. 47
2.26. Електрофорез у поліакриламідному гелі за присутності
додецилсульфату натрію……………………………………………… 48
2.27. Вестерн-блотинг………………………………………………………… 48
2.28. Імуноферментний аналіз………………………………………………. 49
2.29. Визначення концентрації білка за поглинанням в УФ-області
спектру…………………………………………………………………. 49
2.30. Дослідження агрегації тромбоцитів………………………………….. 50
2.31. Вивчення властивостей тромбоцитів методом протокової
цитофлуориметрії……………………………………………………… 50
2.32. Виділення ДНК з лімфоцитів периферичної крові…………………. 51
2.33. Ампліфікація ДНК in vitro……………………………………………. 52
2.34. Електрофорез в агарозному гелі ……………………………….…….. 53
2.35. Аналіз поліморфізму 5G/4G в гені PAI-1……………………………. 54
2.36. Аналіз поліморфізму G20210A в гені FII……………………………….. 55
2.37. Аналіз поліморфізму G1691A в гені FV………………………………… 56
2.38. Статистична обробка результатів досліджень………………………. 57
РОЗДІЛ 3. Результати досліджень і їх обговорення……………………. 58
4
3.1. Стан системи зсідання за атеротромботичного та кардіоемболічного
ішемічного інсультів……………………………………………………... 58
3.2. Стан системи фібринолізу за атеротромботичного та
кардіоемболічного ішемічного інсультів …………………………… 70
3.3. Особливості функціонування тромбоцитарної ланки гемостазу за
атеротромботичного та кардіоемболічного ішемічного інсультів……. 79
3.4. Специфічні фактори розвитку атеротромботичного та
кардіоемболічного ішемічного інсультів ………………………………. 86
3.4.1. Концентрація IgG за розвитку атеротромботичного та
кардіоемболічного ішемічного інсультів ……………………. 86
3.4.2. Е-фрагмент фібрину/фібриногену як ефектор
функціонування тромбоцитів…………………………………. 88
3.4.3. Дослідження протромбінового пулу плазми крові…………… 92
3.4.4. Визначення критеріїв ендогенної інтоксикації……………… 95
3.4.5. Дослідження поліморфізмів 5G/4G гена PAI-1, G20210A гена
FII та G1691A (лейденська мутація) гена FV………………... 97
РОЗДІЛ 4. ЗАКЛЮЧЕННЯ…………….…………………………………. 103
ВИСНОВКИ………………………………………………………………… 108
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ………..……………………… 110
5
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ СКОРОЧЕНЬ
АДФ – аденозиндифосфат
АЧТЧ – активований частковий тромбопластиновий час
ДВЗ-синдром – синдром дисемінованого внутрішньосудинного згортання
ПЧ – протромбіновий час
ПААГ – поліакриламідний гель
РФМК – розчинні фібрин-мономерні комплекси
Ск – стрептокіназа
ТЧ – тромбіновий час
APC – activated protein C
ELISA – enzyme linked immunosorbent assay
PAI-1 – plasminogen activator inhibitor type 1
TFPI – tissue factor pathway inhibitor
TAFI – thrombin activated fibrinolysis inhibitor
t-PA – tissue type plasminogen activator
vWF – von Willebrand factor
6
ВСТУП
Актуальність теми. В останні роки відзначається зростання поширеності
судинних захворювань серед населення більшості країн світу. В структурі
загальної смертності та інвалідності в промислово розвинених країнах інсульт
посідає друге-третє місце. В Україні даний діагноз щорічно ставиться більш ніж
100 тис. пацієнтам [1, 2]. Провідна роль у структурі всіх судинних захворювань
належить гострим ішемічним порушенням кровообігу – до 70 % всіх інсультів
припадає саме на ішемічні. Атеротромботичний та кардіоемболічний інсульти є
одними з найпоширеніших серед підтипів ішемічного інсульту [3].
Ключовим чинником розвитку патологій серцево-судинної системи є
дезорганізація системи гемостазу, що призводить до зміни реологічних
властивостей крові та внутрішньосудинного тромбоутворення. Тим не менш,
для багатьох пацієнтів причини інсульту залишаються невідомими. В
результаті неоднорідності факторів ризику та етіології, які значно варіюють в
залежності від віку та статі пацієнта, патофізіологія даного захворювання важко
піддається деталізації та опису [4]. Подолання негативних наслідків хвороби
потребує не лише залучення новітніх знань та розробок в області медицини, а й
впровадження профілактичних заходів та вдосконалення медичної допомоги
[5]. Основною підставою для виявлення осіб з високим ризиком серцевосудинних захворювань, а також контролю та оптимізації лікування є
визначення високочутливих біомаркерів, тому існує постійна потреба в нових
ефективних маркерах, які можуть бути застосовані у діагностиці. На
сьогоднішній день вкрай необхідним є як вивчення причин і механізмів
розвитку інсульту та його підтипів, так і поглиблення та деталізація системи
діагностики та контролю проведеного лікування.
7
Деталізація молекулярних механізмів, які лежать в основі розвитку
даного захворювання має принципове значення не лише з точки зору розробки
нових фармакологічних препаратів направленої дії, а й відкриває значні
перспективи в області клінічної діагностики патологічних проявів системи
гемостазу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана на кафедрі біохімії ННЦ «Інститут біології»
Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках
науково-дослідної теми «Механізми реалізації адаптаційно-компенсоторних
реакцій організму за умов розвитку різних патологій» (№ д/р 0111U004648,
2011-2015 рр.)
Мета і задачі дослідження. Дослідити стан системи гемостазу та
функціонування її ланок за атеротромботичного та кардіоемболічного
ішемічних інсультів.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Проаналізувати коагуляційну ланку системи гемостазу за розвитку
атеротромботичного та кардіоемболічного ішемічного інсульту.
2. Дослідити стан системи фібринолізу за розвитку атеротромботичного
та кардіоемболічного ішемічного інсульту.
3. Проаналізувати тромбоцитарну функцію за розвитку
атеротромботичного та кардіоемболічного ішемічного інсульту.
4. Виявити особливості розвитку даних патологічних станів, що
пов’язані з функціонуванням системи гемостазу.
Об’єкт дослідження: система гемостазу у хворих на атеротромботичний
та кардіоемболічний ішемічний інсульт.
Предмет дослідження: компоненти судинно-тромбоцитарної,
коагуляційної та фібринолітичної ланок системи гемостазу.
Методи дослідження: у роботі були використані методи препаративної
хроматографії для очищення білкових препаратів з плазми та сироватки крові
8
людини. Активність окремих компонентів гемостатичного каскаду визначали з
використанням специфічних хромогенних субстратів. Аналіз окремих
параметрів системи гемостазу проводили за допомогою хронометричних тестів
на коагулометрі. Концентрацію білків системи гемостазу визначали методом
імуноферментного аналізу у модифікації ELISA. Якісний склад білкових
фракцій плазми крові досліджували методами електрофорезу у
поліакриламідному гелі та вестерн-блотингу. Активацію та агрегацію
тромбоцитів аналізували за допомогою протокового цитофлуориметра та
агрегометра.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено
комплексне дослідження функціонування судинно-тромбоцитарної,
коагуляційної та фібринолітичної ланок системи гемостазу за різних підтипів
ішемічного інсульту, що дозволило встановити нові додаткові критерії ризику
розвитку та діагностики цих патологічних станів.
Було показано, що розвиток кардіоемболічного ішемічного інсульту
супроводжується значним зниженням концентрації t-PA у плазмі крові та
зростанням концентрації РАІ-1 у 60% пацієнтів, подовженням часу лізису
еуглобулінів та Хагеман-залежного фібринолізу, що вказує на більш виражений
протромботичний характер захворювання.
На основі молекулярно-генетичного аналізу поліморфізму FII (G20210A)
та FV (G1691A) системи зсідання крові встановлено особливості їх розподілу
серед української популяції і асоційованість з типом ішемічного інсульту: у
пацієнтів з атеротромботичним ішемічним інсультом визначено тенденцію до
зростання частоти гетерозиготних носіїв поліморфного алеля A20210 гена FII
порівняно із групою пацієнтів з кардіоемболічним ішемічним інсультом та з
контрольною групою осіб. Дослідження поліморфізму 5G/4G гена PAI-1 не
виявили статистично значимих відмінностей у розподілі генотипів і алельних
варіантів поліморфізму 5G/4G гена PAI-1 між групами хворих та практично
здорових донорів, що свідчить на користь вагомої ролі судинно-
9
тромбоцитарної ланки у розвитку даного підтипу ішемічного інсульту. Це
підтверджується підвищенням на 63% для даної групи хворих рівня фактору
фон Віллебранда, що є маркерним білком функціонального стану судиннотромбоцитарної ланки.
Вперше показано накопичення у плазмі крові хворих обох груп Eфрагменту фібриногену та продуктів розщеплення протромбіну. Кількісний
аналіз показав, що загальний пул форм Е-фрагменту кожного індивідуального
хворого включає від 25% до 50% вільного фрагменту, який є біологічно
активною молекулою і може спричиняти утворення тромбоцитарних агрегатів в
умовах in vitro.
Показано підвищення вмісту протромбіну при кардіоемболічному
ішемічному інсульті. Виявлено, що АДФ-залежна агрегація тромбоцитів хворих
з атеротромботичним ішемічним інсультом перевищувала цей показник у
донорів на 26%.
На основі аналізу впливу стрептокінази на АДФ-залежну агрегацію
тромбоцитів донорів та хворих з різними підтипами ішемічного інсульту
вперше показано, що цей препарат пригнічував АДФ-залежну агрегацію
тромбоцитів у 70 % донорів і 64% хворих на атеротромботичний ішемічний
інсульт. Розвиток кардіоемболічного ішемічного інсульту супроводжувався
зменшенням стрептокіназо-індукованого інгібування АДФ-залежної агрегації,
ефект спостерігався лише у 33% хворих.
Вперше було виявлено відмінності у коливаннях рівнів IgG за розвитку
різних підтипів ішемічного інсульту: якщо у хворих з кардіоемболічним типом
захворювання відзначалося значне зниження концентрації IgG при надходженні
до стаціонару і зростання цього показника через тиждень на 85%, то при
атеротромботичному типі таких змін не відбувалося.
Показано, що розвиток ішемічного інсульту супроводжується зростанням
рівня маркерів ендогенної інтоксикації, який досягав максимуму на 7-му добу
10
перебування у стаціонарі; при цьому показники ендогенної інтоксикації у
хворих з атеротромботичним ішемічним інсультом були вищими.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
можуть бути використані при розробці алгоритму лабораторної діагностики
стану системи гемостазу та ефективності проведення відповідної терапії хворих
з кардіоемболічним та атеротромботичним ішемічним інсультом.
Результати проведених досліджень дозволяють рекомендувати
проведення тесту «Анцистроновий час» для виявлення характеру порушень у
системі гемостазу за підозри на атеротромботичний та кардіоемболічний
ішемічний інсульти. Найпоказовіші зміни у системі гемостазу за даних
патологічних станів було виявлено на рівні фібриногену та його похідних –
розчинних фібрин-мономерних комплексів та на рівні протеїну С і фактору фон
Віллебранда. Визначення даних показників є інформативним для виявлення
загрози тромбоутворення. Знайдені відмінності в динаміці АДФ-залежної
агрегації тромбоцитів можуть бути використані для диференційованого підходу
корекції цих патологічних станів організму в залежності від причин їх
виникнення.
Отримані у дисертаційній роботі дані впроваджено у навчальний процес
курсів лекцій «Біохімічні основи гемостазу та діагностика», «Методи
практичної біохімії».
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано
наукову літературу за темою роботи, самостійно виконано експериментальні
дослідження та підготовку матеріалів до публікації. За участі співавторів
публікацій проведено інтерпретацію отриманих результатів. Планування
експериментальних робіт, аналіз та обговорення отриманих результатів
проведено спільно з науковим керівником д.б.н. Савчуком О.М.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були
представлені на вітчизняних та міжнародних конференціях: Міжнародному
науково-практичному конгресі студентів та молодих вчених «Актуальні
11
проблеми сучасної медицини» (Київ, 2013), ІІІ Всеукраїнській науковій
конференції молодих вчених «Фізіологія: від молекул до організму» (Київ,
2013), VIII Міжнародній конференції молодих учених «Біологія: від молекули
до біосфери» (Харків, 2013), Міжнародній науково-практичній конференції
«Медичні та фармацевтичні науки: історія, сучасний стан та перспективи
досліджень» (Одеса, 2013), 38th FEBS Congress (Saint Petersburg, 2013), IX Jakub
K. PARNAS Conference: Proteins from Birth to Death, September (Jerusalem, Israel,
2013), European Human Genetics Conference (Milan, Italy, 2014), 21st International
Student Congress of (bio)Medical Sciences (Groningen, the Netherlands, 2014), 60th
Annual meeting of the Scientific and Standardization Committee (SSC) of the
International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH) (Milwaukee, United
States, 2014), III Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та
молодих учених «Фундаментальні та прикладні дослідження в біології»
(Донецьк, 2014), ХІ Українському біохімічному конгресі (Київ, 2014).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових праць, у тому
числі 8 статей у фахових вітчизняних та міжнародних періодичних виданнях, з
яких 2 публікації у виданнях, включених до міжнародних наукометричних баз
та 12 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій та з’їздів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з
вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів власних
досліджень та їх обговорення, заключення, висновків та списку літературних
джерел (321 найменування). Робота викладена на 142 сторінках,
проілюстрована 26 рисунками та 9 таблицями.

bibliography

ВИСНОВКИ
Результати, представлені у дисертаційній роботі, поглиблюють існуючі
погляди на функціонування системи гемостазу за розвитку різних підтипів
ішемічного інсульту та показують перспективний напрямок майбутніх
досліджень – ідентифікацію в кровотоці специфічних білкових молекул,
здатних ініціювати різноманітні біохімічні реакції та процеси, що не характерні
для фізіологічного стану організму.
1. Показано, що за розвитку атеротромботичного та кардіоемболічного
ішемічних інсультів у плазмі крові накопичуються патологічні інгібітори
зсідання, які впливають на результати хронометричних тестів. Доведено
ефективність використання тесту «Анцистроновий час зсідання плазми крові»
за даних патологічних станів.
2. Встановлено, що зниження фібринолітичної активності плазми крові за
обох підтипів ішемічного інсульту супроводжується подовженням часу лізису
еуглобулінів в 5,6 рази, Хагеман-залежного фібринолізу у 3,6 рази та
підвищенням вмісту t-PA за атеротромботичного підтипу у 1,3 рази.
3. За розвитку обох підтипів ішемічного інсульту виявлено підвищення
вмісту фібриногену, розчинних фібрин-мономерних комплексів та зниження
активності протеїну С відносно донорів. Порівняння цих параметрів у обох
підтипів ішемічного інсульту не показало певних відмінностей у
характеристиках цих компонентів системи гемостазу, що дозволяє говорити
про подібний характер порушень в системі гемостазу за розвитку цих
патологій, незважаючи на різні ініціюючи фактори їх прогресування.
4. Виявлено підвищення максимального ступеня агрегації тромбоцитів
хворих з атеротромботичним ішемічним інсультом на 26% (1 доба перебування
на стаціонарі) та хворих з кардіоемболічним ішемічним інсультом на 32% (7-ма
109
доба перебування на стаціонарі) по відношенню до показників донорів.
Встановлено, що за кардіоемболічного ішемічного інсульту спостерігається
зростання рівня фактору фон Віллебранда на 63% відносно цього показника у
донорів.
5. Показано зростання концентрації IgG за кардіоемболічного ішемічного
інсульту у 2 рази відносно донорів та накопичення Е-фрагменту
фібриногену/фібрину та функціонально неактивних фрагментів протромбіну за
розвитку обох патологічних станів. Доведено вплив Е-фрагменту
фібриногену/фібрину на функціонування тромбоцитів.
6. Зафіксовано значне підвищення вмісту молекул середньої маси та
олігопептидів за розвитку обох підтипів ішемічного інсульту. Так, розвиток
атеротромботичного ішемічного інсульту супроводжувався вищою ендогенною
інтоксикацією організму хворих у порівнянні з кардіоемболічним ішемічним
інсультом. Про це свідчить накопичення більшої кількості молекул середньої
маси - у 3,1 рази вище в порівнянні з донорами та у 1,2 рази вище ніж за
кардіоемболічного інсульту, а також помітно вищий рівень олігопептидів у
плазмі крові пацієнтів (у 3 рази вище по відношенню до донорів та у 1,2 рази по
відношенню до кардіоемболічного інсульту).
7. Показано наявність поліморфізмів 5G/4G гена PAI-1, G20210A гена FII
та G1691A (лейденська мутація) гена FV у українській популяції хворих на
різні підтипи ішемічних інсультів.