Киров Илья Владимирович. Особенности организации повторяющихся элементов геномов растений, выявленные с помощью новых омиксных подходов

brief description

Киров Илья Владимирович. Особенности организации повторяющихся элементов геномов растений, выявленные с помощью новых омиксных подходов;[Место защиты: ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук], 2023

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ»
На правах рукописи
Киров Илья Владимирович
ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЭЛЕМЕНТОВ
ГЕНОМОВ РАСТЕНИЙ, ВЫЯВЛЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ НОВЫХ
ОМИКСНЫХ ПОДХОДОВ
1.5.7 - Генетика
Диссертация на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор, профессор РАН Соловьев Александр Александрович
Москва - 2024 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ 4
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 13
2.1 Классификация повторяющихся элементов генома 13
2.1.1 Тандемные повторы и организация ДНК центромеры 14
2.1.2 Мобильные элементы растений 18
2.2 LTR ретротранспозоны растений 30
2.2.1 Классификация 31
2.2.2 Организация генома LTR ретротранспозона и кодируемые белки 32
2.2.3 Жизненный цикл 37
2.3 Ретротранскриптом растений и методы исследования 41
2.3.1 Закономерности организации ретротранскриптома растений 41
2.3.2 Методы детекции экспрессирующихся ретротранспозонов 45
2.4 Мобилом растений и методы исследования 46
2.4.1 Формирование мобилома и его роль в адаптации растений 46
2.4.2 Arabidopsis thaliana - модельный объект для изучения мобилома 49
2.4.3 Методы детекции новых инсерций мобильных элементов 50
2.5 Методы идентификации сателлитных повторов растений 52
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56
3.1 Растительный материал 56
3.2 Выделение геномной ДНК и приготовление препаратов хромосом 57
3.3 Характеристика репитома и идентификация тандемных повторов с помощью коротких
ридов 58
3.4 RNAseq анализ транскрипции центромеры Allium 58
3.5 ПЦР амплификация, клонирование и секвенирование 60
3.6 Приготовление проб для FISH 61
3.7 FISH, GISH и безденатурационная (ND) FISH 62
3.8 Процедура C-бэндинга/DAPI 63
3.9 Флуоресцентная микроскопия и анализ изображений 63
3.10 ОТ-ПЦР 64
3.11 Нанопоровое секвенирование ДНК 65
3.12 Прямое нанопоровое секвенирование РНК (DRS) и сборка транскриптов 65
3.13 Идентификация экспрессирующихся ретротранспозонов подсолнечника 66
3.14 Оценка времени инсерции RTE 67
3.15 Расчёт расстояния между генами и RTE 67
3.16 Анализ мобилома по данным Illumina 67
3.17 Выделение внехромосомных кольцевых ДНК (вкДНК) 68
3.18 Предсказание длинных некодирующих РНК (днРНК) 69
3.19 Масс-спектрометрический анализ тотального белка 70
3.20 Проверка инсерций МЭ с помощью ПЦР 71
3.21 Идентификация и отбор LTR ретротранспозонов Aegilops tauschii для CANS 72
2

73
3.22 CasP-опосредованное секвенирование (CANS)
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 74
4.1 Цитогеномный анализ новых сателлитных повторов растений 74
4.1.1 pyTanFinder: инструмент для поиска высококопийных тандемных повторов в секвенированных геномах 74
4.1.2 nanoTRF: программа для поиска высококопийных тандемных повторов в «сырых» данных нанопорового
секвенирования 74
4.1.3 DRAWID: java программа для измерения параметров хромосом и построение идиограмм хромосом .... 79
4.1.4 Тандемные повторы Allium fistulosum, ассоциированные с центромерными и гетерохроматиновыми
регионами хромосом 88
4.1.5 Молекулярно-цитогенетическая характеристика функциональной центромеры A. fistulosum 97
4.1.6 Идентификация тандемных повторов Rosa wichurana и Rosa chinensis для цитогенетического
маркирования хромосом и аннотации генома 113
4.1.7 Анализ тандемных повторов в геноме мха, Physcomitrella patens 120
4.2 Транскриптомные особенности ретротранспозонов растений 134
4.2.1 Десятки LTR ретротранспозонов экспрессируются в геноме подсолнечника (Helianthus annuus) 134
4.2.2 Экспрессия LTR ретротранспозонов подсолнечника под действием эпигенетического стресса 148
4.2.3 Ретротранскриптом развивающейся зерновки тритикале 155
4.3 Активные мобильные элементы растений и особенности их инсерций в геноме 163
431 nanotei: программа для идентификации нереференсных инсерций транспозонов по данным
полногеномного нанопорового секвенирования 163
432 CANS: Cas9-опосредованное обогащение библиотек для нанопорового секвенирования инсерций
транспозонов растений 172
4.3.3 NanoCasTE: программа для идентификации нереференсных инсерций транспозонов по данным CANS 178
4.3.4 Геномная организация инсерций LTR ретротранспозона EVD в геноме ddm1 179
4.3.5 Инсерционный ландшафт ретротранспозона ONSEN, полученный с помощью CANS 185
4.3.6 Инсерции элементов ONSEN преимущественно возникают в генах с пониженной экспрессией в ответ на
тепловой стресс 188
4.3.7 Мобильная активность экспрессирующихся ретротранспозонов подсолнечника 191
4.3.8 Новый Ty1/&>pia LTR ретротранспозон MIG активен в развивающейся зерновке тритикале 197
4.3.9 Ретротранспозоны и эволюция размера генома Fagopyrum tataricum и F. esculentum 199
4.4 Структура и состав внехромосомных кольцевых ДНК (вкДНК) LTR ретротранспозонов
растений 203
4.4.1 Особенности вкДНК A. thaliana, выявленные с помощью нанопорового секвенирования 205
4.4.2 Нанопоровое секвенирование вкДНК рапса (Brassica napus) выявило новое семейство активных LTR
ретротранспозонов ANTARES 212
4.5 Мобильные элементы и протеом растений 218
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 222
6. ВЫВОДЫ 225
7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 227
8. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 230
8.1 Публикации по теме диссертации 230
8.2 Другие публикации в международных рецензируемых журналах 231
9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 233
3

bibliography

ВЫВОДЫ
1. Новые высококопийные сателлитные повторы (Allium fistulosum: AfiCenlK; Allium cepa: TR2CL37, Rosa wichurana CL8, CL24; Rosa chinensis: CL226; 19 повторов для Physcomitrium patens) ассоциированы с перицентромерными, центромерными и гетерохроматиновыми регионами как у однодольных и двудольных растений, так и мха, и могут быть использованы в качестве хромосомных маркеров и для интегрирования геномных и цитогенетических карт.
2. Центромеры хромосом Allium fistulosum содержат инсерции хлоропластной ДНК и длинный (~1,25 т.п.н.) транскрибирующийся тандемный повтор, который отличается по хромосомной и геномной организации от центромерного повтора A. cepa.
3. Экспрессирующиеся LTR ретротранспозоны представлены в транскриптомах однодольных и двудольных видов растений на разных стадиях развития в нормальных и стрессовых условиях, а их геномная организация отличается от неэкспрессирующихся LTR ретротранспозонов, включая время инсерции, близость к генам, число копий и обогащение открытыми рамками считывания, кодирующими домен GAG.
4. Данные нанопорового секвенирования транскриптома, генома и внехромосомных
кольцевых ДНК и их анализ с помощью разработанных программ (NanoCasTE, nanotei, eccStructONT) являются удобным инструментом для изучения мобилома растений, используя который, были впервые идентифицированы LTR ретротранспозоны тритикале (ретротранспозон 'MIG'), подсолнечника
(ретротранспозоны 'Gagarin' и 'SUNTY3'), рапса (семейство ретротранспозонов 'Antares') и арабидопсиса ('TR-GAG' элемент), обладающие мобильной активностью в лабораторных условиях.
5. Инсерции LTR ретротранспозонов в геноме Arabidopsis thaliana возникают не в случайных локусах, а связаны с определёнными хромосомными (центромерные регионы) регионами, а также эпигенетическими и транскриптомными особенностями, как было показано с помощью разработанного CANS/NanoCasTE подхода и полногеномного анализа соматических инсерций EVD и ONSEN.
225

6. Мобильные элементы в ходе жизненного цикла образуют пул внехромосомных кольцевых ДНК, гетерогенных по структуре и композиции, а также кодируют набор белков с каноническими и пока неизвестными функциями.
226