Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов Шевелев, Алексей Борисович

brief description

Шевелев,АлексейБорисович.Механизмымолекулярно-генетическогоконтролясекрецииубацилл-продуцентовферментов: диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.03. - Москва, 2006. - 195 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
присудил ученую степень ДОКТОРА (Se£OrX ' паук /Начальник управления ВАК России иа правах рукописиШЕВЕЛЕВАлексейБорисовичМеханизмымолекулярно-генетическогоконтролясекрецииубациллпродуцентовферментовДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биолошческих наук по специальности 03.00.03 - «Молекулярная

стр. 8
секреторных протеазбацилл, изучениемеханизмаих косекреторной активации. Построение обобщенной модели регуляции синтеза исекрецииферментовклеткамибацилл. Применение разработанной модели для получения промышленныхпродуцентовферментов: нейтральных протеаз Bacillus megaterium amyloliquefaciens,

стр. 131
размером 6,2т,н,п,, и накапливающий в культуральной жидкостиферментс активностью Gse, Данныйферментбыл выделен из культуральной жидкости рекомбинантного штамма-продуцентав гомогенном состоянии. Помолекулярномувесу рекомбинантныйферментне отличался от природного аналога, Nконцевая последовательность

Оглавление диссертациидоктор биологических наук Шевелев, Алексей Борисович
Список сокращений
1. Введение. Цели и задачи исследования
2. Обзор литературы. Секреция белков у Bacillus subtilis. Свойства 10 секреторных белков
2.1. Введение
2.2. Какие белки секретируются?
2.3. Структура сигнального пептида в целом
2.4. Классификация сигнальных пептидов
2.4.1. Идентификация сигнальных пептидов методом 17 компьютерного предсказания
2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся по 22 главному секреторному пути (Бес-система)
2.4.3. Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя 23 аргининовыми остатками (RR-мотив)
2.4.4. Сигнальные пептиды липопротеинов
2.4.5. Сигнальные пептиды препилин-подобных белков
2.4.6. Сигнальные пептиды бактериоцинов и феромонов
2.5. Количество транспортируемых белков
2.6. See-зависимая секреторная система
2.6.1. Цитозольные шапероны
2.6.1.1. Шапероны, специфически участвующие в секреции
2.6.1.2. Шапероны широкого спектра действия
2.6.2. Транслоказа
2.6.3. Сигнальные пептидазы типа I
2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой типа II
2.6.5. Пептидазы сигнальных пептидов
2.6.6. Внецитоплазматические катализаторы фолдинга белков 52 2.6.6.1 .Петидил-пролил цис-транс изомеразы
2.6.6.2. Тиол-дисульфид оксидоредуктазы
2.6.6.3. Пропептиды
2.6.6.4. Другие катализаторы фолдинга (небелковой природы)
2.7. Контроль качества транспортируемых белков
2.8. Бес-независимый экспорт белков
2.8.1. Tat-система транспорта
2.8.2. Система экспорта препилин-подобных белков 64 ' 2.8.3. ABC-система транспорта
2.9. Роль пропептида в секреции белков
2.10. Экспорт белков, локализованных в клеточной стенке
2.10.1. Сигналы для удержания белков в клеточной стенке
2.10.2. Белки, ковалентно связыванные с клеточной стенкой
2.11. Транспорт белков во время споруляции
2.11.1. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции
2.11.2. Факторы, участвующие в споруляционно-зависимом 77 транспорте белков
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Методы
3.2.1. Выделение плазмидной ДНК по модифицированному 81 методу Бирнбойма- Долли
3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
3.2.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля методом 82 Gene clean
3.2.4. Трансформация L-форм
3.2.5. Адаптация культур L-форм к росту в жидкой среде
3.2.6. Ферментация рекомбинантных штаммов L-форм- 83 продуцентов GseBL и СрТ
3.2.7. Анализ экспрессии рекомбинантных генов gseBL и cpt в 83 клетках L-форм P. mirabilis
3.2.8. SDS-электрофорез в ПААГ
3.2.9. Иммуноферментный анализ методом Вестерн-блоттинга
3.2.10. Анализ аминокислотных последовательностей
3.2.11. Определение активности глутамилэндопептидазы GseBL
3.2.12. Определение активности карбоксипептидазы Т
3.2.13. Протеолитическая активация предшественника GseBL
3.2.14. Выделение предшественника GseBL из культуральной 85 жидкости L-форм
3.2.15. Выделение СрТ из культуральной жидкости L-форм 86 P. mirabilis
3.2.16. Процессинг секреторной формы СрТ in vitro
3.2.17. Трансформация клеток Е. coll Ферментация $6 рекомбинантных штаммов Е. coli - продуцентов предшественников GseBL и СрТ в виде тел включения
3.2.18. Ренатурация предшественников протеиназ, полученных в 87 виде тел включения
3.2.19. Трансформация клеток В. subtilis методом Спицайзена
3.2.20. Ферментация рекомбинантных штаммов В. subtilis - 88 продуцентов GseBL и СрТ
3.2.21. Выделение геномной ДНК из клеток В. subtilis и Т. vulgaris
3.2.22. Разработка нового вектора pLF для экспрессии генов 88 протеиназ в В. subtilis
3.2.23. Экспрессия генов глутамилэндопептидаз в В. subtilis на 91 основе разработанного вектора pLF
3.2.24. Использование мини-гена, кодирующего пентапептид 93 устойчивости к эритромицину, в качестве транскрипционного репортера в клетках В. subtilis и L-формах P. mirabilis
4. Результаты и обсуждение
4.1. Разработка векторных систем для клонирования в бациллах
4.2. Гены 8-эндотоксинов В. thuringiensis
4.3. Исследование генов новых секреторных ферментов бацилл
4.4. Изучение структуры и механизма процессинга 154 предшественников секреторных протеиназ бацилл in vitro
4.5. Разработка промышленных продуцентов секреторных 166 ферментов на базе бацилл с использованием генов-регуляторов секреторного аппарата
5. Выводы
6. Благодарности