Методология исследования биологической активности геропротекторных пептидов Трофимов, Александр Владиславови

brief description

Трофимов, Александр Владиславович. Методология исследования биологической активности геропротекторных пептидов : диссертация ... доктора медицинских наук : 14.01.30 / Трофимов Александр Владиславович; [Место защиты: Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН].- Санкт-Петербург, 2011.- 203 с.: ил.
Методология исследования биологической активности геропротекторных пептидов Трофимов, Александр Владиславови
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
доктор медицинских наук Трофимов, Александр Владиславович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССОВ СТАРЕНИЯ НА СИСТЕМНОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ.

1.1. Возрастная инволюция нейроиммуноэндокринной системы.

1.1.1. Возрастная инволюция иммунной системы.

1.1.2. Возрастная инволюция нервной системы.

1.1.2.1. Возрастная инволюция пинеальной железы.

1.1.2.2. Возрастная инволюция центральной нервной системы.

1.1.3. Возрастная инволюция эндокринной и пищеварительной систем

1.1.3.1. Возрастная инволюция поджелудочной железы.

1.1.3.2. Возрастная инволюция желудочнокишечного тракта.

1.1.3.3. Возрастная инволюция печени.

1.1.4. Возрастная инволюция сетчатки.

1.2. Пептидергическая регуляция гомеостаза при старении.

1.2.1. Роль пептидергической регуляции в процессах старения.

1.2.2. Феноменология пептидных биорегуляторов.

1.3. Роль белков и пептидов в ультраструктурной организации и функционировании клеток в норме, при индуцированном старении и возрастассоциированной патологии.

1.3.1. Цитоскелет и кариоскелет: структурная организация, свойства и функции.

1.3.2. Роль апоптоза в функционировании клеток в норме, при патологии и старении.

1.3.3. Индуцированное старение клеток под действием радиации.

bibliography

Введение к работе
Актуальность темы
Проблема старения является одним из приоритетных направлений современной биологии и медицины. В настоящее время в мире в общей численности населения прогрессивно увеличивается доля лиц пожилого и старческого возраста [Сафарова Г.Л., 2009]. Увеличение средней продолжительности жизни, а, следовательно, и прогрессирующее старение населения [Коркушко О.В. и др., 2002] приведет в ближайшем будущем к необходимости решения целого ряда медицинских, социальныхи экономических проблем. В связи с этим основная задача гериатрии профилактика возрастной патологии становится важнейшим медицинским направлением.
Старение является сложным многоуровневым процессом, который проявляется как гипопластическими изменениями клеток и тканей организма, так и снижением их функциональной активности. Процессы старения связаны с многочисленными морфологическимии функциональными изменениями, обусловленными патологическими или компенсаторными реакциями [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Хавинсон В.Х.и др., 2008].
Основным проявлением старения является инволюция трех важнейших регуляторных систем нервной, иммунной и эндокринной [Пальцев М.А. и др., 2006]. Возраст-ассоциированные изменения этих систем связаны с общими законами старения организма, но имеют свои особенности, обусловленные структурно-функциональной спецификой каждого органа. На клеточном и субклеточном уровнях организации данный процесс проявляется в нарушении синтеза и секреции многих сигнальных молекул и, прежде всего, пептидов. Известно, что при старении наблюдается резкое снижение синтеза многих регуляторных пептидов с потерей чувствительности к ним клеток-мишеней [Корнева Е.А. и др., 1988; Шатаева Л.К. и др., 2003; Хавинсон В.Х., 2009].
Многолетние исследования показали, что синтетические пептиды способны восстанавливать различные функции органов и тканей при их возрастной инволюции. Однако методология исследования механизмов действия геропротекторных пептидов до сих пор полностьюне определена.
В связи с этим представляется актуальным разработка единой методологии исследования механизмов действия пептидовна нейроиммуноэндокринные, молекулярные и межклеточные взаимодействия при старении организма.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационного исследования явилась разработка методологии исследования механизмов действия пептидных геропротекторов.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

Исследовать действие пептидов Т-31, Т-34 и Т-38 на синтез белков цито- и кариоскелета в культуре мышиных фибробластов.

Оценить влияние пептидов Т-31 и Т-34 на развитие апоптозав культуре мышиных фибробластов и эпителиоцитов желудка человека.

Изучить действие пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0на дифференцировку полипотентной ткани ранней гаструлыXenopus laevis.

Исследовать влияние пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 и Т-37 на активацию, пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток костного мозга и печени эмбриона, малодифференцированных клеток тимуса и периферической крови человека.

Изучить влияние пептидов Т-34 и Т-38 на структуру ткани двенадцатиперстной кишки, тимуса и селезенки крыс в модели радиационного старения.

На основе разработанной методологии исследований оценить геропротекторные механизмы действия пептидов на нейроиммуноэндокринную систему.

Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые проведены широкие многоплановые исследования, позволившие разработать методологию исследования пептидных биорегуляторов и выяснить нейроиммуноэндокринные основы пептидной регуляции процессов старения.
Применение метода флюоресцентной конфокальной микроскопии позволило показать тканеспецифическое участие пептида Т-31 в индукции синтеза белков цито- и кариоскелета в культуре фибробластов мыши. Пептид Т-31, имеющий сродство к хрящевой ткани, активировал экспрессию актина, виментина, тубулина и ламинов А и С. При этом пептиды Т-34 и Т-38, специфичность которых направлена на ткани бронхов и сосудов, не оказывали такого эффекта.
Показано, что пептиды Т-31 и Т-34 в культурах фибробластов мыши и эпителиоцитов желудка человека проявляли антиапоптотический эффект, реализуемый путем повышения сопротивляемости митохондрийк бактериальным повреждениям.
Впервые выдвинуто предположение о том, что мишенями действия геропротекторных пептидов являются внутриклеточные сигнальные молекулы, активность которых реализуется через осуществляемую пептидами реструктуризацию белков цитоскелета и внутриядерные белки, регулирующие соотношение гетеро- и эухроматина в ядре. Кроме того, установлено, что пептиды снижают уровень апоптоза, усиление которого является одним их ключевых признаков старения.
Методом клеточных культур впервые получены данныео тканеспецифическом действии пептидов АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0на дифференцировку полипотентной ткани эктодермы ранней гаструлы лягушки. Установлено, что пептиды АКС-П и АП-0 запускают развитие мезенхимальной ткани, сомитов и эпителия, тогда как пептиды АК-0 и АЕ-0, синтезированные на основе экстрактов из тканей мозга, не влияютна развитие сомитов. При этом пептид АЕ-0 индуцирует дифференцировку нервной ткани. Выявлено, что в основе способности пептидов стимулировать развитие полипотентных клеток лежит усиление синтеза белка -актина. Впервые сделан вывод о том, что в основе геропротекторного действия пептидов лежит их способность стимулировать процессы клеточной дифференцировки.
Методом проточной цитометрии проведено комплексное исследование действия пептидов АТ-0, АВ-9, АВ-17, АВ-А, Т-31, Т-34 иТ-37 на активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток тимуса, костного мозга, печени и периферической крови человека. Установлено, что пептиды AT-0, AB-17, AB-A и T-31 при введениив культуру клеток костного мозга и печени эмбриона вызывают экспрессию лимфоидных и миелоидных маркеров на 3-15% клеток. Мишенями действия синтетических пептидов в этом случае являются кроветворные клетки-предшественники, экспрессирующие молекулу CD34. Показано, что в зависимости от структуры пептида дифференцировка кроветворных клеток-предшественников осуществляется различными путями.
Впервые выявлена стимуляция созревания тимоцитов человека при инкубации с пептидами. При этом отмечена смена мембранного фенотипа предшественников Т-клеток в направлении дифференцировки и усиление их пролиферации. Появление новых молекул на поверхности тимоцитов под влиянием пептидов во всех случаях реализуется в результате синтеза белкаde novoи отменяется блокаторами синтеза белков. Впервые получены данные о том, что пептид Т-37 активирует эпителиальные клетки тимуса (ТЭК), индуцируя экспрессию на их поверхности молекулы HLA-DR; при этом степень апоптоза ТЭК снижается, а их пролиферативная способность возрастает.
При действии пептидов AT-0, AB-A и T-37 на лимфоциты кровиin vitroизменяется экспрессия маркеров основных популяций лимфоцитов: снижается экспрессия маркера В-клеток, усиливается экспрессия маркеров натуральных киллеров (NK-клеток) и Т-лимфоцитов. Под влиянием указанных пептидов впервые зарегистрирована экспрессия второго корецептора CD4 на зрелых регуляторных Т-клетках с фенотипом CD8+.
Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что спектр биологического действия изученных пептидов на клетки иммунной системы является разнонаправленным. Пептиды AT-0, AB-17, AB-A и T-31 вызывают дифференцировку стволовых клеток, пептиды AT-0, AB-17,T-31 и T-37 воздействуют на тимоциты, при этом эффекты пептида T-37 связаны с эпителиальными клетками тимуса, AT-0, AB-A и T-37 влияютна активность зрелых лимфоцитов периферической крови.
Использование методов проточной цитометрии и клеточных культур позволило выявить активирующий эффект пептидов на различные субпопуляции иммунных клеток. Впервые выдвинуто предположениео том, что пептидные биорегуляторы в первую очередь воздействуют на иммунную систему, инволюция которой при старении выражена наиболее ярко.
В радиационной модели старения изучены геропротекторные эффекты пептидов Т-34 и Т-38 на клетки двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса крыс. Впервые установлено, что пострадиационное восстановление структуры двенадцатиперстной кишки, селезенки и тимуса определяется тканеспецифическими свойствами исследованных пептидов.
Показано, что пептид Т-34, имеющий сродство к тканям дыхательной системы, не оказывал положительного воздействия на облученные органы. Однако пептид Т-38, мишенью действия которого является сосудистая ткань, усиливал пролиферацию выживших после радиационного воздействия клеток кишечника, активировал гемопоэзв селезенке и лимфопоэз в тимусе. Действие пептида Т-38 на облученные ткани выражалось в отсутствии отека и нарушений со стороны сосудистого русла.
Применение совокупности использованных в работе методов исследования позволило сформировать системный подход к анализу механизма действия геропротекторных пептидов, а также установить,что исследуемые пептиды воздействуют на активацию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток различных тканей путем стимуляции синтеза регуляторных белков, экспрессия которых снижается при старении.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Применение методов клеточных культур, флюоресцентной конфокальной микроскопии и проточной цитометрии позволило показать, что в основе геропротекторного действия пептидов лежит их способность регулировать морфо-функциональное состояние на уровне органов, тканей, клеток и внутриклеточных сигнальных молекул.

Геропротекторный пептид Т-31 индуцирует синтез белков цито-и кариоскелета в фибробластах мышей, что позволяет предположить его участие в регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов путем реструктуризации белков цитоскелета и изменения структуры хроматина через воздействие на синтез ядерных белков.

В основе геропротекторного действия пептидов AT-0, AB-17, AB-A, T-31, АКС-П, АП-0, АК-0 и АЕ-0 лежит стимуляция дифференцировки стволовых клеток костного мозга, печени эмбрионов человека и полипотентных клеток эктодермы ранней гаструлы лягушки. Направление дифференцировки полипотентной ткани и стволовых клеток определяется выбранным пептидом.

Основой геропротекторного действия пептидов является их способность активировать иммунную систему, подверженную старению в первую очередь. Пептиды АТ-0, АВ-А, АВ-17, Т-31и Т-37 оказывают селективное действие на различные популяции иммунных клеток тимуса и периферической крови человека: AT-0, AB-17, AB-A и T-31 усиливают дифференцировку иммунных клеток тимуса; AT-0, AB-17, T-31, T-37 влияют на активацию, апоптози пролиферацию тимоцитов и эпителиальных клеток тимуса; AT-0, AB-A и T-37 индуцируют активацию, пролиферациюи дифференцировку иммунных клеток периферической крови.

Молекулярные механизмы действия геропротекторных пептидов проявляются на тканевом и органном уровне. Пептид Т-38 способствует постлучевому восстановлению тканей двенадцатиперстной кишки, тимуса и селезенки в модели радиационного ускоренного старения на крысах. Стимулирующий эффект пептида Т-38 выражается в восстановлении сосудистого компонента указанных органов, что отражает его тканеспецифичность.

Разработанная методология исследования пептидных геропротекторов позволила установить, что в основе их действия лежит регуляция активности сигнальных молекул в органах нейроиммуноэндокринной системы.

Апробация работы
Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XIII Европейском конгрессе по микроскопии (Бельгия, 2004); IX Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2004); VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2004); IV Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Украина, 2005); II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005);XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); VI Интернациональной конференции по нейроиммуномодуляторам (Греция, 2005); VIII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Санкт-Петербург, 2006); Научной конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» (Санкт-Петербург, 2006);VI европейском конгрессе «Здоровье и активное долголетие для всех европейцев» (Санкт-Петербург, 2007); IV Научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» (Москва, 2007); IV Международном конгрессе «Человек, спорт, здоровье» (Санкт-Петербург, 2009); XV Международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2010); XV Юбилейного Российского национального конгресса «Человек и его здоровье и III российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010).
Реализация результатов исследования
Результаты исследований изложены в 2 главах в книге «Руководство по нейроиммуноэндокринологии», которое рекомендовано Департаментом образования Минздравсоцразвития РФ в качестве учебника для студентов медицинских вузов; в главе в книге «Избранные лекции по геронтологии», рекомендованной УМО при ММА им. И.М. Сеченова в качестве учебного пособия для системы послевузовского медицинского образования.
Результаты работы используются в научной, педагогическойи практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, Белгородского государственного университета.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них -16 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ,2 статьи в других изданиях, 2 монографии, 2 главы в руководствах и23 тезиса докладов.
Связь с научно-исследовательской работой института
Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляциии геронтологии СЗО РАМН.