Молекулярно-генетический анализ хромосомной сар-области vibrio cholerae 0139 Щелканова, Елена Юрьевна

brief description

Щелканова,ЕленаЮрьевна.Молекулярно-генетическийанализхромосомнойсар-областиvibriocholerae0139: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.07. - Саратов, 1998. - 139 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ 'ШКРОБ" На правах рукописиЩЕЛКАНОВАЕленаЮрьевнаМОЛЕКУШРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙАНАЛИЗХРОМОСОМНОЙСАР-ОБЛАСТИ¥1ВК1и СНОЕЕРАЕ 0139 03.00.и? - микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени

стр. 3
Southern. 47 3.3.12. Электрофоретическийанализ..................... 47 ГЛАВА 4.ГЕНЕТИЧЕСКИЙАНАЛИЗСАР-ОБЛАСТИV.CHOLERAE0139.. 49 4.1.Генетическоекартирование

стр. 10
бактериальных генов. ЦЕЛЬ Р А Б О Т Ы -молекулярно-генетическийанализхро­ мосомнойобластиV.cholerae0139, содержащей ген(гены) биосинте­ за полнот аридной умеренного

Заключение диссертациипо теме «Микробиология», Щелканова, Елена Юрьевна
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Эпидемия холеры в конце 1992 г. в Индии и Бангладеш была впервые вызвана холерным вибрионом, структура липополиоахарида которого весьма отличалась от таковой не только традиционных возбудителей холеры классического и эльтор биоваров, относящихся к 01-оерогруппе, но и известных к тому времени холерных неагглю-тинирующихоя вибрионов 02 - 0138 оерогрупп. Поэтому новый эпидемический или бенгальский штамм был отнесен к ранее неизвестной 0139-оерогруппе. Второе основное отличие бенгальских штаммов от традиционных возбудителей холеры заключалось в продукции ими еще одного нового поверхностного антигена - полисахаридной капсулы, которая не была обнаружена ни у одного штамма V.oholerae 01 классического или эльтор биоваров. Доказано, что капсула является одним из важных факторов патогеннооти и иммуногенности бенгальских штаммов. Несмотря на огромный интерес исследователей к этим двум ранее неизвестным поверхностным структурам возбудителя холеры, многие вопросы, касающиеся, в частности, генетического контроля их биосинтеза, а также роли умеренного фага в изменении продукции капсулы, остались до сих пор не решенными.
К настоящему времени известно, что продукция капсулы и 0139-антигена контролируется как общими (Waldor М.К., Mekaianos J.J,, 1994; Ooiiistook L.E., 1995), так и различными (Смирнова Н.И. с соавт,, 1995; Bik Е.М., 1995) хромосомными генами. Тем не менее о местоположении их на хромосоме было известно очень мало, так как работа по генетическому картированию весьма трудоемка и требует на первом этапе создания донорных и реципиентных штаммов с необходимыми свойствами.
Цель нашей работы состояла в молекулярно-генетичеоком анализе хромосомной области V.cholerae 0139, содержащей ген (гены) биосинтеза полисахаридной капсулы, а также в изучении распространенности умеренного фага 139 и его роли в изменчивости вирулентных свойств бенгальских штаммов,
Основным итогом исследований, представленных в первом разделе экспериментальной части работы, является установление локализации гена на хромосоме возбудителя холеры 0139-серогруппы, который контролирует биосинтез только полисахаридной капсулы, поскольку в конъюгационных скрещиваниях мы использовали в качестве донора и реципиента штаммы, имеющие 0139-антиген, но отличающиеся друг от друга по продукции капсулы. Генетический анализ полученных рекомбинантов показывает, что ген cap-90 локализован на хромосоме между генами риг-90 и arg-90, контролирующими, соответственно, биосинтез пурина и аргинина, Более того, было установлено, что в этом же участке хромосомы находится еще один ген патогенности - ген mot, определяющий подвижность, При этом оказалось, что оба гена патогенности cap и mot тесно сцепленны друг с другом. Сцепленнооть генов, экспрессия которых обеспечивает проявление вирулентности либо ее повышение, обнаружена у многих патогенных бактерий: Y.pestis, энтеропатогенных штаммов E.ooli и т.д. (Garniel Е, et al., 1996; Boyd E.F., Hartl D,L,, 1998). Более того, довольно часто сцепленные гены вирулентности находятся на островах патогенности, которые способны к перемещению между различными штаммами бактерий, К настоящему времени мы не располагаем данными, позволяющими говорить о том, что гены mot и cap также могут входить в состав острова патогенности на хромосоме бенгальских штаммов, Тем не менее, анализ построенных ранее ге -1 pQ нетичеоких карт хромосомы V.oholerae 01 и 0139 свидетельствуют о том, что появившийся у бенгальских штаммов новый ген локализован в хромосомной области, которая содержит ряд других генов вирулентности. Так, по данным Н.И. Смирновой с ооавт. (1995), Н.И, Давыдовой (1993), Г,В, Чеховской с соавт.(1994), J, Mekalanos et al, (1979), Ch. Parker (1979) в изучаемом участке хромосомы ilv - pur - are V.cholerae 01 находятся гены rib, контролирующие биосинтез О-антигена, а также гены htx и tox-S, регулирующие продукцию холерного токсина, гены mot, обеспечивающие подвижность, а также, согласно нашим данным, гены rnsh, детерминирующие продукцию маннозо-чувотвительных пилей адгезии. Таким образом, сар-область хромосомы бенгальских штаммов находится в районе локализации других генов вирулентности,
Другим важным результатом работы является доказательство того, что геном умеренного фага типа каппа, обозначенный нами как фаг 139 включен в хромосому бенгальских штаммов вблизи генов па-тогенности cap и mot, а также гена ауксотрофнооти pur. Тесная оцепленнооть указанных генов с 139-профагом обеспечивает в большинстве случаев совместный их перенос от одного штамма к другому при конъюгационных скрещиваниях. Кроме того, зти данные указывают на наличие в этом участке хромосомы специфической нуклеотид-ной последовательности, в которую геном фага 139 может интегрировать .
Хотя о присутствии в геноме бенгальских штаммов умеренного фага каппа-типа было уже известно (Остроумова Н.М. о соавт. 1993, 1998; Higa N, et al,, 1993), полученные нами новые данные о его локализации в cap-области хромосомы явились основанием для предположения о том, что включенный в хромосому профаг может, видимо, при вырезании индуцировать хромосомные перестройки в близлежащих к нему генах и, следовательно, быть причиной появления спонтанных мутантов с измененной экспрессией генов cap, mot и pur, Более того, тесная сцепленность 139-профага о новым геном cap может, видимо, указывать на возможную роль этого фага в эволюции бенгальских штаммов, поскольку к настоящему времени сформировалось представление, согласно которому новый эпидемический штамм возник в результате переноса генетической информации (участка хромосомы с генами rib и cap) от неизвестного донора к V.cholerae биовара зльтор, возможно, при трансдукции (Mooi F.R,, Bik Е.М., 1997), Однако, данное предположение об участии фагов в указанном событии может быть справедливым лишь в случае, если фаги будут иметь трансдуцирующую активность,
В связи с высказанным предположением второе направление нашей работы было связано с изучением свойств умеренного фага 139 и его роли в нарушении продукции капсульного полисахарида. Поскольку к началу нашей работы структура ДНК фага 139 не была изучена, первый этап исследований был направлен на получение таких данных. Реотрикционный анализ свидетельствует о том, что ДНК фага 139, выделенная из лизогенного штамма 0139-серогруппы V.cholerae PI6084, является двунитевой и линейкой. Размер фаговой ДНК - около 34,0 т.п.н,, что составляет, примерно 1,3 % от размера хромосомы бенгальских штаммов (Manumoler R. et al., 1996; Chatter,] ее S. et al,, 1998). Фаговая ДНК содержит сайты для нескольких изученных реотриктаз; HindiII, PstI, EooRV, Xbal и BamHI. Электронно-микроскопический анализ фага 139, показавший, что фаговые частицы состоят из крупной гексагональной голоеки и хорошо выраженного покрытого сокращающимся чехлом хеоотоеого отростка.
-i -i --; - J. ± J. позволил отнести его к V морфологической группе по Т.Н. Тихонен-ко (1968) или к группе А по D.E. Bradley (1967). Сопоставление этих данных с результатами исследований J. Reidl и J. Mekalanos (1995), изучавшими умеренный фаг, выделенный из другого бенгальского штамма МОЮ и обозначенный ими как фаг К139, показало на практически полное совпадение морфологических и молекулярно-биологических свойств изучаемых фагов. Из этого, видимо, следует, что холерные умеренные фаги 139 и К139 являются одним и тем же умеренным фагом, изучаемым в разных лабораториях. Далее, используя меченные ök,P Hindi Ii-фрагменты фаговой ДНК в качестве молекулярного зонда в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации, мы показали, что ДНК фага 139 находится в хромосоме штамма PI6064 в виде интегрированного в нее профага.
Заслуживают внимание данные, свидетельствующие о широком распространении умеренного фага 139 среди различных бенгальских штаммов. Согласно полученных нами сведений, из 22 проверенных бенгальских штаммов, выделенных в России, Индии и Франции, 15 штаммов или 68,18 % содержат в геноме фаг 139. При этом лизигенные по фагу штаммы спонтанно продуцируют фаговые частицы. В тоже время было обнаружено 7 штаммов, лишенных этого фага. Как правило, штаммы, утратившие фаг, становятся чувствительными к его ли-тическому действию. Однако в случае нелизогенных бенгальских штаммов, мы получили совсем неожиданные результаты, указывающие на их резистентность к фагу 139. Такие же данные были получены J. Reidl и J. Mekalanos (1995), которые при анализе 7 бенгальских штаммов, выделенных в Индии, обнаружили 4 нелизогенных штамма, также имеющих иммунитет по отношению к фагу К139. Согласно точке зрения американских исследователей, нелизогенные бенгальские штаммы не могут быть инфицированы фагом К139 (или 139), видимо, из-за отсутствия у них фаговых рецепторов.
Поскольку фаг 139 довольно широко распространен среди различных бенгальских штаммов, находясь при этом в хромосомной cap-области в виде профага, встал вопрос о его функциональной значимости. В результате проведенной работы были впервые получены важные сведения о том, что геном умеренного фага 139 играет существенную роль в фенотипической изменчивости возбудителя холеры новой серогруппы за счет индуцирования им мутаций в близлежащих к нему генах cap, mot и pur, продукты которых важны для развития инфекционного процесса при холере.

Совокупность данных по генетическому картированию профага и нестабильности строго определенных генов у разных штаммов свидетельствуют о наличии в хромосоме бенгальских штаммов предпочтительного сайта интеграции 139-фага. Эти данные также подтверждаются результатами гибридизации Hindi 11-фрагментов хромосомы трех разных бенгальских штаммов (МОЮ, AI-1837, AI-1852) о фаговым зондом, полученными J. Reidl и J. Mekalanos (1995). Сайт-опе-цифичнооть интеграции в хромосому фага 139 не является уникальным событием для холерных фагов. Так, недавно установлено (Wal-dor M.K., Mekalanos J.J., 1996), что холерный филаментозный или нитевидный фаг СТХФ, содержащий в своем составе кассету вирулентности (гены otxAB, асе, zot, сер), также при интеграции в хромосому внедряются в строго определенный attRS-сайт. В то же время холерные умеренные каппа-фаги VcAl, VcÂ2 и УсАЗ, в отличие от фагов 139 и CTXSD, не имеют предпочтительных сайтов для интеграции и поэтому внедряются в различные участки хромосомы (Mose-ley S.L., Falkow S,, 1980; Johnson S.R. et al., 1981; Goldberg