Морфоиммуногистохимическая и клиническая характеристика нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием и ее вариантов Шуплецова Ирина Александровна

brief description

Шуплецова Ирина Александровна. «Морфоиммуногистохимическая и клиническая характеристика нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием и ее вариантов»: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.01.21 / Шуплецова Ирина Александровна;[Место защиты: ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2019
Морфоиммуногистохимическая и клиническая характеристика нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием и ее вариантов Шуплецова Ирина Александровна
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
кандидат наук Шуплецова Ирина Александровна
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности эпидемиологии НЛХЛП

1.2. История терминологии «нодулярной лимфомы Ходжкина с

лимфоидным преобладанием»

1.3. Происхождение LP-клеток

1.4. Клиническая картина НЛХЛП

1.5. Клинико-иммуноморфологические варианты НЛХЛП

1.6. Иммунофенотипические особенности оухолевых клеток и

реактивного микроокружения при НЛХЛП

1.7. Экспрессия EBV при НЛХЛП

1.8. Трудности дифференциальной диагностики НЛХЛП и В-клеточной

крупноклеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами

1.9. Трансформация НЛХЛП в ДВККЛ

1.10. Роль PD-1 и PD-L1 в иммунной супрессии Т-клеток

1.11. Биология генов GATA3 и EZH2

1.12. Лечение больных с НЛХЛП

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Критерии формирования группы исследования

2.2. Клиническая характеристика больных НЛХЛП на этапе первичной

диагностики заболевания

2.3. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного материала

2.4. Методика иммуногистохимического исследования

2.4.1. Методика ручного «manual» метода иммуногистохимического исследования

2.4.2. Методика иммуногистохимического исследования с помощью автоматизированной системы «Leica BOND MAX»

2.5. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Морфологическая характеристика НЛХЛП на момент диагностики заболевания

3.1.1. Характер роста опухолевого субстрата НЛХЛП в группе исследования

3.1.2. Морфология опухолевых клеток при НЛХЛП

3.1.3. Дополнительные особенности гистоархитектоники НЛХЛП

3.2. Иммуногистохимическая характеристика НЛХЛП в исследованной группе больных на

момент диагностики заболевания

3.2.1. Иммуногистоархитектоника опухолевого субстрата НЛХЛП в группе исследования

3.2.2. Иммуногистоархитектоника опухолевогового субстрата НЛХЛП в случаях, богатых опухолевыми клетками

3.2.3. Сопоставление характера роста и ИГХ подвариантов опухолевого субстрата НЛХЛП в исследованной группе пациентов

3.2.4. Трансформация НЛХЛП в ДВККЛ

3.2.5. Иммунофенотип опухолевых клеток при НЛХЛП

3.2.6. Визуализация сети ФДК при НЛХЛП

3.2.7. Иммуногистоархитектоника НЛХЛП, развившейся на фоне ПТЦР

3.2.8. Оценка экспрессии PD-L1, GATA3 и EZH2 в исследованной группе больных на момент диагностики заболевания и в группе контроля

3.2.9. Характеристика опухолевого субстрата при рецидиве/прогрессии НЛХЛП

3.2.10. Выраженность субпопуляций Т-клеток реактивного микроокружения в зависимости от ИГХ подварианта НЛХЛП

3.3. Поражение костного мозга в исследованной группе больных на момент диагностики НЛХЛП

3.4. Характеристика НЛХЛП в зависимости от наличия поражения костного мозга на момент диагностики заболевания

3.5. Клинико-морфологическое сопоставление в ИГХ подгруппах «А» и «не-А»

3.5.1. Формирование подгрупп «А» и «не-А»

3.5.2. Клиническая характеристика пациентов групп «А» и «не-А»

3.6. Характеристика экстранодальных поражений при длительно протекающей НЛХЛП

3.7. Клиническая характеристика пациентов группы «не-А» в

зависимости от выраженности ТНКЪВ^-подобных участков

3.8. Характеристика экстранодальных поражений при длительно протекающей НЛХЛП в группе «не-А»

3.9. Терапия 1-й линии в исследованной группе больных НЛХЛП

3.10. Результаты терапии у больных с ТНКЪВ^-подобными

участками > 50%

ГЛАВА 4. ОПИСАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ СЛУЧАЕВ. КЛИНИКО-

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ СОПОСТАВЛЕНИЕ

Клинический случай №1

Клинический случай №2

Клинический случай №3

Клинический случай №4

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

Приложение

bibliography

Иммунофенотипические особенности оухолевых клеток и реактивного микроокружения при НЛХЛП
LP-клетки при НЛХЛП имеют иммунофенотип, отличный от иммунофенотипа опухолевых клеток при кЛХ ввиду различных неопухолевых аналогов. LP-клетка это В-клетка, демонстрирующая признаки герминальной дифференцировки, поэтому для нее характерна экспрессия CD20, CD79a, BCL-6, яркая экспрессия В-клеточных транскрипционных факторов: B-cell specific activator protein (BSAP)/PAX5, octamer binding protein-2 (Oct-2), B-lymphocyte-specific co-activator BOB.1/OBF.1, BCL6 [149]. При ИГХ исследовании лимфатических узлов с НЛХЛП при реакции с антителами к CD20 и CD3 на малом увеличении могут определяться нодули и даже участки диффузного роста с истощением В-клеток, в которых крупные опухолевые клетки (CD20+) располагаются среди мелких Т-клеток (CD3+), что может напоминать крупноклеточную В-клеточную лимфому, богатую Т-клетками; также отмечается экспрессия CD45 крупными опухолевыми клетками [4, 128]. В большинстве случаев LP-клетки негативны при реакции с антителами к CD30, хотя в части случаев может наблюдаться слабая мембранная и цитоплазматическая экспрессия, что не влияет на клиническое течение заболевания [121]. Экспрессия CD15 LP-клетками в литературе описана в небольшом проценте случаев: 2%, 3% и 7% [73, 80, 146 соответственно].
В 27% случаев НЛХЛП опухолевые клетки экспрессируют IgD. S. Prakash и соавторы [119] в 2006 году выделили в отдельную подгруппу НЛПЛХ IgD-позитивные случаи в связи с наличием особенностей клинической картины, гистоархитектоники и иммунофенотипа опухолевых клеток. Германская исследовательская группа по изучению лимфомы Ходжкина предложила гипотезу о наличии в этих случаях костимуляции LP-клеток грамотрицательным микроогранизмом Moraxella catarrhalis через Moraxella IgD-связывающий белок (MID/hag) [69].
В части случаев наблюдается «перекрест» морфологических и иммунофенотипических характеристик между НЛХЛП и кЛХ, что вызывает трудности в дифференциальной диагностике и обусловливает необходимость выделения так называемых транзиторных форм. В таких случаях особое внимание уделяется экспрессии multiple myeloma-1/interferon regulatory factor-4 (MUM1/IRF-4) и В-клеточных транскрипционных факторов: PAX5, BOB.1, Oct-2. Группа румынских ученых исследовала экспрессию В-клеточных транскрипционных факторов при НЛХЛП. Во всех из 22 исследованных случаях НЛХЛП в опухолевых клетках наблюдалась яркая экспрессия PAX5, Oct-2, BOB.1 и BCL6, которая, по сообщениям других авторов, не наблюдалась в кЛХ. Напротив, в большинстве случаев НЛХЛП LP-клетки не экспрессировали MUM1/IRF-4, в отличие от наличия экспрессии в большинстве случаев кЛХ [75]. При НЛХЛП отмечена интенсивная экспрессия (гиперкспрессия) Oct-2 ядрами опухолевых клеток по сравнению с экспрессией в мелких В-клетках. При кЛХ в большинстве случаев опухолевые клетки имеют слабую экспрессию Oct-2 или вообще не экспрессируют Oct-2; корреляции экспрессии Oct-2 опухолевыми клетками с вариантом кЛХ или экспрессией В-клеточных маркеров (CD79a и PAX5) отмечено не было. Однако ни в одном случае кЛХ не было отмечено гиперэкспрессии Oct.2 [64]. Stein и соавторы в своем исследовании высказали гипотезу о том, что при кЛХ отсутствие экспрессии иммуноглобулина в клетках Рид-Березовского-Штернберга вызвано снижением синтеза регуляторных факторов BOB.1/OBF.1 и Oct-2, необходимых для транскрипции гена иммуноглобулина, а не наличием мутаций в гене иммуноглобулина, как считалось ранее [54, 133].
Актуальным остается поиск иммуногистохимических маркеров для дифференциальной диагностики НЛХЛП и кЛХ. Особое внимание в литературе уделяется антителу fascin. Группа исследователей во главе с Nashwa M. Emara [57], обнаружили экспрессию fascin опухолевыми клетками 83,6% случаев кЛХ, и ни в одном из случаев НЛХЛП. Сходные результаты опубликовала Bhargava с соавторами в 2010 году [28], обнаружив, что только в 12,5% случаев НЛХЛП в единичных опухолевых клетках определялась экспрессия fascin. Отсутствие экспрессии fascin крупными опухолевыми клетками при НЛХЛП еще недостаточно изучено. В немногочисленных исследованиях было показано, что экспрессия fascin может быть вызвана EBV-инфекцией В-клеток [103]. Этот вирус нечасто связан с LP-клетками и, вероятно, не участвует в патогенезе НЛХЛП, в отличие от его основной роли в патогенезе кЛХ. Однако в тех случаях НЛХЛП, где обнаруживалась экспрессия EBV, отмечалась экспрессия fascin.
Другим дифференциально значимым маркером считается транскрипционный фактор PU.1. В исследовании во главе с Nashwa M. Emara экспрессия PU.1 опухолевыми клетками наблюдалась во всех случаях НЛХЛП, однако, в 91,7% кЛХ, вариант - нодулярный склероз, и в 80% случаев кЛХ, вариант - смешанно-клеточный, опухолевые клетки не экспрессировали PU.1 [45]. Вышеприведенные выводы согласуются с выводами Е.Torlakovic и соавторов, которые описали, что транскрипционный фактор PU.1 постоянно присутствует в LP-клетках НЛХЛП, но не в опухолевых клетках кЛХ [142]. По данным Ludmila Boudova и соавторов экспрессия PU.1 опухолевыми клетками наблюдалась в 86% случаев НЛХЛП [31]. Недавние исследования продемонстрировали, что отсутствие экспрессии PU.1 при кЛХ связано с нарушением транскрипционной регуляции промотора гена иммуноглобулина и снижением регуляции В-клеточных транскрипционных факторов [84].
ЛХ уникальна среди всех опухолей, потому что клетки реактивного микроокружения значительно превосходят по численности опухолевую популяцию, которая составляет примерно 1-5% от опухолевой массы. Экспрессия большого количества цитокинов и хемокинов клетками Рид-Березовского-Штернберга и LP-клетками, как полагают, способствует развитию модифицированной иммунной реакции, которая поддерживается дополнительными факторами, секретирующимися клетками реактивного микроокружения, что помогает поддерживать их жизнеспособность. Опухолевые LP-клетки и клетки Рид-Березовского-Штернберга управляют клетками реактивного микроокружения, что позволяет им развить свой злокачественный потенциал полностью и уклониться от ответной иммунной реакции хозяина. Влияние реактивного микроокружения на жизнедеятельность опухолевых клеток исследовалось давно. В 2004 году S. Dave с соавторами [45] опубликовали исследование природы клеток реактивного микроокружения при ФЛ, которая явилась достоверным предиктором продолжительности жизни пациентов ввиду экспрессии определенных наборов генов предикторов выживаемости - не в опухолевых клетках, а в клетках микроокружения лимфомы. Исследуемые наборы генов были обозначены как иммунный ответ 1 (набор генов, экспрессированный в Т-клетках) и иммунный ответ 2 (набор генов, экспрессированный в моноцитах).
Биологически НЛХЛП это В-клеточная лимфома герминального происхождения, которая почти полностью сохранила В-клеточную программу на транскрипционном и фенотипическом уровнях [33, 90, 100]. Интересно, что герминальный профиль экспрессии наблюдается не только в LP-клетках, но также и в окружающих Т-клетках, характерных для светлого центра размножения вторичного фолликула и формирующих розеткоподобные структуры вокруг опухолевых клеток. Эти Т-клетки имеют иммунофенотип фолликулярных Т-клеток-хелперов (Tfh): CD3+, CD4+, CD57+ [115], BCL6+ [88], PD-1+ [52] и CXCL13+, последний является хемокином, который участвует в миграции В-лимфоцитов и Tfh в лимфоидные фолликулы и играет важную роль в Т-зависимой активации В-лимфоцитов [21].
В 2010 году группа ученых из Саудовской Аравии опубликовала результаты исследования 29 биоптатов лимфатических узлов пациентов с НЛХЛП с преобладанием В- и Т-клеток в реактивном микроокружении. Общая выживаемость в обеих группах не различалась, однако в группе с преобладанием Т-клеток была выше частота рецидивов заболевания [25]. В литературе описаны исследования реактивного микроокружения при НЛХЛП с помощью проточной цитометрии и без учета ИГХ подварианта [46, 147]. Однако для понимания биологии НЛХЛП важна иммуногистоархитектоника реактивного микроокружения при различных ИГХ подвариантах.
S. Hartmann с соавторами [70] обнаружили различия в микроокружении типичной НЛХЛП и THRLBCL, которые выражались в количестве Tfh и макрофагов. Количество CD4+ Т-клеток при THRLBCL значительно ниже, чем при НЛХЛП (вне зависимости от варианта). Различия в количестве CD8+ Т-клеток оказались незначительными. Количество гистиоцитов CD163+ было выше при THRLBCL и в THRLBCL-подобных участках НЛХЛП по сравнению с типичным вариантом НЛХЛП. Экспрессия PD-1, CXCL13 наблюдалась в большем количестве клеток при типичном варианте НЛХЛП по сравнению с ТHRLBCL-подобными участками НЛХЛП и THRLBCL. Уменьшение количества Tfh в диффузных участках НЛХЛП было описано ранее [43, 106]. Однако авторы в своем исследовании не обнаружили значимых различий между НЛХЛП с THRLBCL-подобными участками и de novo THRLBCL. Кроме того, MUM.1+ розетки из Т-клеток редко обнаруживались в THRLBCL-подобных участках НЛХЛП и de novo THRLBCL. В недавних исследованиях клеточный состав микроокружения и особенно высокое содержание тканевых макрофагов были определены как неблагоприятный прогностический фактор при кЛХ [85, 131, 137, 143].
Оценка экспрессии PD-L1, GATA3 и EZH2 в исследованной группе больных на момент диагностики заболевания и в группе контроля
Мы провели ИГХ исследование для оценки экспрессии PD-L1, GATA3 и EZH2 на 21 образце лимфатических узлов исследуемой группы больных (19 образцов на момент диагностики заболевания, 2 случая в рецидиве) в сравнении с группой контроля представленной 13 случаями кЛХ.
Экспрессия вышеуказанных маркеров оценивалась в зависимости от ИГХ подварианта:
- подвариант 1 (8 случаев),
- подвариант 2 (2 случая),
- сочетание подвариантов 2 и 3 (4 случая),
- сочетание подвариантов 2, 3 и 4 (3 случая),
- сочетание подвариантов 3 и 4 (1 случай),
- сочетание подвариантов 3, 4 и 5 (2 случая),
- подвариант 4 с участками трансформация в ДВККЛ (1 случай). Мы выявили экспрессию PD-L1 более порогового значения в 5% только в 1 из 21-го случая (рецидив заболевания, рисунок 33).
В остальных случаях опухолевые клетки были негативны (рисунок 34 А-В), отличие от кЛХ, (рисунок 34 Г).
A. ИГХ подвариант 1. LP-клетки не экспрессируют PD-L1 (мембранная экспрессия отмечается в антигенпрезентирующих клетках - макрофагах «внутренний» контроль).
Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к PD-L1. Увеличение х200.
Б. ИГХ подвариант 3. Крупные опухолевые клетки не экспрессируют PD-L1 (позитивны антигенпрезентирующие клетки). Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к PD-L1. Увеличение х200.
B. ИГХ подвариант 5 (богатый опухолевыми клетками). Крупные опухолевые клетки не экспрессируют PD-L1 (позитивны антигенпрезентирующие клетки). Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к PD-L1. Увеличение х200.
Г. Классическая лимфома Ходжкина, вариант нодулярный склероз II типа. Отмечается интенсивная мембранная экспрессия PD-L1 крупными опухолевыми клетками. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к PD-L1. Увеличение х200.
GATA3 не экспрессировалась опухолевыми клетками ни в одном из исследованных случаев (рисунок 35).
А. ИГХ подвариант 1. LP-клетки не экспрессируют GATA3 (умеренная по интенсивности ядерная экспрессия мелкими Т-клетками «внутренний» контроль). Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к GATA3. Увеличение х200.
Б. ИГХ подвариант 5. Крупные опухолевые клетки не экспрессируют GATA3. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к GATA3. Увеличение х200. В. Классическая лимфома Ходжкина, вариант нодулярный склероз. Крупные опухолевые клетки не экспрессируют GATA3. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к GATA3. Увеличение х200.
Г. Классическая лимфома Ходжкина, вариант нодулярный склероз. В крупных опухолевых клетках отмечается интенсивная ядерная экспрессия GATA3. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к GATA3. Увеличение х200.
Экспрессия EZH2 отмечалась во всех исследованных случаях, носила гетерогенный по интенсивности ядерный характер в большинстве опухолевых клеток (рисунок 36).
A. ИГХ подвариант 2. Интенсивная ядерная экспрессия LP-клетками.
Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к EZH2. Увеличение х200.
Б. ИГХ подвариант 5. Умеренная по интенсивности ядерная экспрессия крупными опухолевыми клетками, сопоставимая по интенсивности с экспрессией в мелких Т-клетках. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к EZH2. Увеличение х400.
B. Классическая лимфома Ходжкина, вариант нодулярный склероз. Гетерогенная по интенсивности ядерная экспрессия крупными опухолевыми клетками. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к EZH2. Увеличение х200.
Г. «Внешний» позитивный контроль для EZH2 интенсивная ядерная экспрессия центробластами герминативного центра лимфоидного фолликула. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к EZH2. Увеличение х200. Значения экспрессии выделенных маркеров в исследованной группе больных и в группе контроля (кЛХ) представлены в таблице 7.
A. Плотные скопления крупных CD20-позитивных опухолевых клеток.
Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к CD20. Увеличение х200.
Б. Крупные опухолевые клетки не экспрессируют GATA3 (позитивны мелкие Т-клетки). Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к GATA3. Увеличение х400.
B. Крупные опухолевые клетки не экспрессируют PD-L1 (позитивны антигенпрезентирующие клетки). Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к PD-L1.
Увеличение х400.
Г. В крупных опухолевых клетках отмечается интенсивная ядерная экспрессия EZH2. Иммуноферментный метод. Реакция с антителами к EZH2. Увеличение х400.
Вывод. По результатам проведенного исследования выявлено, что экспрессия GATA3 отсутствовала, а PD-L1 экспрессирован опухолевыми клетками в 5% случаев НЛХЛП по сравнению с группой контроля кЛХ (р 0,0001), что позволяет использовать данные маркеры для дифференциальной диагностики этих двух нозологий. Экспрессия EZH2 в опухолевых клетках отмечалась у 100% больных исследованной группы и у 100% - группы контроля (кЛХ).