Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации Стародубова, Елизавета Сергеевна

brief description

Стародубова,ЕлизаветаСергеевна.Протеасомнаядеградацияобратнойтранскриптазыдикогоилекарственно-устойчивыхизоляторовВИЧ-1иеерегуляциядляцелейДНК-вакцинации: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 2006. - 141 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 4
обратнойтранскринтазыВИЧ-1 и еелекарственноустойчивойформы 2.1. 86 Определение скоростидеградацииобратнойтранскринтазыдикогоилекарственно-устойчивыхизолятов ВР1Ч-1 в клетках 86 2.2. Изучениедеградациина нротеасомеобратнойтранскринтазы 89дикоготина и еелекарственно-устойчивыхизолятов

стр. 8
исследования было изучениедеградациитранскриптазыдикогоилекарственно-устойчивыхизолятовобратнойВР1Ч-1 и направлениеобратнойтранскриптазыпопротеасомномупутидеградациидля8 повышения иммуногенностиДНК-вакцинной конструкции, созданной на основе ее гена.Длядостижения этойцелибыли поставлены следующие задачи: - определить время полужизниобратнойтранскриптазы...

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Стародубова, Елизавета Сергеевна
ОГЛАВЛЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Процесс деградации белков в клетке.
2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков.
2.1. Система убиквитинирования.
2.2. Убиквитин-независимое направление белков в протеасому.
2.3. 26S протеасома.
2.3.1. 20S протеасома.
2.3.2. 19S регуляторный комплекс или РА700.
2.4. Иммунопротеасома.
2.5. Локализация протеасом в клетке.
2.6. Процессы, регулируемые убиквитин-протеасомной системой.
2.6.1. Транскрипция.
2.6.2. Регуляция клеточного цикла.
3. Роль процесса деградации белков в представлении антигена в комплексе с молекулами МНС для узнавания Т-клетками.
3.1. Представление антигенов в комплексе с МНС класса 1.
3.2. Представление антигенов в комплексе с МНС класса II.
4. ДНК-вакцины.
4.1. Развитие технологии ДНК-вакцин.
4.2. Механизм действия.
4.3. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа.
4.4. Стратегии усиления иммунного ответа на ДНК-вакцинацию.
4.5. Терапевтическое применение ДНК-вакцин.
4.6. Преимущества использования ДНК-вакцин.
5. Обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека.
5.1. Роль обратной транскриптазы в жизненном цикле ВИЧ.
5.2. Свойства обратной транскриптазы ВИЧ.
5.3. Лекарственная устойчивость обратной транскриптазы ВИЧ-1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы.
2. Методы.
2.1. Культивирование и хранение бактериального штамма.
2.2. Культивирование, криоконсервация и хранение клеточной линии НЕК293.
2.3. Трансфекция клеток линии НЕК 293.
2.4. Определение времени полужизни белка методом с импульсным включением метки (pulse-chase).
2.5. Определение времени полужизни белка методом с остановкой трансляции циклогексимидом и последующим иммуноблотингом (cycloheximide-chase).
2.6. Определение концентрации белка по методу Брэдфорд.
2.7. Клонирование фрагментов ДНК.
2.7.1. Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции.
2.7.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
2.7.3. Выделение фрагментов ДНК из геля.
2.7.4. Рестрикционный анализ ДНК.
2.7.5. Лигирование фрагментов ДНК.
2.7.6. Приготовление компетентных клеток E.coli.
2.7.7. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.
2.7.8. Выделение плазмидной ДНК.
2.8. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ.
2.9. Перенос белков из ПААГ на целлюлозную мембрану.
2.10. Иммуноокрашивание мембраны.
2.11. Создание генетических конструкций, использованных в работе.
2.11.9. Векторные молекулы, содержащие ген обратной транскриптазы
2.11.10. Клонирование вектора pCIneoODC.
2.11.11. Получение векторных молекул, кодирующих белок слияния ОТ-ОДК.
2.12. Флуоресцентная микроскопия эукариотических клеток.
2.13. Иммунизация мышей.
2.14. Иммуноферментный анализ антител в сыворотке крови мышей.
2.15. Выделение спленоцитов из селезенки мыши.
2.16. Анализ спленоцитов иммунизированных мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Экспрессия в культуре клеток обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1.
1.1. Генетические конструкции.
1.2. Содержание разных вариантов обратной транскриптазы в клетках НЕК293.
1.3. Внутриклеточная локализация обратной транскриптазы.
2. Деградация в клетках обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее лекарственно устойчивой формы.
2.1. Определение скорости деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 в клетках.
2.2. Изучение деградации на протеасоме обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1.
2.3. Оценка участия различных клеточных протеаз в деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1.
3. Искусственное усиление протеасомной деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1.
3.1. Быстрая протеасомная деградация орнитиндекарбоксилазы в клетках НЕК293.
3.2. Деградация химерного белка обратная транскриптазаорнитиндекарбоксилаза.
3.2.12. Дизайн конструкции.
3.2.13. Время полужизни.
3.2.14. Стабилизация ингибиторами протеасомы.
3.3. Иммунизация мышей ДНК-вакцинными конструкциями, несущими ген обратной транскриптазы ВИЧ-1.