Регуляция экспрессии генов коровой части острова патогенности бактерий рода Yersinia транскрипционным регулятором YbtA Анисимов, Роман Львович

brief description

Анисимов,РоманЛьвович.РегуляцияэкспрессиигеновкоровойчастиостровапатогенностибактерийродаYersiniaтранскрипционнымрегуляторомYbtA: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Пущино, 2005. - 85 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
L *( 0^-ЪЛЧ1 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ На правах рукописи АПИСИМОВРоманЛьвовичРЕГУЛЯЦИЯЭКСПРЕССИИГЕНОВКОРОВОЙЧАСТИОСТРОВАПАТОГЕНПОСТИ BAKTEPIUlРОДАYersiniaТРАНСКРИПЦИОННЫМРЕГУЛЯТОРОМYbtA03.00.03 - молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени

стр. 5
Island, HPI) (Carniel et al, 1996; Gehring et al, 1998; Rakin et al, 1999b). Предположительно, основную роль врегуляцииэкспрессиигеновостроваиграеттранскрипционныйрегуляторYbtA, AraC/XilS - подобный белок, кодируемыйгеномв составе этого жеострова(Bearden et al, 1997). Как было показано в экспериментах с мутантами,YbtAактивируетэкспрессиюбиосинтетических и транспортныхгеновHPI, но в то же время...

стр. 5
регуляцииэкспрессиигеновHPI. Целью настоящей работы являлось изучениерегуляциигеновОстроваПатоген ности. В основные задачи входило: поискYbtA-связывающих ранее последовательностей, выяснение возможности влияния предположенных эффекторов на взаимодействиеYbtAи промоторовострова, объяснение механизма

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Анисимов, Роман Львович
1 ВВЕДЕНИЕ.-6
СПИСОКСОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ .-8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.- 9
1. Утилизация железа.- 9
1.1. Значение железа для бактерий.- 9
1.2. Сидерофоры.- 9
1.2.1. Характеристика сидерофоров.-9
1.2.2. История открытия сидерофоров.- 10
2. Утилизация железа в бактериях рода Yersinia.-112.1. Особенности строения энтеробактерий.- 11
2.2. Род Yersinia.- 122.3. Системы утилизации железа в Y. enterocolitica. 13
2.4. Транслокация сидерофоров через клеточные мембраны.- 14 2.5. Депонирование железа.-152.6. Железо как регулятор.- 15
2.7. Йерсиниабактин.- 16
2.8. Остров патогенности (High Pathogenicity Island, HPI).- 173. YhtA.-193.1. Семейство AraC/XilS.- 193.2. YbtA, известные на сегодняшний день факты и предположения.-20
3.2.1. Биохимическая характеристика YbtA.-20
3.2.2. YbtA-регулируемые промоторы.- 22
3.2.3. ERIC элемент промотораybtA Y. enterocolitica.-24
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .-261. Материалы.- 26
1.1. Оборудование.- 26 v 1.2. Химикалии и ферменты.- 27
2. Бактерии, плазмнды и п ран меры.-27 2.1. Бактерии.-272.2. Праймеры.-2811 2.3. Плазм иды.-29
3. Бактериальные спелы и антибиотики, использованные в работе.-303.1. Бактериальные среды.- 30
3.2. Антибиотики.-31
4. Работа с бактериями.-314.1. Условия роста.-31
4.2. Трансформация клеток.- 33
4.3. Хранение культур.- 32
5. Использованные стандартные молекулярно-бнологнческнс и биохимические методы.- 32
5.1. Полимсразная Цепная Реакция (ПЦР).-32
5.2. Выделение и очистка ДНК.-325.2.1. Выделение хромосомальной ДНК.-32
5.2.2. Выделение плазмид.- 32
5.2.3. Выделение ПЦР-фрагментов.- 32
5.3. Выделение РНК и реакция удлинения праймера.- 33
5.3.1. Выделение РНК.-335.3.2. Реакция удлинения праймера.-33
5.4. Измерение концентрации белков и нуклеиновых кислот.- 33
5.4.1. Измерение концентрации ДНК и РНК.-33 •
5.4.2. Измерение концентрации белка.- 34
5.5. Энзиматическая модификация ДНК.- 34
5.5.1. Сайт-специфическая рестрикция.-34
5.5.2. Лигация.-345.6. Электрофоретический анализ ДНК и белков.-34
5.6.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.-34
5.6.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.-35
6. Конструирование экспресснонной плазмнды pF.T3c - YbtA.- 35
7. Очистка YbtA.-367.1. Экспрессия YbtA в Е. coli.-36
7.2. Хроматографическая очистка YbtA.-37
8. Конструирование репортерных плазмид для нзучення экспрессии YbtA - контролируемых генов и реакции удлннення праймера.... - 38
8.1. Конструирование репортерных плазмид, несущих оригинальные промоторы генов HPI. - 38
8.2. Внесение делеций в промоторы репортерных плазмид.- 40
9. ПЦР - амплификация промоторных фрагментов для EMSA и DNasel футпрннтннга.- 41
10. Очистка йепенннабактина.- 42
10.1. Биосинтез и очистка йерсиниабактина.-42, 10.2. Анализ йерсиниабактина.-42
11. Аналнз изменения злектрофоретнческой подвижности (Гель-шифт).- 43
12. Определение флуоресценции CFP при репортерном анализе.- 43
13. Р.Маче I футпринтинг.
14. Выравнивание защищенных областей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. УЫА-зависнмые промоторы НР1.
1.1. Точки начала транскрипции УЫА-зависимых промоторов НР1.
1.2. -10 и -35 последовательности УЫА-зависимых промоторов НР1.
Обсуждение.
2. Взаимодействие УЫА с промоторамн-мншенями.
2.1. Выделение УЫА.
2.2. Взаимодействие УЫА с промоторами - мишенями.
2.2.1. Комплексы УЫА-ДНК, формируемые промоторами НР1.
2.2.2. Специфические УЫА - связывающие участки.
Обсуждение.
3. Участие йеренннабактнна в регуляции УЫА-завнснмых промоторов.
3.1. Выделение йерсиниабактина.
3.2. Влияние йерсиниабактина в среде на активность УЫА-зависимых промоторов.
3.3. Оценка влияния йерсиниабактина на взаимодействия УЫА и ДНК.
3.4. Оценка возможности связывания УЫА и УЫ-Ре комплекса.
Обсуждение.
4. ЕШС-элемент промоторов ¡грб и уЫЛ У. еп(егосо1Шса.
4. Влияние ЕШС-элемента на экспрессию с промоторов ¡грб иуЫА.
Обсуждение.
5. Функция сайтов связывания УЫА 1381.1382 и 1^3 в регуляции промоторов уЫЛ и ¡грб.
5.1. Участие сайтов связывания УЫА в формировании комплексов с промоторами грб иуЬ1А.
5.2. Влияние делеций сайтов связывания УЫА на транскрипционную активность промоторов грб и уЫА.
Обсуждение.
6. Влияние компонентов системы утилизации железа на работу дивергентных промоторов уЫА и щб.
6.1. Экспрессия промоторов в мутантах дефективных по различным компонентам системы утилизации железа.
Обсуждение.