Роль специфических контактов РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК в формировании транскрипционных пауз Петушков, Иван Владимирович

brief description

Петушков,ИванВладимирович.РольспецифическихконтактовРНК-полимеразыEscherichiacoliсДНКвформированиитранскрипционныхпауз: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.03 /ПетушковИванВладимирович; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова]. - Москва, 2017. - 142 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ На правах рукописиПетушковИванВладимировичРольспецифическихконтактовРНК-полимеразыEscherichiacolicДНКвформированиитранскрипционныхпауз03.01.03 Молекулярная биология Диссертация на соискание учёной степени

стр. 2
........................................................................................ 40 2.5 МЕХАНИЗМФОРМИРОВАНИЯТРАНСКРИПЦИОННЫХПАУЗ.............................................. 42 2.5.1 Общие представления отранскрипционныхпаузах............................................ 42 2.5.2 Механизмформированиятранскрипционныхпауз.............................................. 44 2.5.3 Консенсусныепаузы...

стр. 7
последовательностяхДНК. Такие остановки называютсятранскрипционнымипаузами, а последовательностиДНК, которые их вызывают сигналамипауз.Транскрипционныепаузыиграют существеннуюрольв регуляции транскрипции, трансляции и, возможно, репарации повреждений вДНК. Несмотря на доказанную регуляторную функцию

Оглавление диссертациикандидат наук Петушков, Иван Владимирович
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Общие представления о транскрипции
2.2 Структура холофермента РНКП
2.3 Механизмы инициации транскрипции
2.3.1 Устройство промоторов главной а-субъединицы
2.3.2 Структурные основы узнавания последовательности промотора
2.3.3 Последовательность событий при инициации транскрипции
2.3.4 Альтернативные а-субъединицы
2.3.5 Классификация субъединиц а70-семейства
2.4 Механизмы элонгации транскрипции
2.4.1 Структурные основы элонгации транскрипции
2.4.2 Связывание нуклеотидных субстратов и динамика активного центра
2.4.3 Механизм катализа включения НТФ в активном центре РНКП
2.4.4 Механизм транслокации РНКП
2.4.5 Обратная транслокация
2.5 Механизм формирования транскрипционных пауз
2.5.1 Общие представления о транскрипционных паузах
2.5.2 Механизм формирования транскрипционных пауз
2.5.3 Консенсусные паузы
2.5.4 Инициаторная пауза
2.5.5 Паузы, сопровождаемые обратной транслокацией
2.5.6 Шпилько-зависимые паузы
2.6 Общие представления о терминации транскрипции
2.6 Заключение по обзору литературы
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Бактериальные штаммы
3.2. Плазмиды
3.3 Препараты белков, предоставленные сотрудниками ЛМГМ
3.4. Питательные среды и антибиотики
3.5. Компетентные клетки и трансформация бактерий
3.6. Выделение плазмидной ДНК
3.7. Выделение геномной ДНК E. coli
3.8. Рестрикция ДНК
3.9. Выделение ДНК из агарозного геля
3.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
3.10.1. Получение промоторных фрагментов ДНК
3.11. Получение рекомбинантных плазмид
3.11.1. Получение плазмиды pIA679_MXrpoB с делецией кодонов 533-546
3.11.2. Получение плазмид с мутациями в гене rpoB в векторе pBAD
3.11.3. Получение плазмиды pET29_rpoS_L117F
3.11.4. Получение плазмиды pET28_adhEp1_luxCDABE и её варианта с заменой в +11G
3.12. Электрофорез белков в денатурирующем геле
3.13. Определение концентрации белка
3.14. Суперпродукция кор-фермента и а -субъединицы РНК-полимеразы E. coli
3.15. Выделение кор-фермента РНКП E. coli
3
3.16. Выделение а -субъединицы РНК-полимеразы E. coli
3.17. Электрофорез РНК в денатурирующем геле
3.18. Транскрипция in vitro
3.18.1. Получение транскрипционных матриц
3.18.2. Тест на наличие транскрипционной активности
2.18.3. Определение кинетики диссоциации промоторных комплексов в присутствии гепарина
3.18.4. Тест по определению скорости элонгации
3.18.5. Определение продолжительности his-пауз на матрицах с сигналом пауз под контролем промотора
3.18.6. Определение продолжительности his-пауз в синтетических ЭК
3.18.7. Определение эффективности терминации транскрипции на терминаторе tR2 бактериофага X
3.18.8 Анализ а-зависимых пауз в синтетических ЭК
3.18.9 Измерение аффинности а-субъединиц к ЭК с по эффективности образования паузы
3.18.10 Исследование а338-зависимых пауз на природных промоторах
3.19. Измерение аффинности е-субъединиц к ЭК методом задержки в геле
3.20. Исследование параметров расплавленного участка комплекса в состоянии
паузы методом перманганатного футпринтинга
3.21. Эксперименты in vivo
3.21.1 Определение выживаемости клеток, экспрессирующих в-субъединицу с мутациями в CRE-кармане
3.21.2 Определение влияния мутаций в районе CRE-кармана в-субъединицы на чувствительность к антибиотику рифампицину
3.21.3 Определение влияния замены +11G в сигнале а338-зависимой паузы промотора adhE P1 на эффективность экспрессии репортерного гена
4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Роль контактов CRE-кармана с ДНК в транскрипции и формировании пауз
4.1.1 Исследование роли остатка гуанина в +2 положении промотора в стабилизации промоторного комплекса
4.1.2 Исследование влияния замен в CRE-районе на скорость элонгации транскрипции
4.1.3 Исследование роли CRE-кармана при формировании шпилько-зависимых пауз
4.1.4 Роль CRE-кармана в процессе терминации на терминаторе XtR2
4.1.5 Влияние замен в CRE-кармане РНКП на рост бактериальных клеток
38
4.2 Изучение пауз, вызванных а -субъединицеи
38
4.2.1 Изучение пауз, вызванных а -субъединицей в синтетических ЭК
38
4.2.2 Изучение пауз, вызванных а -субъединицей на промоторе adhE P1
38
4.2.3 Исследование а -зависимой паузы на промоторе adhE P1 методом
перманганатного футпринтинга
38
4.2.4 Изучение механизмов связывания а -субъединицы с ЭК при формировании
паузы на промоторе adhE P1
38
4.2.5 Исследование а -зависимой паузы на промоторе ecnB P1
4.2.6 Влияние замены +11G в сигнале паузы на матрице с промотором adhE P1 на экспрессию репортерного гена in vivo
5 ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
121
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ