Шалаева, Марина Евгеньевна. Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки параметров липофильности

brief description

Шалаева, Марина Евгеньевна. Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки параметров липофильности : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.04 / Шалаева Марина Евгеньевна; [Место защиты: Ом. гос. техн. ун-т].- Омск, 2013.- 150 с.: ил. РГБ ОД, 61 14-2/283

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омский государственный технический университет».
На правах рукописи

Шалаева Марина Евгеньевна
«Экспериментальное определение и моделирование физико-химических свойств малых биологически активных молекул посредством оценки параметров липофильности»
Специальность 02.00.04 «Физическая химия»
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель: заслуженный деятель науки и техники РФ,
доктор химических наук, профессор Кировская Ираида Алексеевна
Омск-2013
Оглавление
Условные обозначения и сокращения 6
Введение 7
Глава 1. Литературный обзор. Роль физико-химических свойств в современном процессе дизайна новых лекарственных молекул и липофильность как ведущий параметр.
1.1. Основные понятия и термины 15
1.2. logP и logD - уникальный «инструмент» для 17
исследования молекулярных свойств.
1.3. Применение липофильности в современном 19
дизайне. Правило пяти Липинского
1.4. Экспериментальные методы измерения липофильности 22
1.4.1 Классический метод «встряхивания». 22
1.4.2 Потенциометрическое титрование 24
1.4.3 Хроматографические методы измерения липофильности 25
1.5. Расчетные методы определения липофильности. logP и
logD как молекулярный дескриптор, QSAR, QSPR . 29
1.6. Определение константы ионизации рКа 31
1.7. Внутримолекулярная водородная связь в 34
контексте физиологических процессов, ее
роль, свойства и методы определения
1.8. Основные выводы по главе 38
Глава 2. Описание разработанных экспериментальных методов (2.1 - 2.3) и дополнительных используемых методов (2.4 - 2.6)
2.1. Методика проведения хроматографических измерений 41
2.2. Методика проведения электрофоретических измерений 44
2.2.1 Приготовление планшетки с образцами для измерения 44
2.2.2 Измерение рКа 44
2.2.3 Анализ результатов измерений и расчет рКа 46
2.3. Методика проведения автоматизированных измерений logP, logD 47
2.4. Методика проведения измерений logP, logD классическим методом ...48
2.5. Методика измерений методом ЯМР 49
2.6. Расчетные методы. 50
Глава 3. Разработка методов для экспериментального определения и моделирования физико-химических свойств молекул посредством оценки их липофильности.
3.1. Разработка метода измерения коэффициента распределения
(logP logD) с использованием высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ElogP, ElogD). 52
3.1.1 Выбор буфера 54
3.1.2 logkw в качестве параметра липофильности 55
3.1.3 Подходы к выбору веществ-проб необходимых для
валидации свойств системы 59
3.1.4 Условия измерений веществ с низкой липофильностью 61
3.1.5 Проверка гипотезы добавки октанола 64
3.1.6 Тестирование метода 66
3.1.7 Сравнительное изучение хроматографической и классической
систем распределения с помощью параметров сольватации. 68
3.1.8 Диапазон измерений методом ElogP 73
3.1.9 ElogD 74
3.1.10 Оптимизация хроматографического метода для
ускорения измерений 79
3.1.11 Мониторинг качества измерений 80
3.1.12 Основные выводы по разделу 81
3.2. Разработка метода измерения константы ионизации (рКа)
огранических веществ методом многоканального электрофореза 82
3.2.1 Принципы электрофоретических измерений 83
3.2.2 Система 24 буферов 85
3.2.3 Величины рКа приведенные в литературе 85
3.2.4 Определение рКа в соединениях с несколькими
ионизированными группами и близкими величинами рКа 91
3.2.5 Измерения рКа с использованием буферных смесей
метанол/вода и сравнение с литературными значениями 96
3.2.6. Сравнение рКа полученных в водных буферах и буферных
смесях метанол/вода 103
3.2.7 Дополнительные особенности измерений с использованием
; буферных смесей метанол/вода 104
3.3. Характеризация внутримолекулярной водородной связи
посредством использования коэффициента распределения
logP в системах октанол-вода и толуол-вода и
экспериментальная валидация квантово-механических
расчетов модели COSMO-RS. 108
3.3.1. Кросс валидация данных по липофильности 112
3.3.2. Определение AlogP 116
3.3.3 Валидация расчетной модели экспериментальными данными 117
3.3.4 Подтверждение образования ВМВС методом ЯМР 120
3.3.5 Категоризация по расчетным значениям COSMO-RS AlogP 124
128
3.3.6 Основные выводы по разделу
4 Основные выводы по работе
5 Список литературы
129
130

Условные обозначения и сокращения
ADME абсорбция, распределение, метаболизм, выведение
СНІ хроматографический индех гидрофобности
CSD Кембриджская Структурная база данных
DMCO диметилсульфоксид
ВМВС внутри- молекулярная водородная связь
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
F критерий Фишера
logk логарифм фактора удерживания в хроматографии logD логарифм коэффициента распределения вещества между двумя фазами, когда вещество участвует во вторичном равновесии, например ионизации, в одной или обеих фазах logP логарифм коэффициента распределения вещества между двумя , фазами, когда это вещество находится в нейтральном, неионизованном состоянии МЕЕКС микроэмульсионная электрокинетическая хроматография МОПС З-(ІМ-морфолино) пропаносульфатная соль натрия п число наблюдений
рКа отрицательный логарифм константы ионизации вещества
q коэффициент линейной корреляции в условиях перекрестного контроля с выбором по одному
г коэффициент линейной корреляции RMSE корень из квадрата ошибки s стандартное отклонение ЯМР ядерный магнитный резонанс
QSAR количественные соотношения «структура — активность»
QSPR количественные соотношения «структура - свойство»
Y-S экстраполяция значений рКа по методу Яшиды-Шедловского
Введение
Актуальность работы. Коэффициент распределения (logP) является важным параметром, характеризующим физико-химические свойства веществ в растворах, и широко применяется для моделирования поведения веществ в организмах и окружающей среде [1,2]. Распределение и перераспределение вещества между липофильной (жироподобной) и водной фазами является составной частью биологических процессов, например, процессов перехода через мембраны клеток, состоящих из липидных слоев. Он служит одним из основных оптимизируемых параметров в процессе создания новых лекарств и часто входит в уравнения для количественных расчетов зависимости «строение вещества - свойство», которые используются при дизайне молекул с необходимыми транспортными характеристиками.
Несмотря на большие усилия, создание моделей и компьютерных программ для расчета logP (logD для ионизованных молекул) остается сложной и пока не решенной задачей, в частности, для новых органических соединений, способных к многочисленным конформационным состояниям в различных средах. Экспериментальные измерения величин logP и рКа, необходимые для совершенствования расчетных моделей, продолжают представлять существенные трудности. В частности, «классический» метод измерения logP сопряжен с многоступенчатым, трудоемким экспериментом и ограничен величинами logP<3,5. Аналогичным образом, существующие методы определения констант ионизации (рКа) требуют длительных экспериментов и не позволяют проводить измерения для веществ с низкой растворимостью, что ограничивает изучение и интерпретацию молекулярных взаимодействий таких веществ в растворах.
. Наконец, образование внутримолекулярных водородных связей (ВМВС) в органических молекулах в растворах представляет большой интерес в ходе дизайна новых лекарственных молекул с заданной мембранной проницаемостью. Существующие спектральные методы определения ВМВС неприменимы на стадии создания молекулярных лекарственных библиотек, состоящих из сотен вновь синтезированных веществ. В то время как параметры липофильности в системах октанол-вода и алкан-вода могут быть использованы для характеризации внутри- и межмолекулярных взаимодействий, включая ВМВС, а также конформационной структуры молекул.
Таким образом, исследованные в диссертационной работе экспериментальные и расчетные подходы к определению параметра logP (logD) служат установлению корреляций "строение вещества - свойство" и являются необходимым компонентом процесса создания новых органических веществ с заданными свойствами.
Цель работы: Целью работы является разработка методов
экспериментального и расчетного определения параметров межмолекулярных взаимодействий малых органических молекул в растворах для установления их пространственной структуры и определяемых этой структурой свойств, в процессе дизайна новых лекарственных веществ.
При исследовании были поставлены и решены следующие задачи:
1. Разработка нового метода измерения коэффициентов распределения на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который обеспечивает точное и высокопроизводительное определение липофильности нейтральных, слабокислотных и основных веществ различных структурных классов в интервале значений logP (logD) от -1,5 до 7.
2. Разработка высокопроизводительного метода измерения констант ионизации органических молекул (рКа), применимого также для малорастворимых веществ, при использовании многоканального капиллярного элекрофореза.
3. Идентификация образующихся внутримолекулярных водородных связей в малых органических молекулах в разбавленных растворах, моделирующих биологические среды, с помощью параметризации
коэффициентов распределения в системах октанол-вода и толуол-вода.
4. Верификация результатов моделирования доминирующих молекулярных конформаций органических структур методом квантово¬механических расчетов (COSMO-RS) путем сравнительного анализа расчетных и экспериментальных значений logP.
Научная новизна
Разработан новый метод измерения липофильности на основе ВЭЖХ, позволяющий определять коэффициент распределения logP (logD) молекул различных структурных классов в диапазоне logP от -1,5 до 7, превышающем возможности «классических» измерений (по отношению концентраций в обеих фазах) на несколько порядков величин.
Показано, что модификация мобильной фазы октанолом приближает величины logk’w к моделируемому параметру logP. Предложено объяснение этого явления адсорбцией октанола на поверхности неподвижной фазы и влиянием на процессы удерживания, определяющие взаимодействия в ВЭЖХ.
Сравнением параметров сольватации показано, что межмолекулярные взаимодействия, возникающие в предложенной хроматографической (кинетической) системе, идентичны взаимодействиям в «классическом» (равновесном) эксперименте определения коэффициента распределения (logP) в системе октанол-вода.
Показано, что модификация мобильной фазы деактивирующим агентом дециламином и использование цвиттерионного буфера МОПС позволяет расширить применение метода для измерения не только нейтральных, но
также основных и слабокислотных веществ при физиологических значениях pH.
Впервые разработан метод измерения констант ионизации малораст¬воримых органических веществ при использовании многоканального капиллярного элекрофореза, позволяющий получать экспериментальные данные для веществ, ранее не доступных для измерений.
Показано, что добавки органического растворителя в процессе капиллярного элекрофореза позволяют получать данные, необходимые для расчета констант ионизации (рКа) малорастворимых органических веществ путем экстраполяции значений swpKa к водной среде.
Предложена методика измерения и схема интерпретации различия величин липофильности в системах октанол-вода и толуол-вода для идентификации возникновения ВМВС.
Показано, что расчеты конформационных состояний малых
t
органических молекул в растворах методом COSMO-RS позволяют классифицировать наиболее стабильные ВМВС в данных системах.
Положения, которые выносятся на защиту
1. Метод экспериментального определения коэффициента распределения logP посредством измерения коэффициента удерживания веществ (logk’) в хроматографической системе SupelcosilLC-ABZ - метанол-вода-МОПС буфер. Подтверждение сходства межмолекулярных взаимодействий в «классическом» (равновесном) методе измерения и предлагаемой хроматографической (кинетической) системе посредством анализа параметров сольватации.
2. Установление возможности модификации взаимодействий в хроматографической системе посредством добавки октанола (ElogP )и дециламина (ElogD) к подвижной фазе для воспроизведения межмолекулярных взаимодействий и условий распределения веществ между фазами в системе октанол-вода.
3. Обоснование применения добавок органического растворителя метанола в методе многоканального капиллярного электрофореза для определения констант ионизации (рКа) малорастворимых веществ путем экстраполяции значений swpKa к водной среде по методу Яшиды- Шедловского.
4. Предложенный метод идентификации образования внутри-молекулярных водородных связей в малых органических молекулах посредством интерпретации разницы в липофильности в системах октанол- вода и толуол-вода (logPoKT-logPTon) для описания предпочтительных конформационных состояний таких молекул в средах с низкой диэлектрической проницаемостью.
Практическая значимость работы
Разработан метод измерения коэффициента распределения на основе ВЭЖХ, позволяющий определять logP различных классов вновь синтезированных органических веществ в течение нескольких минут, используя минимальные количества вещества и предоставляя, таким образом, немедленную информацию для категоризации структурных свойств серий новых молекул и создания баз данных для моделирования свойств виртуальных молекул. Быстрое получение новых Экспериментальных данных позволяет корректировать точность расчетных моделей в реальном времени и применять их для оптимизации молекулярных структур и придания желаемых свойств вещества на этапе молекулярного дизайна, исключая, таким образом, необходимость синтеза и тестирования тысяч веществ, не удовлетворяющих свойствам лекарства.
Предложенное использование органического растворителя при определении констант ионизации методом многоканального капиллярного электрофореза существенно расширило применимость этого метода, так как позволило проводить экспериментальное определение рКа для малорастворимых веществ, ранее не доступных для измерений ввиду сложности экспериментов и требований к образцу.
Показана возможность использования липофильности для детектирования образования внутримолекулярных водородных связей и оптимизации физико-химических свойств органических молекул, способных к формированию различных структурных конформаций, без проведения сложных спектральных исследований.
Проведено исследование точности и правильности описания молекулярных взаимодействий методом кванто-химического расчета и предложена схема характеризации ВМВС с использованием рассчитанных величин logP в системах октанол-вода и толуол-вода.
- Представляемые методы в настоящее время широко применяются в разработке новых лекарственных препаратов в фармацевтической науке и промышленности, а также в отраслях, работающих с малыми органическими молекулами в биологических объектах и объектах окружающей среды.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях:
- The 14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships 2002, Bournemouth, UK
- The 16th European Symposium on QSAR and Molecular Modeling, 10-17 September 2006, Italy.
- Symposia “Computer-Aided Drug Design”, 2010, Whistler, Canada.
- XIX Int’l conference “Horizons in Hydrogen Bonding”, 2011, Gettingen, Germany.
Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 20 печатных работах, в том числе - 2 международных патента, 2 главы в книгах и 18 статей в ведущих международных научных журналах.
Индексы цитирования статей по ElogP и ElogD методам в международных научных журналах превышают 160.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и 3- х глав, включающих обзор литературы, главу по экспериментальным и расчетным методам, главу посвященную результатам исследования и их обсуждению, заключения и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 30 рисунков.

bibliography

4. Основные выводы по работе.
1. Разработан метод измерения липофильности на основе ВЗЖХ, позволяющий определять коеффициент распределения logP/logD_7,4 нейтральных и основных молекул различных структурных классов в широком диапазоне величин (-1.5 до 7), при этом точность определяется ошибкой s=0.31 .
2. Показана роль модифицирующих добавок октанола и дециламина к подвижной фазе метанол-вода в ВЭЖХ для моделирования межмолекулярных взаимодействий в «классической» системе распределения октанол-вода и приближения взаимодействий в кинетической системе ВЭЖХ к взаимодействиям в равновесной системе октанол-вода(буфер).
3. Впервые разработан метод измерения констант ионизации малорастворимых органических молекул с помощью добавок органического растворителя в процессе многоканального элекрофореза, позволяющий распространить применение метода для веществ с растворимостью менее 100 мг/мл.
4. Предложена методика измерения величин дифференциальной липофильности в системах октанол/вода и толуол/вода, а также схема интерпретации полученных величин для детектирования внутри- молекулярных водородных связей и доминирующих конформационных состояний таких органических молекул в данных
5. Продемонстрировано сходство классификации образования внутри¬молекулярных водородных связей в изученном наборе 5,6,7 членных циклов, распространенных в молекулярных структурах медицинской химии, посредством метода дифференциальной липофильности в системах октанол/вода и толуол/вода, методом ядерного магнитного резонанса и квантово-механических расчетов COSMO-RS.
6. Экспериментально подтверждены результаты квантово¬механических расчетов энергетически выгодных молекулярных конформаций и показана применимость моделей метода COSMOTherm для предсказания внутри- молекулярных водородных связей и доминирующих конформационных состояний органических структур в системах с низкой диэлектрической постоянной.
Данные приведенные в таблицах, а также дополнительные экспериментальные и расчетные детали по тематике диссертационной работы, приведены в литературных ссылках 166-227.
Диссертационная работа выполнена по материалам исследований автора проведенных и опубликованных во время работы в фармацевтической компании Пфайзер.
Автор выражает благодарность учителям, коллегам, родственникам, а также сотрудникам ОмГТУ за помощь, ценные советы и плодотворное обсуждение работы, которая заняла у автора более 20 лет.
1. Lipinski, С. A.; Lombardo, F.; Dominy, В. W.; Feeney, P. J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development. Adv.Drug. Del. Rev. 1997, 23, 3-25.
2. Раевский, O.A., Дескрипторы водородной связи в компьютерном молекулярном дизайне. Рос.хим.ж., 2006. М. L, #2, 97-107.
3. Seiler, P. Interconversion of lipophilicites from hydrocarbon/water systems into theoctanol/water system . Eur. J. Med. Chem.1974 , 9 , 473 - 479.
4. C. Hansch, A. Leo, Exploring QSAR Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, American Chemical Society, Washington, DC, 1995.
5. J. Sangster, Octanol-water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Wiley, New York, NY, 1997.
6. Leahy , D. E. , Morris , J. J. , Taylor , P. J., Wait, A. R. Membranes and their models: towards a rational choice of partitioning system . In QSAR: Rational Approaches to the Design of Bioactive Compounds , Silipo ,C. , Vittoria, A. (eds.), Elsevier,Amsterdam, 1991, Vol. 16, pp. 75 - 82 .
7. Tute , M. S. Lipophilicity: a history . In Lipophilicity in Drug Action and Toxicology , Pliska , V., Testa, B., Van de Waterbeemd ,H. (eds.), Wiley - VCH , Weinheim , 1996 ,pp. 1-26.