Создание прототипа ДНК-вакцины на основе обратной транскриптазы ВИЧ-1, повышение её иммуногенности Латанова Анастасия Александровна

brief description

Латанова,АнастасияАлександровна.СозданиепрототипаДНК-вакцинынаосновеобратнойтранскриптазыВИЧ-1,повышениееёиммуногенности: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.03 /ЛатановаАнастасияАлександровна; [Место защиты: Ин-т молекуляр. биологии им. В.А. Энгельгардта РАН]. - Москва, 2019. - 150 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
рукописиЛатановаАнастасияАлександровнаСОЗДАНИЕПРОТОТИПАДНК-ВАКЦИНЫНАОСНОВЕОБРАТНОЙТРАНСКРИПТАЗЫВИЧ-1,ПОВЫШЕНИЕЕЁИММУНОГЕННОСТИСпециальность: 03.01.03

стр. 6
факторов сдерживания инфекции. Это свидетельствует о рациональности включения RT в состав многокомпонентныхДНК-вакцинпротивВИЧ. При этом необходима оптимизация RT как компонентаДНК-вакцины, с максимальнымповышениемеёиммуногенности. Такая оптимизация требует применения ряда подходов кповышениюэффективностиДНК-вакцин. Эти подходы включают оптимизацию дизайна кодируемогоДНК-вакцинойантигена и вектора, а...

стр. 109
Данная работа посвященасозданиюпрототипаДНК-вакцинынаосновеобратнойтранскриптазы(RT)ВИЧ-1 иповышениюеёиммуногенности, в особенности к лекарственно устойчивым (ЛУ) формамВИЧ. Поэтому в исследование помимо варианта RT дикого типа (RTwt) включили вирусный вариант RT с множественными мутациями

Оглавление диссертациикандидат наук Латанова Анастасия Александровна
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ДНК-вакцины
1.1.1. Развитие технологии ДНК-вакцинации и её возможности
1.1.2. Представление ДНК-антигена иммунной системе
1.1.3. Пути оптимизации ДНК-вакцин для повышения их иммуногенности
1.1.3.1. Оптимизация кодируемого антигена (белка)
1.1.3.2. Оптимизация нуклеотидной последовательности антигена
1.1.3.3. Оптимизация вектора
1.1.3.4. Включение адъювантов
1.1.3.5. Схема вакцинации
1.1.3.6. Техника ДНК-вакцинации
1.1.3.7. Электропорация
1.1.4. Применение ДНК-вакцин в настоящее время
1.2. ВИЧ-1: характеристика вируса и вызываемой им инфекции, подходы к лечению
1.2.1. Строение и жизненный цикл ВИЧ-1. Обратная транскриптаза ВИЧ-1
1.2.2. Патогенез ВИЧ-1
1.2.3. Иммунный ответ на ВИЧ-1
1.2.4. Антиретровирусная терапия и лекарственная устойчивость ВИЧ-1
1.2.5. Вакцинация против ВИЧ-1. Клинические испытания ДНК-вакцин против ВИЧ-1
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2. 1. Объекты и материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Бактериальные штаммы и клеточные линии
2.1.3. Антитела
2.1.4. Ферменты
2.1.5. Праймеры
2.1.6. Пептиды
2.1.7. Среды и растворы для работы с клетками
2.2. Методы исследований
2.2.1. Клонирование фрагментов ДНК
2.2.1.1. Культивирование и хранение бактериальных штаммов
2.2.1.2. Амплификация фрагментов ДНК с помощью ПЦР
2.2.1.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.1.4. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.1.5. Рестрикционный анализ ДНК
2.2.1.6. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.1.7. Трансформация бактериальных клеток E. coli
2.2.1.8. Отбор положительных клонов после трансформации
2.2.1.9. Подготовка проб для секвенирования
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК
2.2.3. Получение компетентных клеток E.coli
2.2.4. Получение гомодимеров/гетеродимеров RT в E. coli
2.2.5. Измерение активности полимеразы в белках, синтезированных в E. coli
2.2.6. Измерение активности РНКазы H в белках, синтезированных в E. coli
2.2.7. Генетические конструкции, используемые в работе
2.2.8. Работа с культурами эукариотических клеток
2.2.8.1. Культивирование
2.2.8.2.Хранение и заморозка
2.2.8.3. Трансфекция
2.2.8.4. Получение проб для вестерн-блота
2.2.8.5. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ
2.2.8.6. Перенос белков из ПААГ на мембрану
2.2.8.7. Иммуноокрашивание мембраны
2.2.8.8. Измерение полимеразной активности RT в лизатах клеток и культуральных жидкостях
2.2.8.9. Определение концентрации белка по методу Брэдфорд
2.2.8.10. Подсчёт накопления RT белков после вестерн-блота
2.2.8.11. Измерение времени полужизни белка с использованием циклогексимида
2.2.8.12. Изучение деградации белка с использованием ингибиторов клеточных протеаз
2.2.8.13. Флуоресцентная микроскопия
2.2.8.14. Измерение АФК (активных форм кислорода)
2.2.9. ДНК-иммунизация и in vivo электропорация мышей
2.2.10. Выделение переферических мононуклеарных клеток крови (PBMC) иммунизированных мышей
2.2.11. Выделение спленоцитов из селезёнок иммунизированных мышей
2.2.12. IFN-y Элиспот в PBMC и спленоцитах иммунизированных мышей
2.2.13. IFN-y/IL-2 Флуороспот в спленоцитах иммунизированных мышей
2.2.14. Проточная цитофлуориметрия клеток
2.2.15. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных мышей
2.2.16. Регистрация in vivo биолюминесценции в иммунизированных мышах
2.2.17. Статистический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Дизайн вариантов обратной транскриптазы ВИЧ и их синтез эукариотическими
клетками
3.1.1. Дизайн вариантов RT
3.1.2. Синтез вариантов RT в клетках
3.2. Ингибирование активностей полимеразы и РНКазы H обратной транскриптазы
3.3. Характеристика обратной транскриптазы с множественными мутациями лекарственной устойчивости (RT 1.14-opt-in) в эукариотических клетках
3.3.1. Клеточная локализация RT1.14-opt-in
3.3.2. Деградация RT в клетках
3.3.3. Окислительный стресс, вызываемый при синтезе RT в клетках
3.4. Обратная транскриптаза с сигналом секреции (RT1.14-oil)
3.4.1. Дизайн гена
3.4.2. Синтез RT1.14-oil в эукариотических клетках
3.4.3. Локализация RT 1.14-oil
3.4.5. Деградация RT1.14-oil в клетках
3.4.6. Окислительный стресс в RT1.14-oil синтезирующих клетках
3.5. Иммуногенность обратной транскриптазы при ДНК-иммунизации мышей
3.5.1. Клеточный и антительный ответ у мышей, иммунизированных RT-кодирующими плазмидами
3.5.2. Иммуногенность RT c сигналом секреции
3.5.3. In vivo мониторирование иммунного ответа при иммунизации RT-кодирующими плазмидами
3.5.4. Влияние условий иммунизации на иммуногенность RT
3.5.4.1. Повторные иммунизации
3.5.4.2. Способы введения плазмид
3.5.4.3. Параметры электропорации
3.5.4.4. Добавление адъюванта - циклического ди-ГМФ
3.5.5. Влияние мутаций ЛУ на иммуногенность RT
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ