Трегуб Павел Павлович. Нейропротекторная эффективность сочетанного и изолированного воздействия гиперкапнии и гипоксии

Краткое описание

Трегуб Павел Павлович. Нейропротекторная эффективность сочетанного и изолированного воздействия гиперкапнии и гипоксии: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.03.03 / Трегуб Павел Павлович;[Место защиты: Сибирский государственный медицинский университет].- Томск, 2016

Г осударственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Алтайский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Трегуб Павел Павлович
НЕЙРОПРОТЕКТОРНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СОЧЕТАННОГО
И ИЗОЛИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ГИПЕРКАПНИИ
ИГИПОКСИИ
14.03.3. - патологическая физиология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Куликов В.П.
ТОМСК- 2016
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Использование гипоксии для повышения
толерантности органов и тканей к ишемии/гипоксии 13
1.2. Применение гиперкапнических воздействий
в качестве нейропротектора и терапевтического средства
при ишемически-реперфузионном повреждении 17
1.3. Эффективность гиперкапнической гипоксии
для увеличения толерантности органов и тканей к ишемии/гипоксии 22
1.4. Основные механизмы формирования
ишемической толерантности головного мозга 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Материал и объект исследования 31
2.2. Методика сочетанного и изолированного
воздействия гиперкапнии и гипоксии 31
2.3. Методика моделирования фокальной и субтотальной ишемии
головного мозга у крыс 33
2.4. Метод моделирования острой гипобарической гипоксии 34
2.5. Методика моделирования острой нормобарической гипоксии 36
2.6. Методика оценки неврологического дефицита и двигательно-координационных нарушений 36
2.7. Методика гистологического исследования
препаратов головного мозга 37
2.8. Методика определения содержания HSP-70 и S-100P
в сыворотке крови у крыс 38
2.9. Исследование роли мито-К+АТФ-каналов
и аденозиновых А1-рецепторов методом применения
активатора/блокатора механизма 39
2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных 39
2.11. Дизайн экспериментального исследования эффективности изолированного и сочетанного воздействия гипоксии
и гиперкапнии в повышении резистентности к острому дефициту кислорода и ишемии головного мозга 40
2.12. Дизайн экспериментального исследования механизмов, увеличивающих толерантность головного мозга к ишемии/гипоксии, при сочетанном воздействии гиперкапнии и гипоксии 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 45
3.1. Эффективность изолированного
и сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии
в повышении резистентности к острому дефициту кислорода 45
3.2. Нейропротекторная эффективность изолированного и сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии
при ишемии головного мозга 50
3.3. Участие протекторных белков HSP-70 и S-100P
в механизме формирования ишемической толерантности головного мозга при сочетанном и изолированном воздействии гипоксии и гиперкапнии 59
3.4. Роль митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов и А1-рецепторов к аденозину в механизме нейропротекции
при сочетанном и изолированном воздействии гипоксии и гиперкапнии 62 Глава 4. Обсуждение результатов 66
4.1. Резистентность к острому дефициту кислорода у крыс после сочетанного и изолированного
воздействия гипоксии и гиперкапнии 66
4.2. Формирование ишемической толерантности головного
мозга крыс после сочетанного и изолированного воздействия гипоксии и гиперкапнии 69
4.3. Механизмы формирования толерантности головного мозга крыс
к гипоксии/ишемии после сочетанного и изолированного воздействия гипоксии и гиперкапнии 76
Выводы 81
Список сокращений 82
Список литературы 83
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Г ипоксия является эффективным средством повышения толерантности органов и тканей к острому дефициту кислорода и ишемии [Agadzhanyan N.A. et al., 2009]. Однако недостатком гипоксических воздействий является необходимость длительной экспозиции (1-6 часов) и большого количества сеансов (не менее 7 раз) [Neckar J. et al., 2009; Yang C.C. et al., 2009], что малоперспективно для клинического применения. Поэтому актуальной научной задачей является повышение эффективности использования гипоксии для профилактики и лечения гипоксических и ишемических повреждений.
Имеются данные, свидетельствующие о протекторном потенциале гиперкапнического воздействия на нервную ткань. Доказано, что углекислый газ эффективен для нейропротекции при гипоксическом/ишемическом повреждении головного мозга [Vannucci R.C. et al., 1995]. В 2010 году был показан терапевтический эффект пермиссивной гиперкапнии при экспериментальном ишемически-реперфузионном повреждении головного мозга [Zhou Q. et al., 2010; Tao T. et al., 2013].
Существует ряд работ, демонстрирующих, что протекторная эффективность сочетанного воздействия гиперкапнии и гипоксии значительно больше по сравнению с изолированной гипоксией. Это было показано в отношении кардиопротекторного эффекта [Зверькова Е.Е., 1980; 1982] и формирования ишемической толерантности головного мозга [Беспалов А.Г. и соавт., 2004; Куликов В.П. и соавт., 2009].
В то же время в литературе не представлено исследований, посвященных сравнительному изучению эффективности изолированного и сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии для увеличения резистентности к острой гипоксии, а также формирования ишемической толерантности головного мозга. Это же касается работ, посвященных изучению механизмов нейропротекции при воздействии гиперкапнической гипоксии.
Одними из вероятных нейропротекторных механизмов сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии могут быть: активация
митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов и Аі-рецепторов к аденозину, являющихся важнейшими звеньями в феномене
гипоксического/ишемического прекондиционирования мозга [Heurteaux C. et al., 1995; Blondeau N. et al., 2000], повышение экспрессии шаперона HSP-70, индуцируемое после гипоксического воздействия [Lin H.J. et al., 2011] и белка S-100P - нейротрофического фактора и клинического маркера повреждения нервной ткани [Kleindienst A. Et al., 2004].
Степень разработанности
В литературе представлено значительное количество публикаций, посвященных толерантности мозга к действию повреждающих факторов после гипоксического прекондиционирования и тренировок [Miller B. et al., 2001; Архипенко Ю.В. и соавт., 2005; Lukianova L.D. et al., 2011]. При этом доказано, что важнейшими механизмами увеличения ишемической толерантности мозга являются такие, как ингибирование апоптоза [Fremont M. et al., 2006], активация митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов [Mayanagi K. et al., 2007] и А1-рецепторов к аденозину [Neckar J. et al., 2002], усиление экспрессии редокс-чувствительного белка HIF-1a [Lukianova L.D., 2011] и стимуляция ангиогенеза [Siafakas N.M. et al., 2001].
В последнее время появился ряд работ, демонстрирующих терапевтическую эффективность пермиссивной гиперкапнии и протекторное действие СО2 на головной мозг при гипоксическом/ишемическом повреждении [Vannucci R.C. et al., 1995; Zhou Q. et al., 2010]. Было показано, что важную роль в этом эффекте играет процесс ингибирования апоптоза в
нервных клетках [Zhou Q. et al., 2010], стимулирование ангиогенеза [Chuang
I. C. et al., 2010] и активация митоК+АТФ-каналов [Lindauer U. et al., 2003].
При этом в литературе сравнительно мало публикаций, касающихся исследования сочетанной эффективности гипоксии и гиперкапнии. Было показано, что устойчивость к экстремальному дефициту кислорода повышается более выражено при сочетании гипоксии и гиперкапнии, чем при аналогичных воздействиях изолированной гипоксии [Зверькова Е.Е., 1980; 1982]. Также было установлено, что предварительное курсовое воздействие гиперкапнической гипоксии индуцирует нейропротекцию при тотальной [Беспалов А.Г. и соавт., 2004] и субтотальной [Куликов В.П. и соавт., 2009] ишемии головного мозга.
Таким образом, в рамках изучения феномена ишемической толерантности важной научной задачей является сравнение эффективности изолированной гипоксии и гиперкапнии по отношению к их сочетанному воздействию, а также определение механизмов потенцирования их эффектов.
Всё вышеизложенное предопределило цель настоящего исследования.
Цель исследования
Сравнить эффективность изолированного и сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии для формирования ишемической толерантности головного мозга и установить важные нейропротекторные механизмы сочетания этих факторов.
Задачи исследования
1. Сравнить эффективность изолированного и сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии для повышения резистентности к острому дефициту кислорода и изучить зависимость эффекта от кратности сеансов воздействия.
2. Сравнить нейропротекторную эффективность изолированного и сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии.
3. Определить роль протекторных белков HSP-70 и S-100P в механизме формирования ишемической толерантности головного мозга после сочетанного и изолированного воздействия гипоксии и гиперкапнии.
4. Установить роль митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов и А1-рецепторов к аденозину в механизме нейропротекции после сочетанного и изолированного воздействия гипоксии и гиперкапнии.
Научная новизна
Установлено, что гиперкапническая гипоксия наиболее эффективно повышает резистентность к острой гипоксии и толерантность мозга к ишемии по сравнению с нормобарической гипоксией и пермиссивной гиперкапнией, а увеличение кратности воздействий сопровождается пропорциональным увеличением резистентности. При этом эффективность пермиссивной гиперкапнии для повышения резистентности к острому дефициту кислорода при любой кратности воздействия значительно выше эффективности нормобарической гипоксии.
Установлено, что повышение экспрессии шаперона HSP-70, увеличение синтеза белка S-100P, активация А1-аденозиновых рецепторов и митохондриальных АТФ-зависимых К+-каналов являются важными механизмами нейропротекторных эффектов при воздействии гиперкапнической гипоксии.
Теоретическая значимость и практическая значимость
Результаты проведенного исследования, продемонстрировавшие максимальную нейропротекторную эффективность сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии по сравнению с их изолированным применением, расширяют представления о влиянии на организм респираторных воздействий, изменяющих газовый гомеостаз и обеспечивающих различные комбинации гипоксии и гиперкапнии. Эксперименты, показавшие активацию АТФ-зависимых калиевых каналов и А^рецепторов к аденозину при гиперкапнически-гипоксическом воздействии, вносят значительный вклад в фундаментальные представления о механизмах нейропротекторной эффективности сочетанного и изолированного воздействия гипоксии и гиперкапнии.
Установленный в диссертационной работе факт максимальной нейропротекторной эффективности сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии, по сравнению с их изолированным воздействием, создает основу для разработки эффективных методов дыхательных тренировок для повышения неспецифической резистентности организма и формирования ишемической толерантности головного мозга.
Экспериментальные данные об участии АТФ-зависимых калиевых каналов и аденозина в механизме формирования ишемической толерантности мозга при сочетанном воздействии гиперкапнии и гипоксии создают основу для разработки метода фармакологического потенцирования нейропротекторной эффективности гиперкапнической гипоксии путем использования препаратов, воздействующих на митоК+АТФ-каналы и аденозиновые Аі-рецепторьі.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования послужил диалектический метод, базирующийся на системном подходе в изучении функционирования живого организма. Были использованы теоретико-эмпирические общенаучные методы: анализа и синтеза, индукции и дедукции, моделирования, научной абстракции, а также метод статистической обработки. Из методов естественнонаучных исследований применялись наблюдение, измерение, эксперимент и сравнение. Были использованы специальные методы гистологической обработки нервной ткани, ее окраски и морфометрии, а также специфические лабораторные методы серологической диагностики.
Положения, выносимые на защиту
1. Сочетание гипоксии и гиперкапнии в предварительных
респираторных воздействиях обладает максимальной эффективностью для повышения резистентности к острой гипобарической гипоксии и
формирования ишемической толерантности головного мозга, по сравнению с их изолированным воздействием в эквивалентных концентрациях кислорода и углекислого газа.
2. Сочетание умеренной гипоксии и гиперкапнии, в отличие от их
изолированного применения, уже после однократного воздействия увеличивает резистентность к острой гипобарической гипоксии, а
эффективность пермиссивной гиперкапнии при любой кратности использования превосходит эффективность нормобарической гипоксии.
3. Важными механизмами повышения толерантности головного мозга к
ишемии/гипоксии при сочетанном воздействии гиперкапнии и гипоксии являются: повышение синтеза HSP-70 и S-100P, активация
митохондриальных АТФ-зависимых К+-каналов и аденозиновых А1- рецепторов.
Степень достоверности и апробация результатов
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на VI Всероссийской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (г. Москва, 2011 год); на конференциях, посвященных Дню науки в Алтайском государственном медицинском университете (г. Барнаул, 2012-2015 гг.); на городских научно-практических конференциях молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2012-2013 гг.); на VII Сибирском физиологическом съезде (г. Красноярск, 25-27.06.2012 г.); на Юбилейной ХХ всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы патофизиологии» (г. Санкт-Петербург, 7-8.04.2014 г.); на I Международном конгрессе по нейронаукам (г. Красноярск, 10-12.06.2014 г.).
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертационного исследования, показавшие максимальную эффективность сочетанного воздействия гиперкапнии и гипоксии для увеличения ишемической толерантности мозга, стали основой для разработки методики применения гиперкапнически-гипоксических дыхательных тренировок на базе КГБУЗ «Детская краевая клиническая больница» г. Барнаула у детей с неврологическими нарушениями и используются в учебном процессе в рамках изучения патофизиологии (разделы «Г ипоксия и дискапния» и «Нарушения регионарного кровообращения») на базе кафедры патофизиологии, клинической патофизиологии с курсом ФПК и ППС ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 2 статьи - в зарубежных научных журналах, индексируемых базами «Web of Science» и «Scopus».
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 106 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 разделов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками. Библиографический указатель включает 214 источников (41 - на русском и 173 - на английском языках).
Личный вклад автора
Автором самостоятельно выполнены все экспериментальные исследования, проведены статистическая обработка, анализ и обобщение полученных данных, сформулированы научная новизна, положения и выводы по диссертации

Список литературы

ВЫВОДЫ
1. Гиперкапническая гипоксия максимально повышает резистентность
к острой гипобарической гипоксии по сравнению с нормобарической гипоксией и пермиссивной гиперкапнией в эквивалентных концентрациях кислорода и углекислого газа. Причем увеличение кратности предварительных гиперкапнически-гипоксических воздействий
сопровождается пропорциональным возрастанием резистентности, а эффективность пермиссивной гиперкапнии при любой кратности воздействия оказывается выше эффективности нормобарической гипоксии.
2. Сочетанное воздействие гипоксии и гиперкапнии перед моделированием субтотальной ишемии и фокального ишемического повреждения мозга оказывает максимальный нейропротекторный эффект по сравнению с пермиссивной гиперкапнией и нормобарической гипоксией.
3. Нейропротекторные эффекты при воздействии гиперкапнической гипоксии, опосредованные увеличением концентрации белка S-100P, преимущественно обусловлены действием углекислого газа, а не дефицита кислорода. При этом повышение концентрации HSP-70 в основном обусловлено действием гипоксии, однако при ее сочетании с гиперкапнией этот эффект становится более выраженным.
4. Митохондриальные АТФ-зависимые калиевые каналы и А1- рецепторы к аденозину играют важную роль в механизме увеличения резистентности к острой гипоксии/ишемии после сочетанного воздействия гипоксии и гиперкапнии. Однако в отношении аденозиновых рецепторов протекторный эффект сочетания дефицита кислорода и избытка углекислого газа реализуется без участия гиперкапнического компонента.