Рахметов Анар Джамалович Біохімічні механізми специфічної взаємодії білків пероксиредоксинів з креатинфос- фокіназою головного мозку людини за дії стресорів




  • скачать файл:
  • Название:
  • Рахметов Анар Джамалович Біохімічні механізми специфічної взаємодії білків пероксиредоксинів з креатинфос- фокіназою головного мозку людини за дії стресорів
  • Альтернативное название:
  • Рахметов Анар Джамалович Биохимические механизмы специфического взаимодействия белков пероксиредоксинив с креатинфос- фокиназою головного мозга человека при действии стрессоров Rakhmetov Anar Dzhamalovich Biokhimicheskiye mekhanizmy spetsificheskogo vzaimodeystviya belkov peroksiredoksiniv s kreatinfos- fokinazoyu golovnogo mozga cheloveka pri deystvii stressorov
  • Кол-во страниц:
  • 155
  • ВУЗ:
  • у Київсько­му національному університеті імені Тараса Шевченка
  • Год защиты:
  • 2017
  • Краткое описание:
  • Рахметов Анар Джамалович, аналітичний фахі­вець з технічних продажів компанії «Еврофінс Агро Тестінг Україна»: «Біохімічні механізми специфічної взаємодії білків пероксиредоксинів з креатинфос- фокіназою головного мозку людини за дії стресорів» (03.00.04 - біохімія). Спецрада Д 26.001.24 у Київсько­му національному університеті імені Тараса Шевченка





    Київський національний університет імені Тараса Шевченка
    Міністерство освіти і науки України
    Київський національний університет імені Тараса Шевченка
    Міністерство освіти і науки України
    Кваліфікаційна наукова
    праця на правах рукопису
    РАХМЕТОВ АНАР ДЖАМАЛОВИЧ
    УДК: 577.15.612.438:577.352
    ДИСЕРТАЦІЯ
    БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ СПЕЦИФІЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ БІЛКІВ
    ПЕРОКСИРЕДОКСИНІВ З КРЕАТИНФОСФОКІНАЗОЮ ГОЛОВНОГО МОЗКУ
    ЛЮДИНИ ЗА ДІЇ СТРЕСОРІВ
    03.00.04 – біохімія
    Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
    Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей, результатів
    і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
    ____________А. Д. Рахметов
    Науковий керівник Остапченко Л.І., докт. біол. наук, проф.
    Київ – 2017




    ЗМІСТ
    ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ……………………………………………… 11
    ВСТУП ………………………………………………………………………… 13
    РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ………………………………………………… 20
    1.1. Мультифункціональні білки як важливий захисний бар’єр
    клітини………………………………………………………………
    20
    1.1.1. Характеристика родини пероксиредоксинів………… 21
    1.1.2. Участь сульфіредоксину у процесі гіперокиснення
    пероксиредоксинів …………………………………………… 26
    1.1.3. Роль білків Prx I та Prx II у захисті клітин під час
    стресового пливу……………………………………………… 28
    1.1.4. Регуляція функціональної активності 2-Цис
    пероксиредоксинів…………………………………………… 33
    1.2. Шаперони – білки теплового шоку …………………………… 37
    1.2.1. Механізм та функції білків-шаперонів у
    клітині…………………………………………………………… 37
    1.2.2. Пероксиредоксини – олігомерні білки з вираженою
    шаперонною активністю……………………………………… 40
    1.3. Характеристика креатинфосфокінази головного мозку
    людини………………………………………………………………
    45
    1.3.1. Функціональна активність ферменту креатинфосфокінази головного мозку та її роль у клітині………………… 46
    1.3.2. Зв’язок креатинфосфокінази головного мозку з
    розвитком нейродегенеративних захворювань людини…… 50
    РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ………………………… 53
    2.1. Використанні матеріали та реактиви………………………… 53
    2.2. Клонування та експресія гена КФК ГМ……………………… 53
    9
    2.3. Очищення рекомбінантного білка КФК ГМ………………… 54
    2.4. Диск електрофорез в ДСН-поліакриламідному гелі………… 55
    2.5. Двовимірний гель електрофорез……………………………… 56
    2.6. Вестерн-блот аналіз…………………………………………… 56
    2.7. Культивування культур клітин А549 та HeLa ……………… 57
    2.8. Очищення білків зв’язаних з Prx I …………………………… 58
    2.9. MALDI-TOF-MS аналіз білків зв’язаних з Prx I……………… 58
    2.10. Ко-іммунопреціпітація (Co-IP)зв’язаних білків з КФК ГМ 59
    2.11. Отримання поліклональних антитіл КФК-ГМ ……………… 60
    2.12. Визначення креатинфосфокіназної активності
    рекомбінантного білка КФК ГМ…………………………………… 61
    2.13. Інактивація рекомбінантного білка КФК ГМ за впливу
    температури та пероксиду гідрогена……………………………… 61
    2.14. Шапероний захист Prx I та II Prx інактивованого білка КФК
    ГМ………………………………………………………………… 62
    2.15. Моделювання міжмолекулярної взаємодії білків КФК ГМ
    та Prx II……………………………………………………………… 63
    2.16. Статистична обробка даних………………………………… 63
    РОЗДІЛ 3 ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБІНАНТНОГО БІЛКА КРЕАТИН -
    ФОСФОКІНАЗИ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЛЮДИНИ…………………………… 64
    3.1. Клонування та експресія гена CKB людини ………………… 64
    3.2. Очищення рекомбінантного білка КФК ГМ з клітин E.
    coli…………………………………………………………………… 71
    3.3. Оцінка селективності поліклональних антитіл КФК ГМ за
    допомогою вестерн-блот аналізу…………………………………… 76
    3.4. Виявлення питомої активності рекомбінантного білка КФК
    ГМ за допомогою специфічної ферментативної реакції ………… 77
    10
    РОЗДІЛ 4 ІДЕНТИФІКАЦІЯ КФК ГМ ЯК БІЛКА-ПАРТНЕРА ПЕРОКСИРЕДОКСИНІВ PRX I ТА PRX II…………………………………………………… 83
    4.1. Використання підходів протеоміки для пошуку білківпартнерів Prx I ……………………………………………………… 83
    4.2. In vitro взаємодія КФК ГМ з білками Prx I та Prx II у клітинах
    A549 та HeLa………………………………………………………… 87
    4.3. Зміна спорідненості взаємодії між КФК ГМ і білкамипартнерами Prx І та Prx II шляхом індукованого теплового шоку
    та пероксиду гідрогена……………………………………………… 91
    4.4 Вплив С-термінального вкорочення Prx II на зміну
    спорідненості до білка КФК ГМ …………………………………… 97
    4.5 Захист питомої активності КФК ГМ від інактивації
    температурою та пероксидом гідрогена завдяки шаперонним
    властивостям білків Prx I та Prx II………………………………… 100
    РОЗДІЛ 5 МОДЕЛЮВАННЯ БІЛОК-БІЛКОВОЇ ВЗАЄМОДІЙ МІЖ КФК ГМ
    ТА PRX II …………………………………………………………………………… 107
    УЗАГАЛЬНЕННЯ ………………………………………………………………… 111
    ВИСНОВКИ………………………………………………………………………… 123
    СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ………………………………………… 125
    ДОДАТОК 1………………………………………………………………………… 154
    11
    ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
    АТФ Аденозинтрифосфат
    AhpC Алкілгідропероксид редуктаза
    КФК ГМ Креатинфосфокіназа головного мозку
    ДТТ Дитіотреітол
    ДЕАЕ Диетиламіноетил
    ЕДТА Етилендиамінтетраоцтова кислота
    GSH Глутатіон відновлений
    HMW Високомолекулярні комплекси
    MALDI Матрично-активована лазерна десорбція/іонізація
    IPG Іммобілізований рН градієнт
    ІПТГ Ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозид
    IAA Йодоацетамід
    LMW Низькомолекудярні комплекси
    КФК М Креатинфосфокіназа м’язів
    НАД+ Нікотинамідаденіндинуклеотид окиснений
    НАДН Нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений
    NTA Ni2+
    -нітрилотриацетатна кислота
    Prx Перексиредоксин
    PBS Натрій-фосфатний буфер
    АФК Активні форми кисню
    ДСН-ПААГ Додецилсульфат натрію-електрофорез в поліакриламідному
    гелі
    Srx Сульфіредоксин
    TSA Тіол-специфічний антиоксидант
    Trx Тіоредоксин
    12
    TR Тіоредоксин редуктаза
    ДСН Додецидсульфат натрію
    13
    В С Т У П
    Актуальність теми.
    На сьогодні типові пероксиредоксини класу 2-Цис (2-Цис Prxs)
    представляють групу тіол-специфічних антиоксидантних ферментів, що
    демонструють високу каталітичну активність (k=106
    -108M
    -1
    s
    -1
    ) для нейтралізації
    АФК та органічних пероксидів порівняно з каталазою чи глутатіонпероксидазою
    [1, 2]. На прикладі людського Prx ІІ показано, що каталітичний цикл ензиму
    починається з окиснення пероксидазного цитеїну Цис-50 (CP) до сульфенової
    кислоти. Де Цис-50 однієї субодиниці димеру реагує з відновлюючим цистеїном
    Цис-171 (CR), що знаходиться на другій субодиниці димеру Prx II. В результаті
    такої взаємодії утворюється гомодимер, з’єднаний дисульфідними зв’язками.
    Переведення Prx ІІ у фізіологічно активний стан відбувається завдяки
    відновлюючим властивостям білка тіоредоксину (Trx) та джерела протонів
    НАДФН . Варто зазначити, що відновлення функціональної активності Prx ІІ за
    втручання Trx та окиснення НАДФН відбувається повільніше, а ніж окиснення
    H2O2 [2].
    Вважається, що активність 2-Цис Prxs є унікальною, оскільки крім
    пероксидазної функції вони є модуляторами сигнальних процесів завдяки
    інактивації високими концентраціями пероксиду гідрогена та переходу в
    гіперокиснений стан. Цей ефект лежить в основі «floodgate» механізму та
    характеризує сигнальну функцію Prx [3, 4, 5]. Білки 2-Цис Prxs мають високу
    каталітичну специфічність до пероксиду гідрогена, що дозволяє регулювати
    трансдукцію сигналу в клітині за рахунок регулювання концентрації H2O2. Функція
    клітинних модуляторів H2O2 вказує на причетність 2-Цис Prxs до розвитку/супресії
    ракових клітин, нейродегенаративних, серцево-судинних захворювань та
    метаболітичних порушень [6, 7, 8, 9].
    14
    Регуляція сигнальних процесів за рахунок 2-Цис Prxs відбувається у
    відповідності до трьох механізмів, що не виключають один одного. Перший
    механізм передбачає пряму взаємодію пероксиду гідрогена з цільовим сигнальним
    білком, де Prxs контролюють цей процес регулюючи концентрацію пероксиду
    гідрогена. Відповідно до другого механізму відбувається окиснення Prxs
    молекулою H2O2, що далі активує сигнальний білок, наприклад певні
    транскрипційні фактори або фосфатази. В основі третього механізму лежить
    взаємодія окисненного Prx ще з однією молекулою H2O2 та відновлення активного
    стану Prxs білком-партнером Trx, що далі передає окиснювальний сигнал на
    сигнальний білок [10].
    2-Цис Prxs піддаються зміні олігомерного стану від низькомолекулярних
    форм до високомолекулярних комплексів під впливом гіперокиснення. Як
    результат, декамерні структурні одиниці білка збираються в «стопки», що ініціює
    функціональну трансформацію пероксидазних білків до білків шаперонів. Такий
    перехід може регулюватись температурою чи окисним станом клітини [11].
    Додатково відмічено, що олігомеризація бактеріального пероксиредоксину може
    бути спровокована високою іонною силою, чи зміною рН, де падіння значення рН
    під час окиснення призводить до зміщення олігомеризації в бік формування
    декамерів та втратою шапероної активності. Дослідження Wood et al [12]
    демонструють залежність олігомеризації бактеріального пероксиредоксину AhpC
    (S.typhimurium) від редокс-статусу з переважним формуванням (α2)5 декамерів у
    розчині [12]. Збирання HMW комплексів білків 2-Цис Prxs може також бути
    спровоковане температурним стресом. Показано, що ці комплекси захищають
    клітину від теплового шоку [13]. Відповідно, їх можна порівняти з активністю
    білків теплового шоку sHSPs, які мають гарно організовану олігомерну структуру
    та постійну кількість субодиниць [14, 15]. Комплекси HWM 2-Цис Prxs можуть
    мати молекулярну масу від 40-1000 кДа та демонструють шаперонну активність з
    15
    дисоціацією на низькомолекулярні форми LMW, що мають пероксидазну
    активність.
    Креатинкіназа головного мозку людини, КФК ГМ – це цитозольний
    гомодимерний білок з молекулярною масою мономеру 42 кДа. Фермент переважно
    експресується в головному мозку та ретині ока, де каталізує обернену реакцію
    преносу γ-фосфорильної групи молекули АТФ на креатин, в результаті чого
    утворюється фосфокреатин та АДФ. КФК ГМ вважається ферментом, що
    забезпечує тимчасовий енергетичний буфер у разі посиленої потреби в АТФ [16,
    17].
    Якщо порівняти рівні експресії креатинфосфокінази у різних видах ракових
    пухлин, наприклад ліній ракових клітин легеневої карциноми, карциномі грудей та
    простати, а також нейробластом будуть спостерігатись різні механізми ініціації
    надекспресії білка КФК ГМ. Один з механізмів, що сприяє надекспресії КФК ГМ –
    це онкогенетична активація аденовірусу E1a, яка спричинена тим, що промотор
    гена CKB вміщає специфічну сигнальну послідовність до продукту E2E гена
    аденовірусу [18]. Слід зазначити, що негативно регуляція експресії КФК ГМ
    здійснюється завдяки пухлино-супресуючій активності фактору р53 [19]. Така
    підвищена активність ензиму у пухлинних новоутвореннях необхідна для
    забезпечення енергетичних витрат на належному рівні. Ракові клітини зазвичай
    характеризуються високим рівнем фосфокреатину (PCr), але їхній ріст інгібований
    циклічним креатином (cCr), фосфорильована форма якого є поганим субстратом
    для КФК ГМ і може виступати його інгібітором. Тому було описано декілька
    аналогів креатинфосфокінази, що проявляють цитотоксичну активність і можуть
    бути багатообіцяючими у розробці антиракових препаратів [20]. Експресія гена
    CKB включає: альтернативний сплайсинг, множинну ініціацію рибосом, та
    різноманітні посттрансляційні модифікації [21, 22, 23].
    Для оцінки стабільності ферменту КФК ГМ було досліджено вплив
    різноманітних стресорів таких як сечовина, гуанідин гідрохлорид, температура [24,
    16
    25, 26]. Молекулярний шаперон GroEL здатен зв’язувати вторинну структуру КФК
    ГМ, інактивовану сечовиною, що призводить до ефективної супресії агрегації білка
    на стадії розплавленної глобули [27, 28]. Було показано, що температурна агрегація
    КФК ГМ задовільняє валідаційні критерії необерненої двух-стадійної моделі за
    Кургановим [29]. Під час впливу температури креатинфосфокіназа підається
    послідовним структурним змінами. Ідентифіковано стабільний мономер,
    відновлення якого після температури не вище 55°С корелює з можливістю
    об’єднання мономерів у функціональний димерний білок [30]. КФК ГМ виступає
    одною із головних мішеней окисного сресу під час нейродегенеративних хвороб [31,
    32, 33]. Відмічено участь пострансляційних модифікацій у зниженні КФК ГМ
    активності під час хвороби Альцгеймера. Знижена активність КФК ГМ може
    слугувати біомаркером для покращеної ідентифікації розвитку
    нейродегенеративних хвороб на ранніх стадіях [34].
    Беручи до уваги важливості родини 2-Цис Prxs як пероксидазних так і
    шапероних білків та буферну енергетичну функцію ферменту КФК ГМ постає
    потреба детального дослідження зв’язків цих ензимів та їх поведінки in vitro за
    умов стресу, викликаного температурою чи гіперокисненням. Вищевказане стало
    основою для формування мети та постановки задач дослідження даної
    дисертаційної роботи.
    З’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу
    виконано на кафедрі біохімії ННЦ «Інститут біології» Київського національного
    університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідної теми: № 11БФ036-
    01 «Механізми реалізації адаптаційно - компенсаторних реакцій організму за умов
    розвитку різних патологій» (2011-2015 рр., № д/р 0111U004648).
    Мета та задачі дослідження. Мета роботи - оцінка взаємодії між білками Prx
    I/Prx II та КФК ГМ за фізіологічних умов in vitro та впливу стресорів температури
    та пероксиду гідрогена . Дослідження шапероних властивостей білків Prx I/Prx II на
    прикладі специфічної рекакціїї фосфорилювання креатину за участі КФК ГМ.
    17
    Для досягнення мети досліджень були поставлені такі задачі:
    1. Отримати рекомбінантний білок КФК ГМ та провести його очищення.
    2. Визначити ферментативну активність рекомбінантного білка КФК ГМ за дії
    температури та пероксиду гідрогена .
    3. Проаналізувати ендогенну взаємодію між експресовани білком КФК ГМ та
    білками Prx I і Prx II у клітинних лінія А549 та HeLa.
    4. Оцінити, як укорочення С-термінальної ділянки Prx II впливає на зміну
    афінності з білком КФК ГМ на клітинах ліній А549 та HeLa.
    5. Оцінити шаперонні властивості білків Prx I та Prx II при визначенні
    ферментативної активності КФК ГМ за дії температури та пероксиду
    гідрогена .
    6. Створити моделі взаємодії між Prx II та КФК ГМ.
    Об’єкт дослідження – внутрішньоклітинна взаємодія між білками
    пероксиредоксинами, а саме Prx I та Prx II з креатинфосфокіназою головного мозку
    людини в умовах in vitro у контролі та після впливу стресорів температури та
    пероксиду гідрогена. Шапероні властивості Prx I та Prx II по відношенню до білкапартнеру КФК ГМ.
    Предмет дослідження – отриманий рекомбінантний білок КФК ГМ, активність
    КФК ГМ, рівень експресії in vitro білків КФК ГМ, Prx I та Prx II, афінність взаємодії
    in vitro білків КФК ГМ, Prx I, Prx II, та транкованих С-термінальних мутантів Prx II,
    шаперона активність PrxI та Prx II.
    Методи дослідження: ПЛР, трансфекція та експресія рекомбінантного білка,
    аніонно-обміна та афінна хроматографія, MALDI-TOF аналіз, культура клітин, 1-D,
    2-D ДСН-ПААГ електрофорез, вестер-блотинг, ко-імунопреципітація,
    спектрофотометрія, статистичний аналіз.
    Наукова новизна одержаних результатів. Клоновано та очищено
    ферментативно активний рекомбінантний білок. Оцінена фосфорилююча
    активність КФК ГМ в умовах специфічної ферментативної реакції при дії стресорів
    18
    температури та пероксиду гідрогена . Вперше продемонстровано, що КФК ГМ
    взаємодіє з Prx I в гомогенаті головного мозку щурів. Також, показана взаємодія
    КФК ГМ з Prx I та Prx II в лізатах клітинних ліній HeLa та A549 за використання
    реакції ко-імунопреципітації. Вперше досліджено, що афінність взаємодії Prx II з
    КФК ГМ сильніша, а ніж між Prx I з КФК ГМ в умовах in vitro. Показано, що
    вкорочення С-термінальної ділянки Prx II немало впливу на силу взаємодії між Prx
    II та КФК ГМ. Вперше продемонстровано залежність інтенсивності взаємодії білків
    Prx II та КФК ГМ під впливом температури та пероксиду гідрогена прикладі
    клітинних ліній HeLa та A549. Підтверджено ефективність білків шаперонів Prx I та
    Prx II в попередженні агрегації та відновленні ферментативної активності білкапартнеру КФК ГМ за умов стресових факторів температури та пероксиду гідрогена .
    Практичне значення отриманих результатів Результати роботи надають
    можливості глибше усвідомити функціональну різноманітність та важливість білків
    пероксиредоксинів для підтримання клітинного гомеостазу. Підтвердження
    взаємодії між білками Prx I, Prx II та КФК ГМ розширює уявлення на мережу
    білків-партнерів, які знаходяться під захистом Prxs. Оскільки КФК ГМ вважається
    одним із головних маркерів патологічних станів, таких як нейродегенеративні
    хвороби Альцгеймера, Паркісона, Хантінгтона, ангіогенезу ракових пухлин, та ін.
    постає питання дослідження та попередження інгібування/активації її функції за
    допомогою внутрішньоклітинних механізмів взаємодії з білками
    пероксиредоксинами. Ще одним важливим внеском цієї роботи є розширення знань
    про шаперонну функцію Prx I та Prx II, та її активацію внаслідок дії стресорів
    температури та пероксиду гідрогена . Ідентифікація Prx I PrxII як білків-партнерів
    КФК ГМ може слугувати попередником для створення терапевтичних стратегій
    лікування нейродегенеративних захворювань чи раку.
    Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено підбір
    літературних джерел та аналіз даних літератури, інтерпретацію та статистичну
    обробку одержаних результатів, оформлення рисунків та таблиць. Усі
    19
    експериментальні результати отримані дисертантом особисто або за його
    безпосередньої участі. Головна ідея та задачі досліджень були сформовані
    науковим керівником – д.б.н., проф. Остапченко Л.І. та к.б.н., Хо Зун Че (Ho Zoon
    Chae), Чоннамський Національний Університет (Chonnam National University).
    Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи
    були представлені на науковій конференції «Experimental Biology 2012» (San Diego,
    USA, 2012), 9-й Міжнарожній науково-практичній конгресі «Шевченківська Весна»
    (Київ, 2013), 11-й Міжнародній науковій конференції «Молодь і поступ біології»
    (Львів, 2013), 9-му Українському біохімічному конгресі (Київ, 2014).
    Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 наукових праць: 5 статей у
    фахових виданнях та 4 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій та
    конгресів.
    Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 157
    сторінках друкованого тексту, містить 41 рисунок, 1 таблицю. Робота складається зі
    анотації, вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження та їх
    обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел (253 посилання)
  • Список литературы:
  • ВИСНОВКИ
    Отримані результати досліджень розкривають біохімічні механізми
    специфічної взаємодії пероксиредоксинів з креатинофосфокіназою головного мозку
    людини за фізіологічних умов та за умов дії стресорів. Вперше встановлено
    взаємодію білків Prx I/ Prx II та КФК ГМ на прикладі клітинних ліній HeLa та А549
    та оцінено зміну афінності взаємодії при підвищеній температурі та концентрації
    пероксиду гідрогену. Вперше продемонстровано шаперонні властивості білків Prx
    I/ Prx II по відношенню до КФК ГМ на приладі специфічної реакції
    фосфорилювання креатину. Проведено моделювання взаємодії декамерного білку
    Prx II та димерної КФК ГМ за допомогою он-лайн докінг серверу для оцінки
    ділянок взаємодії двох білків. Перераховані вище дослідження розкривають нові
    аспекти функціонування перосиредоксинів Prx I, Prx II у ролі білків шаперонів, що
    здатні проявляти захисні властивості по відношенню до білків партнерів. Це у свою
    чергу, може послужити підґрунтям для створення медичних препаратів для
    лікування нейродегенератавних хвороб.
    1) Використовуючи підходи молекулярної біології було успішно
    клоновано послідовність гену CKB білка КФК ГМ. Отримано рекомбінантний білок
    КФК ГМ шляхом експресії в бактеріальних клітинах E.coli, та проведено його
    очищення за допомогою хроматографічних методів розділення;
    2) Оцінено питому ферментативну активність рекомбінантного білка КФК
    ГМ на прикладі специфічної реакції фосфорилювання креатину. Показано, що
    питома активність КФК ГМ була інгібовано на 36%, 57%, та 86% при температурі
    38°С, 40°С та 42°С, а також на 17%, 58% та 74% за концентрації пероксиду
    гідрогену 0,25 мМ, 0,5 мМ та 1 мМ відповідно. Встановлено, що питома активність
    КФК ГМ є більш вразливішою до температурного стресу, а ніж до пероксиду
    гідрогену;
    124
    3) Завдяки методу ко-імунопреципітації продемонстровано ендогенну
    взаємодію між експресованим білком КФК ГМ з Prx I та ко-трансфекованим Prx II
    на прикладі клітин HeLa та A549. Встановлено, що КФК ГМ є білком-партнером
    білків Prx I та Prx II. Показано, що Prx II має вищу афінність до КФК ГМ у
    порівнянні з Prx I в обох клітинних лініях A549 та HeLa. Продемонстровано
    послаблення взаємодії між Prx II та КФК ГМ в клітинних лініях HeLa та A549 під
    час гіперокиснення, що вказує на не причетність олігомеризації до взаємодії між
    білками Prx II та КФК ГМ;
    4) Оцінено, що укорочення С-термінальної ділянки Prx II суттєво не
    впливало на зміну афінності з білком КФК ГМ на клітинах ліній A549 та HeLa.
    5) Показано, що за умов дії стресу білки Prx I та Prx II проявляють захисні
    властивості до інгібування КФК ГМ. У випадку Prx I максимальні значення питомої
    активності КФК ГМ спостерігались за співвідношення 1:10, як за температури 42°С
    так і при 1 мМ пероксиду гідрогену. В той самий час, Prx II демонстрував
    позитивний характер відновлення питомої активності КФК ГМ навіть за
    співвідношення 1:20.
    6) За моделювання взаємодії між КФК ГМ та Prx II за допомогою серверу
    ClusPro2.0 відмічено важливість амінокислотних залишків Arg 209, Ala 204 Cтермінальної ділянки, та Lys 11, Arg 13 N-термінальної ділянки КФК ГМ, в також
    залишків Glu 167, Gln163, Asp181, Glu 192, Lys 196 С-термінальної ділянки Prx II.
  • Стоимость доставки:
  • 200.00 грн


ПОИСК ДИССЕРТАЦИИ, АВТОРЕФЕРАТА ИЛИ СТАТЬИ


Доставка любой диссертации из России и Украины


ПОСЛЕДНИЕ СТАТЬИ И АВТОРЕФЕРАТЫ

Ржевский Валентин Сергеевич Комплексное применение низкочастотного переменного электростатического поля и широкополосной электромагнитной терапии в реабилитации больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области
Орехов Генрих Васильевич НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ТЕХНИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭФФЕКТА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОАКСИАЛЬНЫХ ЦИРКУЛЯЦИОННЫХ ТЕЧЕНИЙ
СОЛЯНИК Анатолий Иванович МЕТОДОЛОГИЯ И ПРИНЦИПЫ УПРАВЛЕНИЯ ПРОЦЕССАМИ САНАТОРНО-КУРОРТНОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ НА ОСНОВЕ СИСТЕМЫ МЕНЕДЖМЕНТА КАЧЕСТВА
Антонова Александра Сергеевна СОРБЦИОННЫЕ И КООРДИНАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОНАТОВ ДВУХЗАРЯДНЫХ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ В РАСТВОРЕ И НА ПОВЕРХНОСТИ ГИДРОКСИДОВ ЖЕЛЕЗА(Ш), АЛЮМИНИЯ(Ш) И МАРГАНЦА(ІУ)
БАЗИЛЕНКО АНАСТАСІЯ КОСТЯНТИНІВНА ПСИХОЛОГІЧНІ ЧИННИКИ ФОРМУВАННЯ СОЦІАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ СТУДЕНТСЬКОЇ МОЛОДІ (на прикладі студентського самоврядування)