Короткий Олександр Григорович Біохімічні механізми ремоделювання хрящової тканини при експериментальному остеоартриті

Краткое описание

Короткий Олександр Григорович, заступник директора з науково-педагогічної та виховної роботи Навчально-наукового центру «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка. Назва дисертації: «Біохімічні механізми ремоделювання хрящової тканини при експериментальному остеоартриті». Шифр та назва спеціальності 03.00.04 біохімія. Спецрада Д26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця правах рукопису
КОРОТКИЙ ОЛЕКСАНДР ГРИГОРОВИЧ
УДК 616.72-018.3:615.2/.3:577.121
ДИСЕРТАЦІЯ
БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ РЕМОДЕЛЮВАННЯ ХРЯЩОВОЇ
ТКАНИНИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ОСТЕОАРТРИТІ
03.00.04 – біохімія
Подається на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
_______________ О.Г. Короткий
Науковий консультант: Остапченко Людмила Іванівна, д.б.н., проф.
Київ – 2021

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ…..............................................................23
ВСТУП....................................................................................................................26
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ......................................................................35
1.1 Основні етіопатогенетичні фактори розвитку остеоартритів.................35
1.2 Участь мікробіоти травного тракту в патогенезі захворювань опорнорухового апарату………………………………………………………….41
1.3 Біохімічні механізми розвитку остеоартриту….………………………..46
1.3.1 Маркери метаболічних змін у суглобі за остеоартриту…………52
1.4 Терапевтичні та профілактичні фармакологічні стратегії при
захворюваннях суглобів………………………………..............................61
1.4.1 Особливості застосування хондропротекторів за остеоартриту...62
1.4.2 Перспективи застосування препаратів коригувального впливу на
мікробіоту за остеоартриту…………………..…………………………..69
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ….....……………….80
2.1 Використані реактиви та матеріали...........................................................80
2.2 Прилади та обладнання…………………………………………………...82
2.3 Умови проведення експерименту..............................................................83
2.4 Отримання сироватки крові щурів............................................................86
2.5 Отримання гомогенату хрящової тканини................................................86
2.6 Дослідження підгострої токсичності хондроїтину сульфату за
показниками загального аналізу, лейкоцитарної формули крові та
морфо-функціонального стану печінки…………………………………86
2.7 Визначення видового та кількісного складу фекальної мікробіоти.......88
2.8 Гістологічний аналіз зрізів колінних суглобів………………………….88
2.9 Визначення концентрації біохімічних маркерів метаболізму хрящової
тканини, простагландину Е2, вмісту матриксних металопротеїназ,
цитокінів, факторів росту та розчинних форм Toll-подібних
рецепторів…………………………………………………………………89
20
2.10 Визначення вмісту супероксидного радикалу ………………………….90
2.11 Визначення вмісту гідрогену пероксиду................................…………...91
2.12 Визначення вмісту дієнових кон’югатів та шиффових основ
ненасичених жирних кислот……………………………………………..92
2.13 Визначення вмісту ТБК-активних продуктів.................................……..93
2.14 Визначення вмісту продуктів окисної модифікації білків..……………94
2.15 Визначення супероксиддисмутазної активності......................................95
2.16 Визначення каталазної активності......................................................…...96
2.17 Визначення глутатіонпероксидазної активності...........................……...96
2.18 Визначення глутатіонтрансферазної активності...........................……...97
2.19 Визначення глутатіонредуктазної активності..........................................97
2.20 Визначення вмісту відновленого та окисненого глутатіону.......………98
2.21 Визначення концентрації білка..................................................................99
2.22 Імуногістохімічний аналіз зрізів колінних суглобів……........................99
2.23 Аналіз експресії генів за допомогою ПЛР у реальному часі…………100
2.23.1 Виділення загальної РНК.............................................................101
2.23.2 Оцінка експресії генів...................................................................101
2.24 Статистична обробка отриманих результатів.........................................103
РОЗДІЛ 3 ВИДОВИЙ ТА КІЛЬКІСНИЙ СКЛАД МІКРОБІОТИ ТОВСТОЇ
КИШКИ ЩУРІВ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОАРТРИТУ
ПРИ ВВЕДЕННІ ХОНДРОЇТИНУ СУЛЬФАТУ ТА ПРОБІОТИКА.............104
РОЗДІЛ 4 ГІСТОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ ДИСТРОФІЧНОДЕГЕНЕРАТИВНИХ ЗМІН КОЛІННОГО СУГЛОБА ЩУРІВ ЗА УМОВ
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОАРТРИТУ ПРИ ВВЕДЕННІ
ХОНДРОЇТИНУ СУЛЬФАТУ ТА ПРОБІОТИКА…..……………………….112
РОЗДІЛ 5 БІОХІМІЧНІ МАРКЕРИ МЕТАБОЛІЗМУ ХРЯЩОВОЇ
ТКАНИНИ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОАРТРИТУ ПРИ
ВВЕДЕННІ ХОНДРОЇТИНУ СУЛЬФАТУ ТА ПРОБІОТИКА......................123
5.1 Концентрація основних біохімічних показників метаболізму хрящової
тканини в сироватці крові щурів……………………………………….123
21
5.2 Вміст матриксних металопротеїназ у сироватці крові та хрящовій
тканині суглоба щурів…………………………………………...………131
5.3 Експресія структурних генів Col2a1, Acan та Comp у хрящовій тканині
суглоба щурів.……………………………………………………………138
РОЗДІЛ 6 ОЦІНКА СТАНУ ЗАПАЛЬНОГО ПРОЦЕСУ ЗА УМОВ
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОАРТРИТУ ПРИ ВВЕДЕННІ
ХОНДРОЇТИНУ СУЛЬФАТУ ТА ПРОБІОТИКА….………………………..147
6.1 Вміст катаболічних медіаторів запалення в сироватці крові та
суглобовому хрящі щурів………………………...……………………..147
6.2 Вміст анаболічних протизапальних цитокінів і факторів росту в
сироватці крові та суглобовому хрящі щурів…..…...…………………155
6.3 Концентрація простагландину Е2 в сироватці крові щурів…………...160
6.4 Рівень експресії генів Ptgs2, Nos2, Tgfb1 у хрящовій тканині та
сироватці крові щурів…………………………………………………...163
РОЗДІЛ 7 ОКИСНО-АНТИОКСИДАНТНИЙ ГОМЕОСТАЗ У СИРОВАТЦІ
КРОВІ ТА ХРЯЩОВІЙ ТКАНИНІ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО
ОСТЕОАРТРИТУ ПРИ ВВЕДЕННІ ХОНДРОЇТИНУ СУЛЬФАТУ ТА
ПРОБІОТИКА…………………………………………………………………..177
7.1 Вміст активних форм кисню в сироватці крові та хрящовій тканині
щурів...........................................................................................................177
7.2 Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів у сироватці крові та
хрящовій тканині щурів............................................................................181
7.3 Вміст продуктів окисної модифікації білків у сироватці крові та
хрящовій тканині щурів............................................................................185
7.4 Стан антиоксидантної системи у сироватці крові та хрящовій тканині
щурів………………………………...………………………..…………..190
7.4.1 Антирадикальні супероксиддисмутазна та каталазна
ферментативні активності..............................................................190
7.4.2 Вміст глутатіону та глутатіонзалежна ферментативна
активність………………………………………………………….195
22
РОЗДІЛ 8 МЕХАНІЗМИ СИГНАЛЬНОЇ РЕГУЛЯЦІЇ РЕМОДЕЛЮВАННЯ
ХРЯЩОВОЇ ТКАНИНИ ЗА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОАРТРИТУ
ПРИ ВВЕДЕННІ ХОНДРОЇТИНУ СУЛЬФАТУ ТА ПРОБІОТИКА.............205
8.1 Експресія Toll-подібних рецепторів TLR-2, TLR-4 та ядерного фактора
NF-κВ у тканинах колінного суглоба щурів………………………….....205
8.2 Вміст розчинних форм TLR-2 та TLR-4 у сироватці крові щурів.….....216
8.3 Рівень експресії генів Tlr2, Tlr4 та Nfkb1 у хрящовій тканині колінного
суглоба щурів………………………………………………………...........219
РОЗДІЛ 9 АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
ДОСЛІДЖЕННЯ………………………………………………………………..229
ВИСНОВКИ.........................................................................................................243
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ...........................................................246
Додаток А
23
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АОС антиоксидантна система
АФК активні форми кисню
ГА глюкозамін
ГАГ глікозаміноглікани
ГАС глюкозамінсульфат
ГАХ глікозамінгідрохлорид
ГК гіалуронова кислота
ГП глутатіонпероксидаза
ГР глутатіонредуктаза
ГТ глутатіонтрансфераза
ДК дієнові кон’югати
ДНФГ динітрофенілгідразин
ДТНБК 5,5'-дитіо-біс-2-нітробензойна кислота
ЕІ ендогенна інтоксикація
ІЛ інтерлейкін
ІФА імуно-ферментний аналіз
ІФН-γ інтерферон γ
ІФР-1 інсуліноподібний фактор росту 1
КАТ каталаза
КС кератансульфат
ЛПС ліпополісахариди
МЙА монойодацетат натрію
МКА молекули клітинної адгезії
ММП матриксні металопротеїнази
МНСММ молекули низької та середньої молекулярної маси
НАД+ нікотинамідаденіндинуклеотид окиснений
НАДН нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений
НАДФН нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат відновлений
24
НПЗП нестероїдні протизапальні препарати
НСТ нітросиній тетразолій
ОА остеоартрит
ОМБ окисна модифікація білків
ОП олігопептиди
ОРА опорно-руховий апарат
ОС оксидативний стрес
ПБ пробіотик
ПГ протеоглікан
ПГЕ2 простагландин E2
ПЛР полімеразна ланцюгова реакція
ПОЛ пероксидне окиснення ліпідів
РА ревматоїдний артрит
РФ ревматоїдний фактор
СОД супероксиддисмутаза
ТБК тіобарбітурова кислота
ТНФА тіонітрофенільний аніон
ТФР-β трансформуючий фактор росту β
ФНП-α фактор некрозу пухлин α
ХС хондроїтина сульфат
ЦОГ циклооксигеназа
ШКТ шлунково-кишковий тракт
ШО шиффові основи
ШОЕ швидкість осідання еритроцитів
ACAN аггрекан
A-CCP антитіла до циклічного цитрулінового пептиду
CHI3L1 хітиназа-3-подібний білок 1
Col II колаген ІІ типу
COMP олігомерний матриксний білок хряща
CP-II С-пропептид колагену ІІ типу
25
CTSK катепсин К
СТХ-ІІ С-телопептид колагену ІІ типу
DAMP молекулярний патерн, асоційований з пошкодженням
GSH глутатіон відновлений
GSSG глутатіон окиснений
HCl гідрохлоридна кислота
H2O2 гідроген пероксид
iNOS індуцибельна синтаза оксиду азоту
МАРК мітоген-активована протеїнкіназа
NF-κB ядерний фактор NF-κB
NO оксид азоту
NOS синтаза оксиду азоту
О2
-
супероксид аніон-радикал
PAMP патоген-асоційований молекулярний патерн
SNP однонуклеотидний поліморфізм
SYSADOA препарати сповільненої дії, що застосовують при ОА
TLR Toll-подібний рецептор
XTT 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium5-carboxanilide
26
ВСТУП
Актуальність теми. Захворювання опорно-рухового апарату (ОРА) є
актуальною медико-соціальною проблемою в усьому світі, а їх лікування та
профілактика має першочергове значення для збереження фізичної
активності та працездатності населення. Серед патологій ОРА провідне місце
займають остеоартрити (ОА) – гетерогенна група захворювань різної
етіології з подібними біологічними та клінічними проявами й наслідками. В
умовах ОА відбуваються патологічні зміни в усіх компонетах суглоба:
переважно у хрящі, субхондральній кістці, синовіальній оболонці, зв’язках,
капсулі та навколосуглобових м’язах. Розвиток ОА безпосередньо
пов’язаний з неконтрольованими запальними процесами та порушеннями
метаболізму, наслідком яких є біль та інвалідність [1].
На ОА хворіє 10-20% населення планети, і з його старінням та
збільшенням кількості ожиріння поширеність даної патології стрімко зростає
та набуває все більшої актуальності. За оцінками, 22% дорослого населення
має принаймні один суглоб, уражений ОА, і ця поширеність зростає до 49% у
осіб старше 65 років [2]. ОА є найпоширенішою причиною хронічного болю
в Європі (34%), що обумовлює значні економічні та соціальні витрати для
суспільства [3]. Незважаючи на певні успіхи у лікуванні патологій ОРА,
клінічні та фінансові наслідки, в даний час не існує затверджених
ефективних препаратів, які усувають/запобігають розвитку ОА та знижують
показники інвалідності внаслідок ОА [4]. Медикаментозне лікування
перважно складається із симптоматичних лікарських засобів швидкої
дії (анальгетики, нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП),
внутрішньосуглобові глюкокортикостероїди) та симптоматичних лікарських
засобів повільної дії, які застосовують з метою зменшення болю, поліпшення
функції суглобів і уповільнення прогресування ОА. Незважаючи на те, що
одними з найпоширеніших серед даної групи засобів є препарати, що містять
хондроїтину сульфат (ХС), який є природнім компонентом міжклітинної
27
речовини хряща та підтримує його пружність і щільність, механізми дії та
ефективність його застосування залишаються остаточно нез’ясованими та
суперечливими [5]. Саме зі зниженням вмісту ХС, який виконує не тільки
структурну функцію в суглобі, а й виявляє антиоксидантні та протизапальні
властивості [6], пов’язані дистрофічні зміни хрящової тканини. Тому
дослідження препаратів, основу яких складає ХС, є актуальними та
перспективними для профілактики й лікування захворювань суглобів.
Всі метазої, від безхребетних до хребетних, мають мікробіоту
кишечника. Мікробіота кишечника тісно пов’язана з різними аспектами
фізіології метазоїв, такими як розвиток, метаболізм та імунітет. Вплив
мікробіоти кишечника на фізіологічні функції господаря та патогенез
захворювань може бути результатом діяльності мікробіома та продуктів його
метаболізму [7]. Незважаючи на те, що в останні роки значно розширилися
уявлення щодо участі дисбіозу кишкової мікробіоти в ревматоїдному
артриті [8], роль кишкової мікробіоти або продуктів її метаболізму в
патогенезі ОА залишається не відомою. Лише серед поодиноких досліджень
останніх років з’являються дані про потенційний взаємозв’язок між
розвитком ОА та станом мікробіоти кишечника [2, 9]. Оскільки дисбіоз
травної системи тісно пов’язаний з патогенезом багатьох різних
метаболічних та запальних захворювань, відповідно, він може бути задіяний
у розвиток ОА. Тому актуальним питанням є дослідження участі в розвитку
ОА мікробіоти травного тракту та пробіотиків (ПБ) – продуцентів
фізіологічно активних метаболітів (вітамінів, коротколанцюгових жирних
кислот, антиоксидантів та імуномодуляторів), здатних зменшувати розвиток
запальних процесів в організмі, виявляти антиоксидантні властивості,
підтримувати та відновлювати нормобіоз шлунково-кишкового тракту [10,
11].
Виходячи з вище викладеного, стає цілком очевидним, що з’ясування
біохімічних механізмів ремоделювання хрящової тканини за розвитку ОА на
сьогодні є актуальним завданням сучасних напрямів біохімії та медицини.
28
Вирішення питання щодо зв’язку між станом мікробіоти травного тракту та
функціонуванням ОРА надасть серйозну мотивацію для пошуку нових
ефективних стратегій лікування та профілактики захворювань суглобів
різного ґенезу, а також дозволить більш глибоко зрозуміти принципи
системного функціонування та метаболічних порушень при супутніх
патологічних станах.
Нами запропоновано концепцію, яка полягає в тому, що ремоделювання
хрящової тканини за розвитку експериментального ОА пов’язане не лише зі
зміщенням рівноваги між катаболічними й анаболічними процесами із
залученням місцевих і системних запальних процесів та оксидантноантиоксидантних порушень, а й з розвитком дисбіотичних змін мікробіоти
товстої кишки за безпосередньої участі TLR-2/4-опосередкованого
сигнального NF-κВ запального каскаду.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана на кафедрі біохімії Навчально-наукового
центру «Інститут біології та медицини» Київського національного
університету імені Тараса Шевченка в рамках бюджетних науково-дослідних
тем №16БФ036-01 «Механізми регуляції метаболічних процесів в організмі
за умов розвитку патологічних станів» (№ д/р 0116U002527 2016-2018 рр.) та
№18БП036-02 «Розробка методичних рекомендацій використання
хондропротекторів та мультипробіотиків для корекції патології
суглобів» (№ д/р 0118U000243 2018-2020 рр.).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження
біохімічних механізмів ремоделювання хрящової тканини за
експериментального остеоартриту. Для досягнення мети поставлено наступні
завдання:
1. Встановити видовий та кількісний склад мікробіоти товстої кишки
щурів з експериментальним остеоартритом за введення хондроїтину
сульфату та пробіотика.
29
2. Провести гістологічний аналіз колінних суглобів щурів з
експериментальним остеоартритом за введення хондроїтину сульфату та
пробіотика.
3. Визначити рівень біохімічних маркерів метаболізму хрящової тканини
при експериментальному остеоартриті за введення хондроїтину сульфату та
пробіотика.
4. Оцінити ступінь системного та локального запалення в щурів із
експериментальним остеоартритом за введення хондроїтину сульфату та
пробіотика.
5. Визначити інтенсивність вільнорадикальних процесів у сироватці
крові та хрящовій тканині при експериментальному остеоартриті за введення
хондроїтину сульфату та пробіотика.
6. Оцінити стан антиоксидантної системи в сироватці крові та хрящовій
тканині при експериментальному остеоартриті за введення хондроїтину
сульфату та пробіотика.
7. З’ясувати регуляторні механізми ремоделюючої дії хондроїтину
сульфату та пробіотика в хрящовій тканині суглоба при експериментальному
остеоартриті.
Об’єкт дослідження: біохімічні механізми деструкції та відновлення
структурно-функціональних характеристик хрящової тканини при
монойодацетат-індукованому остеоартриті.
Предмет дослідження: видовий та кількісний склад мікробіоти товстої
кишки, параметри морфо-гістологічного стану суглобів, маркери запалення,
показники окисно-антиоксидантної рівноваги, біохімічні маркери
метаболізму хрящової тканини, рівень експресії генів, залучених у
ремоделювання хряща, за експериментального остеоартриту при введенні
хондроїтину сульфату і пробіотика.
Методи дослідження: мікробіологічні (визначення видового та
кількісного складу мікробіоти товстої кишки); морфологічні,
гістологічні (дослідження дегенеративно-дистрофічних змін і регенеративних
30
процесів хрящової тканини колінного суглоба); біохімічні:
спектрофотометричні (визначення вмісту супероксидного аніон-радикалу,
пероксиду водню, дієнових кон’югатів (ДК), ТБК-активних продуктів,
продуктів окисної модифікації білків (ОМБ), ферментативної активності
антиоксидантної системи (АОС), ферментативної активності глутатіонової
системи, концентрації білка) та флуориметричні (визначення вмісту шифових
основ (ШО), окисненого та відновленого глутатіону); молекулярнобіологічні: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) (оцінка рівня експресії
генів Nos2, Ptgs2, Tgfb1, Comp, Col2a1, Acan, Tlr2, Tlr4, Nfkb);
імуноферментний аналіз (визначення вмісту цитокінів, факторів росту,
матриксних металопротеїназ (ММП), розчинних форм Toll-подібних
рецепторів, концентрації простагландину Е2 та маркерів метаболізму
хрящової тканини (COMP, ACAN, CTSK, CHI3L1)); імуногістохімічні
(оцінка експресії біомаркерів прозапальної та катаболічної активації
хондроцитів); методи статистичної обробки даних.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі
отриманих доказових результатів досліджень запропонована концепція
біохімічних механізмів залучення кишкової мікробіоти в ремоделювання
хрящової тканини суглобу за умов експериментального ОА. Вперше
показано розвиток дисбіозу в товстій кишці щурів із експериментальним ОА.
Виявлено, що комбіноване введення ХС та ПБ за експериментального ОА не
лише найбільш виражено усувало дисбіотичні зміни в товстій кишці, а й
супроводжувалося найменш вираженими дегенеративно-дистрофічними
змінами хрящової тканини в колінному суглобі. Вперше комплексно
досліджено біохімічні показники місцевого та системного запалення з
процесами вільнорадикального окиснення, функціонуванням системи
антиоксидантного захисту, зроблено аналіз експресії генів та маркерів
метаболізму хрящової тканини колінного суглоба щурів за умов
монойодацетат-індукованого ОА при дії ХС та ПБ композиції. Вперше
встановлено, що в біохімічних механізмах ремоделювання хрящової тканини
31
за умов експериментального ОА важлива роль належить кишковій
мікробіоті, яка залучається в регуляцію TLR-2/4-опосередкованим запальним
шляхом NF-κB, який активує катаболічні процеси, зі збільшенням
прозапальних медіаторів і ММП, а також призводить до оксидативного
стресу (ОС) і деструкції хряща. Розширено наукові дані про особливості
біологічної дії ХС та ПБ (імуномодулюючі, антизапальні та антиоксидантні
властивості) на організм щурів за умов експериментального ОА. Розроблено
концептуальну схему щодо ролі мікробіоти товстої кишки та TLR-2/4-
опосередкованого NF-κB-залежного запального шляху в ремоделюванні
хрящової тканини за монойодацетат-індукованого ОА, а також
запропоновано методичні рекомендації на основі доведеної
експериментальної ефективності комбінованої дії ХС та ПБ для корекції
патології суглобів.
Практичне значення одержаних результатів. Результати наукового
дослідження мають фундаментальне значення та розширюють уявлення
щодо розуміння молекулярно-біохімічних механізмів ремоделювання
хрящової тканини за експериментального ОА.
Отримані дані експериментально обґрунтовують перспективність
комбінованого застосування ХС та ПБ в комплексному лікуванні та
профілактиці захворювань суглобів, що сприятиме зниженню ступеню
інвалідизації населення та соціально-економічного навантаження на систему
охорони здоров’я. На основі науково-обгрунтованих результатів роботи
розроблено методичні рекомендації, які можуть бути використані у
практичній медицині та в навчальному процесі під час підготовки студентів
біологічних і медичних спеціальностей.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота – завершене
дослідження, самостійно виконане автором відповідно до програми
експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених
протягом 2015-2021 рр. Дисертантом обґрунтовано мету та завдання роботи,
розроблено методологію експерименгтальних досліджень, здійснено пошук
32
та аналіз даних літератури, проведена наукова оцінка одержаних
експериментальних даних та їх статистична обробка, сформульовано основні
теоретичні положення і висновки. Автор зробив основний особистий внесок
у дисертаційну роботу на всіх етапах її практичного виконання, обговорення
результатів дослідження, формулювання висновків та написання статей.
Планування напряму експериментальних досліджень, аналіз та обговорення
отриманих результатів проведено спільно з науковим консультантом,
доктором біологічних наук, професором Остапченко Л.І. Здобувач висловлює
глибоку вдячність колегам за допомогу в проведенні досліджень, співучасть
яких відмічена в спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Результати наукових досліджень,
основні положення, висновки та практичні рекомендації, які включені до
дисертації, було представлено на міжнародних і вітчизняних наукових
конференціях і з’їздах: 51th Annual Scientific Meeting of the European Society
for Clinical Investigation (Genoa, Italy, 2017), Міжнародній науковопрактичній конференції «Актуальні питання медицини і
біології» (Полтава, 2017), XIII міжнародній науковій конференції студентів
та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2017), VIII Міжнародній
науковій конференції «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і
патології» (Київ, 2017), IV Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі
студентів і молодих вчених «Інновації та перспективи сучасної
медицини», (Чернівці, 2017), Third Kyiv International Symposium Smooth
Muscles Physiology, Biophysics & Pharmacology: from genes and molecules to
functions, disorders and their novel treatment opportunities (Kyiv - Lutsk, 2017),
43rd Federation of European Biochemical Societies Congress, (Prague,
Czech Republic, 2018), XII Annual Conference of Young Scientists Institute of
Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine (Kyiv, 2018),
5th European Congress of Immunology, ECI (Amsterdam, 2018),
FEBS3+ Meeting XI International Parnas Conference – Young Scientists Forum
“Biochemistry and Molecular Biology for Innovative Medicine” (Kyiv, 2018),
33
XVIII Міжнародній науковій конференції студентів та молодих вчених
«Шевченківська весна: досягнення біологічної науки / Bioscience
Advances» (Київ, 2019), VII Всеукраїнській науковій конференції студентів,
аспірантів та молодих вчених «Об’єднані наукою: перспективи
міждисциплінарних досліджень» (Київ, 2020), XIV Всеукраїнській науковопрактичній конференції «Біотехнологія ХХІ століття» (Київ, 2020).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 37 наукових праць, серед
них 14 статей у виданнях, що включені до міжнародних наукометричних баз
даних Web of Science та Scopus, 9 статей у фахових періодичних виданнях,
затверджених переліком МОН України, 13 матеріалів і тез доповідей на
міжнародних та всеукраїнських наукових конференціях, методичні
рекомендації.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, опису результатів
власних досліджень з їх обговоренням, розділу з узагальнення отриманих
результатів, висновків, списку використаних літературних
джерел (565 посилань) та додатку. Дисертаційна робота викладена на
303 сторінках, ілюстрована 57 рисунками та містить 13 таблиць.
Висновок біоетичної експертизи. Згідно висновку комісії з питань
біоетики Навчально-наукового центру "Інститут біології та медицини"
Київського національного університету імені Тараса Шевченка
(протокол № 1 від 14 січня 2020 р.) експериментальні дослідження
відповідають загальноприйнятим біоетичним нормам, виконані з
дотриманням відповідних міжнародних положень стосовно проведення
експериментальних робіт, і можуть бути використані в матеріалах дисертації.
Всі маніпуляції з тваринами проведено відповідно до положень Європейської
конвенції щодо захисту хребетних тварин, яких використовують у
експериментальних та інших наукових цілях (Страсбург, 1986), Закону
України «Про захист тварин від жорстокого поводження» №3447-IV від
21.02.2006, Загальних етичних принципів експериментів на тваринах,
34
ухвалених Першим національним конгресом України з біоетики (2001) та у
відповідності з етичними нормами і правилами роботи з лабораторними
тваринами (Керівництво по догляду та використанню лабораторних тварин,
National Academy Press, Washington DC, 1996).

Список литературы

ВИСНОВКИ
Результати, представлені у дисертаційній роботі, розширюють уявлення
щодо ролі кишкової мікробіоти в біохімічних механізмах ремоделювання
хрящової тканини за умов експериментального остеоартриту, зокрема через
залучення в регуляцію TLR-2/4-опосередкованим запальним шляхом NF-κB,
який активує катаболічні процеси, зі збільшенням концентрації прозапальних
медіаторів і металопротеїназ, а також призводить до оксидативного стресу і
деструкції хряща. Виявлено, що хондроїтину сульфат і пробіотик проявляють
протизапальну, антиоксидантну та регенеруючу дію шляхом як нормалізації
кишкової мікробіоти, так і активації анаболічних процесів у хрящовій
тканині за умов монойодацетат-індукованого остеоартриту в щурів.
1. Виявлено, що при експериментальному остеоартриті виникає
дисбіотичний стан в товстій кишці, про що свідчить зниження кількості
Lactobacillus в 1,3 раза та підвищення кількості Clostridium spp.,
умовно-патогенних ентеробатерій, лактозонегативної Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp. та дріджоподібних грибів роду
Candida в 1,9; 8; 1,9; 1,5; 1,4 та 1,7 раза відповідно, порівняно з контролем.
Введення хондроїтину сульфату та пробіотичної композиції сприяло
відновленню мікробіоти кишечника за умов розвитку експериментального
остеоартриту.
2. У ході гістологічних досліджень колінних суглобів щурів з
експериментальним остеоартритом встановлено ознаки запалення із
помірною лейкоцитарною інфільтрацією, гіперпластичні та деструктивнодистрофічні зміни у хрящовій та субхондральній кістковій тканинах.
Введення хондроїтину сульфату та пробіотика сприяло відновленню стану та
запобігало дегенеративним змінам суглобових тканин щурів із
експериментальним остеоартритом.
244
3. Показано зростання концентрації ключових біохімічних маркерів
метаболізму хрящової тканини: олігомерного матриксного білка
хряща (СОМР), агрекану (ACAN), катепсину К (CTSK), хрящового
глікопротеїну-39 (CHI3L1) у сироватці крові та збільшення вмісту
матриксних металопротеїназ (ММП-1,2,3,8) у сироватці крові та хрящовій
тканині, а також зменшення рівня експресії генів основних компонентів
хрящового матриксу (Col2a1, Acan, Comp) за експериментального
остеоартриту. Введення хондроїтину сульфату та пробіотика тваринам з
експериментальним остеоартритом значимо сприяло відновленню
досліджуваних показників метаболізму хрящової тканини щурів,
наближаючи їх до значень у тварин контрольної групи.
4. Встановлено, що за умов експериментального остеоартриту в
сироватці крові та хрящовій тканині колінного суглоба щурів зростав вміст
прозапальних (катаболічних) цитокінів ІЛ-1β, ФНП-α, IЛ-6, ІЛ-8, IФН-γ та
ТФР-β, збільшувались концентрація простагландину Е2 та рівні експресії
генів, залучених до розвитку запалення (Ptgs2, Nos2, Tgfb1), при одночасному
зниженні вмісту анаболічних цитокінів ІЛ-4, ІЛ-10 та ІФР-1. Комбіноване
введення хондроїтину сульфату та пробіотика найбільш виражено сприяло
зниженню запальних (катаболічних) та відновленню вмісту
протизапальних (анаболічних) медіаторів у сироватці крові та хрящовій
тканині щурів за умов розвитку експериментального остеоартриту.
5. Показано інтенсифікацію вільнорадикальних процесів (зростання
вмісту супероксидного радикалу, перекису водню, продуктів перекисного
окиснення ліпідів та окисної модифікації білків) у хрящовій тканині та
сироватці крові щурів за умов експериментального остеоартриту, порівняно з
показниками контрольної групи тварин. Введення як хондроїтину сульфату,
так і пробіотика тваринам з експериментальним остеоартритом призводило
до часткового відновлення досліджуваних показників вільнорадикального
окиснення.
245
6. Виявлено порушення антиоксидантної системи в хрящовій тканині
та в сироватці крові щурів при експериментальному остеоартриті: в хрящовій
тканині зростали супероксиддисмутазна та каталазна активності на фоні
збільшення вмісту окисненої та зниження – відновленої форм глутатіону, а
також виснаження глутатіон-залежної ферментативної ланки
антиоксидантного захисту; в сироватці крові знижувалася
супероксиддисмутазна активність та зростала каталазна активність на фоні
зростання вмісту окисненої та зниження – відновленої форм глутатіону, а
також пригнічення глутатіон-залежної ферментативної активності.
Комбіноване введення хондроїтину сульфату та пробіотика тваринам з
експериментальним остеоартритом більш виражено, порівняно з окремим
введенням, відновлювало порушенений антиоксидантний гомеостаз як у
суглобі, так і в крові.
7. Ремоделювання хрящової тканини за умов експериментального
остеоартриту регулюється TLR-2/4-опосередкованим запальним шляхом
NF-κB. Показано позитивну імуногістохімічну експресію Toll-подібних
рецепторів -2, -4, транскрипційного фактору NF-kB в хондроцитах у межах
всіх зон хрящової тканини та збільшення рівнів експресії генів Tlr2, Tlr4,
Nfkb1 в хрящах колінного суглоба щурів, а також виявлено зростання вмісту
розчинних форм TLR-2 і TLR-4 в сироватці крові за експериментального
остеоартриту. При введенні хондроїтину сульфату та пробіотика за
експериментального остеоартриту спостерігались значне зниження експресії
TLR-2, TLR-4, NF-kB в хрящовій тканині та відсутність розчинних форм
TLR-2 і TLR-4 у сироватці крові.