Шишкина Екатерина Олеговна. Серологическая диагностика лихорадки Западного Нила

Краткое описание

Шишкина Екатерина Олеговна. Серологическая диагностика лихорадки Западного Нила : диссертация ... кандидата медицинских наук : 03.00.06 / Шишкина Екатерина Олеговна; [Место защиты: Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт РАМН"].- Москва, 2003.- 156 с.: ил.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ВИРУСОЛОГИИ ИМ. Д.И. ИВАНОВСКОГО
04.20 аз 11012-
На правах рукописи
ШИШКИНА ЕКАТЕРИНА ОЛЕГОВНА
СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА
03.00.06. - вирусология
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А.М. Бутенко кандидат медицинских наук В.Ф. Ларичев
Москва - 2003

І4' :
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений 5
Введение 6
Часть I. Литературный обзор. Лихорадки Западного Нила (ЛЗН)
1. История изучения вируса Западного Нила (ЗН) 13
2. Классификация и характеристика вируса ЗН 14
3. Эпидемиология ЛЗН
3.1. Распространение вируса ЗН 20
3.2. Заболеваемость и летальность при ЛЗН 20
3.3. Сезонность ЛЗН 22
3.4. Иммуноструктура населения к вирусу ЗН 23
3.5. Переносчики вируса ЗН 25
3.6. Резервуары вируса ЗН 28
4. Клиническая картина ЛЗН 30
5. Патологическая анатомия при ЛЗН 35
6. Лечение
6.1. Принципы лечения больных ЛЗН 36
6.2. Экспериментальная оценка активности противовирусных препаратов 37
7. Специфическая диагностика ЛЗН
7.1. Вирусологическая диагностика
7.1.1. Методы выделения вируса ЗН 38
7.1.2. Методы индикации вируса в полевых и клинических материалах 41
7.2. Серологическая диагностика ЛЗН
7.2.1. Методы обнаружения специфических антител у больных ЛЗН
и эффективность их применения 41
7.2.2. Динамика различных видов антител у больных ЛЗН 43
8. Профилактика ЛЗН 44
Заключение 45
Часть II. Собственные исследования Глава 1. Материалы и методы
1Л. Сыворотки крови больных и здоровых людей 48
1.2. Использованные вирусы и штаммы 48
1.3. Иммунные асцитные жидкости (ИАЖ) белых мышей 49
1.4. Выделение иммуноглобулинов 50
1.5. Получение перокскдных коньюгатов 50
1.6. Клеточные культуры 50
1.7. Методы исследования
1.7.1. Реакция нейтрализации в культуре клеток Vero Е6 51
1.7.2. Иммуноферментный анализ
1.7.2.1. ИФА для определения антигена 51
1.7.2.2. Непрямой метод "сэндвич"-ИФА для определения специфических IgG
(ИФА-IgG) 53
1.7.2.3. Метод "захвата" иммуноглобулинов класса М (MAC-ELISA) 54
1.7.3. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) 54
1.7.4. Реакция диффузионной преципитации в агаре (РДПА) 55
1.7.5. Реакция встречного иммунофореза (ВИЭФ) 55
1.7.6. Статистические методы 56
Глава 2. Серологическая диагностика ЛЗН
2.1. Доказательства роли вируса ЗН в этиологии эпидемической вспышки ЛЗН
на юге России в 1999 г 58
2.2. Результаты обследования в ИФА сывороток крови и проб СМЖ больных
ЛЗН на антиген вируса ЗН 64
з
2.3, Результаты обследования сывороток и СМЖ больных на антитела к вирусу ЗН в
ИФА-IgM, ИФА-IgG, РТГА, РДПА и ВИЭФ.
2.3.1. Данные ИФА-IgM (MAC-ELISA) 65
2.3.2. Данные ИФА-IgG 66
2.3.3. Данные РТГА 66
2.3.4. Данные РДПА и ВИЭФ 68
2.3.5. Данные параллельного обследования сывороток крови больных ЛЗН в пяти
серологических реакциях (МАС-ЕП8А,ИФА- IgG, РТГА, РДПА и ВИЭФ) 68
2.3.6. Сравнение эффективности использования MAC-ELISA, ИФА-IgG и РТГА для
серодиагностики ЛЗН 71
Глава 3. Динамика специфических IgM, IgG и антигемагглютининов у больных ЛЗН
3.1. Динамика специфических IgM, IgG и антигемагглютининов, выявляемых в
сывороткьх крови и СМЖ больных ЛЗН в течении месяца от начала заболевания. Суммарные данные 74
3.2. Зависимость динамики специфических IgM, IgG и антигемагглютининов от
клинической формы болезни, возраста и пола 77
3.2.1. Динамика специфических IgM у больных с лихорадочной и
нейроинфекционнойформами ЛЗН 78
3.2.2. Динамика специфических IgG у больных с лихорадочной и
нейроинфекционной формами ЛЗН 79
3.2.3. Динамика специфических антигемагглютининов у больных с лихорадочной и
нейроинфекционными формами ЛЗН 81
3.2.4. Динамика специфических IgM у больных ЛЗН в разных возрастных
группах 83
3.2.5. Динамика специфических IgG у больных ЛЗН в разных возрастных
группах
3.2.6. Динамика специфических антигемагглютининов у больных ЛЗН в разных возрастных группах 86
3.2.7. Динамика специфических IgM у больных ЛЗН мужского и женского пола... .87
3.2.8. Динамика специфических IgG у больных ЛЗН мужского и женского пола... .89
3.2.9. Динамика специфических антигемагглютининов у больных ЛЗН мужского
и женского пола 89
3.3. Типы иммунного ответа при ЛЗН 91
3.4. Типы иммунных ответов у больных ЛЗН с нейроинфекционной и лихорадочной
формами заболевания 96
Глава 4. Эпидемиологическая и клиническая характеристика ЛЗН
4.1. Эпидемиология ЛЗН 98
4.1.1. Показатели заболеваемости, сезонность ЛЗН, половой, возрастной и
социально-профессиональнный состав заболевших, летальность и
эпиданамнез ЛЗН 98
4.1.2. Изучение иммуноструктуры населения Астраханской области
к вирусу Западного Нила 102
4.1.3. Сравнение эффективности использования PH, ИФА-IgG и РТГА
при изучении иммуноструктуры населения к вирусу ЗН 110
4.2. Клиническая картина ЛЗН 111
Обсуждение 116
Выводы 131
Список литературы 133
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВИЭФ - встречный иммунофорез в полиакриалидном геле
ИАЖ - иммунная асцитная жидкость
ИФА (ELISA) - иммуноферментный анализ
ЖЛ - желтая лихорадка
ЗН - Западный Нил
КГ Л - крымская геморрагическая лихорадка
КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер
ЛЗН - лихорадка Западного Нила
нбм - новорожденные белые мыши
ОП - оптическая плотность
ОФД - ортофенилендиамин
РДПА - реакция диффузной преципитации в агаре
PH - реакция нейтрализации
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
СМЖ - спинномозговая жидкость
САА - сахарозо-ацетоновые антигены
СГТ - средние геометрические титров
ФСБ-т - фосфатно-солевой буфер с твин-20
ЦПД - цитопатогенное действие
ЦПЭ - цитопатогенный эффект
ЭСЛ - энцефалит Сент-Луис IgG - иммуноглобулины класса G
ЯЭ - японский энцефалит МАС-ELIS А (ИФА-IgM) - метод захвата IgM в ИФА
IgM - иммуноглобулины класса М
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
В августе-сентябре 1999 г. на юге Европейской части России, а также в Нью-Йорке и его окрестностях практически одновременно возникли эпидемические вспышки лихорадочных заболеваний с преобладанием нейроинфекционных форм и высокой смертностью (7-12,5%), этиологически связанные с вирусом Западного Нила (ЗН). Вирус ЗН относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus и антигенному комплексу вируса японского энцефалита, к которому принадлежат также вирусы энцефалитов Сент-Луис (Америка), долины Муррей (Австралия) и некоторые другие. Передается с укусами комаров.
Вирус ЗН является одним из наиболее широко распространенных арбовирусов. Его ареал охватывает огромные территории Южной, Центральной и Восточной Европы, юг Западной Сибири, Среднюю Азию, Казахстан, Южную и Юго-Восточную Азию, Океанию и Австралию. Доказательства активности вируса ЗН в Северной Америке (Нью-Йорк и его окрестности), летом 1999 г. были получены впервые.
Сотни случаев лихорадки Западного Нила (ЛЗН) были диагностированы в начале 50-х годов в Израиле. Во время эпидемии в ЮАР (1974 г.) было зарегистрировано примерно 3000 больных. В 1994 году в Алжире заболело около 50 человек. Отдельные случаи или вспышки лихорадки ЗН наблюдались в Азербайджане, Таджикистане, Центрально-Африканской республике, Заире, Египте, Эфиопии, Индии, на Мадагаскаре, в Нигерии, Пакистане и Судане. В Европе первые штаммы вируса ЗН были выделены в 1963 г. из клещей Hyalomma plumbeum plumbeum, собранных в дельте Волги, от больных людей и комаров, отловленных в дельте Роны, во Франции. В 60-е годы немногочисленные случаи заболевания наблюдались во Франции и Астраханской области, в Испании, Румынии; в 70-е, 80-е и 90-е годы - в Белоруссии, на Западной Украине и Чехии. В июле-октябре 1996 г. имела место крупная эпидемическая вспышка лихорадки Западного Нила.
В 1999 году в Астраханской, Волгоградской областях и Краснодарском крае было выявлено не менее 600 больных ЛЗН, в США - 62 человек.
Несмотря на выраженную неврологическую симптоматику у многих больных при диагностике ЛЗН, как и при других арбовирусных инфекциях, решающее значение имеют результаты серологической диагностики. Поэтому выяснение возможностей использования различных серологических методов для диагностического обследования больных, а также для изучения иммуноструктуры населения, представляется весьма актуальным.
Мало исследованными и исключительно важными для разработки критериев серологической диагностики ЛЗН являются вопросы динамики различных видов специфических антител в зависимости от возраста больных и формы заболевания, возможность определения ранних IgM антител, как основы экспресс-диагностики.
Цель и задачи работы.
Целью настоящей работы являлось получение доказательств значения вируса ЗН в этиологии эпидемической вспышки на юге России, изучение возможностей использования различных серологических методов (ИФА, РТГА, ВИЭФ и PH в культуре клеток) для специфической диагностики ЛЗН и изучения иммуноструктуры населения в эндемичных регионах. В соответствии со сформулированной целью были определены следующие задачи исследования:
1. Серологическое обследование больных с сезонными лихорадочными заболеваниями, подозрительными на ЛЗН, из эндемичных регионов юга России.
2. Сравнение специфичности выявляемых антител к вирусу ЗН и к родственным флавивирусам (японского энцефалита, желтой лихорадки, энцефалита Сент-Луис).
3. Изучение динамики различных типов антител у больных ЛЗН в зависимости от тяжести течения заболевания, возраста и пола больных.
4. Разработка критериев специфической диагностики ЛЗН (диагностические титры, оптимальное время и интервалы обследования больных с применением различных серологических методов).
5. Изучение иммуноструктуры населения к вирусу ЗН.
6. Анализ полученных серологических, эпидемиологических и клинических данных.
Научная новизна исследований.
Впервые получены данные, указывающие на значение вируса ЗН в этиологии крупной эпидемической вспышки на юге России. Вспышка характеризовалась преобладанием случаев менингитов и менингоэнцефалитов, а также высокой заболеваемостью городских жителей, что ранее не наблюдалось в эндемичных регионах СССР и России.
На основании обследования сывороток крови больных ЛЗН изучена динамика различных видов антител, выявляемых в серологических реакциях. Определены критерии специфической диагностики ЛЗН (диагностические титры антител, оптимальные сроки обследования). Рекомендована научно-обоснованная схема серологической диагностики.
Показана эффективность экспресс-серодиагностики по выявлению иммуноглобулинов класса М методом МАС-ELISA в сыворотках крови и СМЖ больных.
Установлено соотношение различных клинических форм при ЛЗН. Изучены некоторые эпидемиологические особенности вспышки и иммуноструктура населения к вирусу ЗН.
Практическая ценность исследований.
На основании результатов диссертации рекомендована схема серологической диагностики ЛЗН. Использование метода MAC-ELISA (для выявления IgM) позволяет проводить экспресс-диагностику заболевания в острый период болезни, что в свою очередь дает возможность выбора правильной тактики лечения больных.
Изучение динамики гуморального иммунитета у здорового населения в эндемичных регионах является важным компонентом эпиднадзора за очагами ЛЗН и обеспечивает ценную информационную базу для прогнозирования заболеваемости и обоснования профилактических мероприятий.
Разработанные при участии автора три типа иммуноферментных тест-систем для выявления IgM и IgG к вирусу ЗН в крови людей, а также антигена вируса ЗН в клинических полевых и экспериментальных материалах, прошли успешные государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Они нашли широкое применение в практической работе ЦГСЭН и противочумной службы Российской Федерации (Астрахань, Волгоград, Краснодар, Новороссийск и др.).
При участии автора диссертации опубликованы методические указания «Эпидемиологический надзор за лихорадкой Западного Нила в Астраханской области, специфическая диагностика заболевания, меры общественной и личной профилактики» (2000 г.), используемые органами здравоохранения в эндемичных по ЛЗН регионах России.
Основные положения, выносимые на защиту.
В августе-сентябре 1999 г. на юге России (в Астраханской, Волгоградской областях и Краснодарском крае) была зарегистрирована крупная эпидемическая вспышка ЛЗН (560 случаев). В результате выполнения настоящей работы впервые установлена роль вируса ЗН в этиологии 465 случаев ЛЗН в Волгоградской области и Краснодарском крае.
На основании обследования сывороток крови больных в серологических реакциях с антигенами вирусов ЗН и антигеннородственных вирусов японского энцефалита, желтой лихорадки и энцефалита Сент-Луис и ряда гетерологичных арбовирусов (КГЛ и лихорадки Синдбис), установлена выраженная специфичность выявленных антител к вирусу ЗН.
Серологическая экспресс-диагностика ЛЗН может основываться на результатах однократного обнаружения методом МАС-ELISA специфических IgM в пробах СМЖ (в титре £1:10) и в сыворотках крови (>1:800), взятых в острый период болезни.
При обследовании парных сывороток, помимо МАС-ELISA можно использовать также ИФА-IgG и РТГА. Для обнаружения диагностических показателей сероконверсии
специфических IgG и антигемагглютининов в парных сыворотках крови интервал между взятием первой и второй проб должен составлять, как правило, не менее 10-14 дней.
В сыворотках крови больных ЛЗН диагностические титры IgM к вирусу ЗН обнаруживаются уже на 3-5 дни заболевания, достигая максимальных уровней (иногда 1:102400-1:204800) на 11-15 дни. Наибольшие показатели средних титров IgG и антигемагглютининов (соответственно 1:6400 и 1:320) приходятся на 16-18 дни болезни. В некоторых случаях титры IgG в этот период составляют 1:102400, а титры антигемагглютининов - 1:2560.
ЛЗН на юге России в 1999 г. характеризовалась высокой заболеваемостью городских жителей, что ранее не наблюдалось в эндемичных регионах СССР и России. Более 60 % больных были в возрасте старше 50 лет. Мужчины болели чаще (75,6%), чем женщины. Относительные показатели заболеваемости на 100000 населения составляли: 12,2 в г. Астрахани, 9,3 - в сельских районах Астраханской области, 32,7 в г. Волжском Волгоградской области, 25,9 - в г. Волгограде и 10,1 в эндемичных сельских районах Волгоградской области.
ЛЗН протекала в двух клинических формах: лихорадочной (20,8%) и нейроинфекционной с тремя вариантами течения (менингеальным, по типу серозного менингита (68,8%), менингоэнцефалитическим (10,2%) и энцефалитическим (0,2%). Летальность составила 7,7%. Наблюдался полиморфизм клинических проявлений и отсутствие выраженных патогномоничных симптомов, поэтому ведущее значение в диагностике заболеваний имела специфическая серологическая диагностика.
У больных с нейроинфекционной формой ЛЗН и у лиц старше 50 лет в острый период болезни уровень специфических антител был достоверно выше, чем у больных с лихорадочной формой. Отмечены и некоторые другие особенности динамики и титров специфических антител, выявляемых у больных ЛЗН методами ИФА-IgM, ИФА- IgG и
РТГА.
У населения Астраханской области после эпидемической вспышки ЛЗН 1999 г. произошло, по сравнению с 1998 г., увеличение иммунной прослойки с 31,6% до 50,0%. В октябре 1999 г. IgM к вирусу ЗН были обнаружены у 3,1% практически здоровых жителей г. Астрахани, что свидетельствовало о недавно перенесенной инаппарантной форме ЛЗН. В целом, за 1998-1999 г.г. в Астраханской области 51,9% жителей сельской местности и 35,0% горожан имели антитела к вирусу ЗН. В декабре 2001 г. в трех обследованных районах Астраханской области процент доноров, серопозитивных к вирусу ЗН, составлял 19,4.
РТГА обладает значительно меньшей чувствительностью, чем PH и ИФА-IgG для обнаружения анамнестических антител к вирусу ЗН, поэтому информативность данных, полученных с помощью этой реакции при проведении сероэпидемиологических исследований, менее значительна.
Апробация работы.
Апробация работы состоялась на заседании Экспертного Специализированного Совета предварительной экспертизы диссертационных работ по медицинской вирусологии и эпидемиологии при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 21 мая 2003 г.
Результаты исследований представлены и обсуждены на заседании секции вирусологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (19 ноября 2001 г.) и на П-ой Научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (г. Новосибирск, май, 2002 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных статей в центральных научных журналах и 7 тезисов докладов - в сборниках конференций.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литература, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (49 отечественных и 154 зарубежных источников). Общий объем работы составляет 155 страниц машинописного текста, включающего 35 таблиц и 19 рисунков

Список литературы

ОБСУЖДЕНИЕ
Настоящая диссертация основана, в основном, на материалах изучения крупной эпидемической вспышки лихорадки Западного Нила, наблюдавшейся в южных регионах Европейской части России летом и осенью 1999 г. В результате проведенной работы нами было верифицировано 244 случая ЛЗН из числа 683 серологически обследованных больных с летними лихорадочными и нейроинфекциоными заболеваниями из Волгоградской, Астраханской областей и Краснодарского края. Всего в 1999 г. было зарегистрировано 560 серологически подтвержденных случаев ЛЗН, в том числе, впервые в Волгоградской области (380 случаев) и Краснодарском крае (85 случаев).
На территории бывшего СССР немногочисленные случаи ЛЗН вперые наблюдались с 1967 г. в Астраханской области (7), в 70-е, 80-е и 90-е годы - в Белоруссии, на Западной Украине (26). В Астраханской области в 1967 г. было выявлено 12 лабораторно подтвержденных случаев ЛЗН (4, 6, 7, 24), а за период с 1990 по 1998 г.г. - 27 случаев: 10 в 1990-1996, 7 в 1997 и 9 в 1998. (10, 48). Коллективом Центра экологии и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по данным сероэпидемиологических исследований, проведенных в 1985-1990 г.г., было показано, что ареал вируса ЗН охватывает Молдавию, Украину, Белоруссию, юг Европейской части России, Алтайский край (степи и лесостепь), но наиболее активная циркуляция вируса происходит в степных ландшафтных поясах Поволжского района вдоль долин крупных рек (26).
Как известно, среди вирусов серокомплекса японского энцефалита, к которому относится вирус ЗН, существуют выраженные антигенные связи (94, 95, 111). Поэтому, на первом этапе расшифровки этиологиии вспышки ЛЗН в 1999 г. на юге России, возникла необходимость параллельного обследования сывороток крови больных ЛЗН с родственными вирусами японского энцефалита, желтой лихорадки, энцефалита Сент-Луис и ЗН с целью определения специфичности антител. В результате этой работы было установлено резкое
преобладание титров антигемагглютининов к вирусу ЗН и обнаружение в тех же сыворотках и видоспецифичных IgM, что свидетельствовало о роли вируса ЗН в качестве причинного агента заболеваний у обследованных контингентов больных людей.
36 больных, с подтвержденным в ИФА-IgM диагнозом ЛЗН из Астраханской области, были обследованы в ИФА на антиген вируса ЗН: в 7 случаях были обследованы сыворотки крови и СМЖ, в 23-х - только сыворотки крови и в 6 (7 проб) - только СМЖ. Все пробы тестировались также на наличие вируса ЗН методом интрацеребрального заражения новорожденных белых мышей (нбм). Антиген методом ИФА удалось выявить в двух случаях. У одного больного с лихорадочной формой ЛЗН антиген вируса ЗН был обнаружен в сыворотке крови на 6 день болезни в титре 1:20. В этой же сыворотке присутствовали специфические IgM в титре 1:200. При заражении нбм вирус выделить не удалось. У другого пациента, также с лихорадочной формой болезни, при обследовании сыворотки, взятой на 7 день болезни, антиген был обнаружен в титре 1:5. В этом случае также были обнаружены специфические IgM в титре 1:100. Из этой же сыворотки крови был выделен штамм Аст. 986 вируса ЗН.
Такое редкое обнаружение антигена вируса ЗН методом ИФА и недостаточно регулярное выделение вируса из сывороток крови и СМЖ можно было объяснить нарушением температурного режима транспортировки материалов из больниц в лабораторию. По данным Goldblum, Sterk, Jasinska-Klindberg (90), в первый день заболевания вирус ЗН выделялся из крови больных в 77% случаев и достаточно регулярно - до третьего дня. Southam и Мооге (173) при экспериментальном заражении около 30 онкологических больных штаммом Eg 101 вируса ЗН обнаружили вирусемию через 24 часа после заражения у всех пациентов за исключением четырех, а на третий день или позже - у 87,0%. Судя по обследованию восьми больных, титры вируса ЗН достигали максимального значения на 3 или 4 дни после заражения.
По нашим результатам обследования больных с подозрением на ЛЗН частота подтверждения диагноза «лихорадка Западного Нила» в ИФА-IgM составила 35,7% (244 из 683 обследованных), в том числе по Волгоградской области 85,7% (108 случаев из 126 обследованных), по Астраханской области 18,9% (95 из 504), по Краснодарскому краю 77,4% (41 из 53). В Астраханской области обследование на IgM к вирусу ЗН проводилось, начиная с мая 1999 г., за три месяца до начала эпидемической вспышки ЛЗН, поэтому частота подтверждения диагноза ЛЗН, по сравнению с другими регионами, оказалась значительно меньшей.
В доступной литературе отсутствует достаточно полная информации о сравнительной эффективности применения различных серологических реакций (ИФА-IgM, ИФА-IgG, РТГА, РДПА, ВИЭФ) для обнаружения специфических антител у больных ЛЗН. Полученные нами данные свидетельствуют о высокой степени совпадения результатов ИФА-IgM, ИФА- IgG и РТГА: в целом по трем южным регионам России за 1999 г. результаты ИФА-IgM и ИФА- IgG совпали в 88,5±1,7% , ИФА-IgM и РТГА - в 94,2±1,4%, ИФА-IgG и РТГА - в 92,9±1,5%. Результаты РДПА совпадали с данными ИФА-IgM, ИФА- IgG и РТГА в 45,3% случаях, а ВИЭФ (с данными трех последних тестов) - в 38,4%. Совпадение результатов РДПА и ВИЭФ между собой составило 92,9%. Методы РДПА и ВИЭФ, по сравнению с ИФА-IgM, ИФА-IgG и РТГА, оказались значительно менее чувствительными и их применение для серодиагностики ЛЗН не может обеспечить достаточной результативности.
С целью оценки возможностей использования ИФА-IgM, ИФА-IgG и РТГА для специфической диагностики ЛЗН были проанализированы данные обследования парных сывороток соответственно 137, 116 и 104 больных ЛЗН. Среди137 больных с серологически подтвержденными (методом МАС-ELISA) диагнозом ЛЗН сероконверсия специфических IgM в парных сыворотках от 0 до 1:100-1:204800 установлена у 31 из 137 больных (22,6%), а у 106 (77,4%) - обнаружены IgM к вирусу ЗН в титрах > 1:800.
IgG к вирусу ЗН (в титрах >1:100) были обнаружены в сыворотках 112 (96,6%) больных с диагнозом «ЛЗН», подтвержденным методом МАС-ELISA. Однако диагностически значимое нарастание или падение титров антител выявлялось в парных сыворотках только у 56 (48,3%) из 116 обследованных больных.
Антигемагглютинины к вирусу ЗН в титрах >1:20 были обнаружены у 100 (96,2%) больных. В случае использования для серодиагностики ЛЗН только РТГА, на основании обнаружения диагностически значимого нарастания или падения титров антигемагглютининов в парных сыворотках, диагноз ЛЗН был бы установлен только у 40 из 104 больных (38,5%).
Анализ наших данных позволяет сделать вывод, что при серологическом обследовании парных или одиночных сывороток и проб СМЖ больных с подозрением на ЛЗН абсолютное диагностическое значение имеют результаты МАС-ELISA. Этот вывод совпадает с мнением Schmitz and Emmerich (164), Blackburn (59) и Cemescu et al. (64). ИФА-IgG и РТГА могут быть использованы в качестве дополнительных методов, позволяющих подтвердить результаты МАС-ELISA и обнаружить, в ряде случаев, сероконверсию антител при обследовании парных сывороток.
Средние геометрические титров (СГТ) специфических IgM к вирусу ЗН у больных ЛЗН на 3-5 дни заболевания составляли 2,98±0,17 lg и достигали максимального значения 4,29±0,02 lg на 11-15 дни. У некоторых больных (20,3%) в этот период титры IgM достигали 1:102400 - 1:204800. Через 3-4 недели от начала заболевания СГТ IgM снижались до 4,04±0,03 lg. Анализ динамики IgG и антигемагглютининов к вирусу ЗН показал, что для выявления диагностически значимого изменения титров в ИФА-IgG и РТГА требуется соблюдение сроков забора парных сывороток крови с интервалом не менее 10 и 14 дней соответственно. Наибольшие показатели СГТ IgG и антигемагглютининов соответственно 3,75±0,04 lg и 2,6±0,04 lg были обнаружены на 16-18 дни болезни. В единичных случаях (3,7%) в эти дни титры IgG достигали 1:102400, а титры антигемагглютининов (у 16,3% пациентов) - 1:1280 и выше. Tardei с соавторами (2000) обнаруживали после 4-5 дня болезни IgG к вирусу ЗН в средних титрах 1:6400. По нашим данным, через 3-4 недели от начала заболевания уровень IgG и антигемагтлютининов оставался практически прежним - 3,75±0,04 lg и 2,44±0,03 lg соответственно. Таким образом, СГТ IgM достигали максимальных значений на 3-5 дней раньше, чем IgG и антигемагтлютининов (соответственно на 11-15 и 16-18 дни от начала заболевания). Полученные результаты свидетельствуют о более высоких диагностических возможностях ИФА-IgM перед ИФА-IgG иРТГА.
Метод МАС-ELISA рекомендован ВОЗ для проведения экспресс-диагностики арбовирусных инфекций (14). Титр специфических IgM антител >1:800 считается критерием для постановки этиологического диагноза по результатам обследования одной пробы крови больного (59, 63, 82, 129, 164). Наши критерии для постановки этиологического диагноза ЛЗН заключались в обнаружении IgM к вирусу ЗН в сыворотке крови больных ЛЗН в титре >1:800, в СМЖ - >1:10 (при обследовании одной пробы) или выраженной сероконверсии специфических IgM при обследовании парных сывороток. Tardei с соавторами (183) в 1996 г. в Румынии у больных ЛЗН выявляли специфические IgM в титрах >1:10000, в некоторых случаях >1:50000 и объясняли этот факт высоким содержанием антител и значительной чувствительностью ИФА.
При практическом использовании метода МАС-ELISA для серологической экспресс-диагностики ЛЗН (по результатам обследования одной пробы крови) можно рекомендовать проведение первичного скрининга сывороток в разведении 1:100 и 1:800. Положительный результат, полученный при разведении сыворотки 1:800 достоверно свидетельствует о том, что данное заболевание связано с вирусом ЗН. При положительном результате только в разведении 1:100, необходимо исследовать сыворотки данного больного в динамике. Идеальным вариантом подтверждения диагноза ЛЗН может служить выявление положительной или отрицательной динамики IgM к вирусу ЗН в парных сыворотках, в
сочетании с выявлением динамики специфических IgG и антигемагглютининов. При проведении ИФА-IgG и РТГА диагностическое значение имеют следующие результаты:
1. Отсутствие антител в I пробе и наличие их (в титре 1:100 и выше) во II;
2. Четырехкратное и более значительное нарастание (или снижение) титров IgG во II пробе по сравнению с I (например, 1:200 в I пробе и 1:800 и выше во П пробе, или 1:800в1и 1:200 во II).
Значительную диагностическую ценность метода МАС-ELISA представляет выявление специфических IgM в спинномозговой жидкости больных ЛЗН, что нашло широкое применение для экспресс-диагностики клещевого энцефалита (95), а также для диагностики нейроинфекционных заболеваний, вызываемых вирусами Тягиня, Инко (31), энцефалита Ла Кросс (85). IgM к вирусу ЗН в титрах 1:10-1:1280 были обнаружены (на 2-18 дни заболевания) во всех 34 пробах СМЖ от 33 больных из Астраханской области, имеющих IgM к вирусу ЗН в сыворотке крови. Таким образом, экспресс-диагностика нейроинфекционных форм ЛЗН, может основываться на обнаружении специфических IgM не только в сыворотках больных, но и в СМЖ. По мнению Cemescu с соавторами (64,65), присутствие специфических IgM только в СМЖ свидетельствует о неблагоприятном прогнозе в развитии болезни.
Нами впервые было показано, что при нейроинфекционной форме в течение всего срока наблюдения (3-24 дни болезни) уровни антигемагглютининов к вирусу ЗН были достоверно выше, чем при лихорадочной форме: соответственно, в среднем, 2,6 lg и 2,0 lg.
СГТ антигемагглютининов к вирусу ЗН у больных с нейроинфекционной и лихорадочной формами ЛЗН на 3-4 дни заболевания составляли соответственно 1,69±0,28 lg и 0,4±0,4 lg. На 5 день болезни они возросли в 3,2-8,8 раз и равнялись соответственно 2,19±0,18 lg и 1,34±0,26 lg. На 6 день оказались почти в 3 раза выше у больных с нейроинфекционной формой ЛЗН, чем при лихорадочной форме: 2,58 ±0,12 lg и 2,1+0,15 lg соответственно. СГТ антигемагглютининов к вирусу ЗН у больных нейроинфекционной
формой ЛЗН максимального уровня достигали к 17-19 дню заболевания (2,83±0,1 lg), а у больных лихорадочной формой - к 15-16 дню от начала болезни (2,25±0,2 lg). На 20-24 дни титры снизились как у больных с нейроинфекционной, так и с лихорадочной формами ЛЗН: до 2,71±0,13 lg и 2,10±0,23 lg соответственно.
При анализе динамики специфических IgM у больных ЛЗН в зависимости от возраста впервые было установлено, что у людей в возрасте 50 лет и старше со 2 по 11 дни от начала болезни СГТ IgM были достоверно выше, чем в возрасте 4-49 лет. К концу срока наблюдения (24 день) самые высокие титры специфических IgM определялись у больных 4¬14 лет. Максимальные титры IgM у больных в возрасте 4-14 и 15-49 лет отмечались на 18-24 дни от начала заболевания (соответственно 5,0+0,36 lg и 4,4±0,16 lg); в возрасте 50 лет и старше - на 12-17 дни (4,82±0,19 lg).
Титры IgG к вирусу ЗН у больных в возрасте 50 лет и старше в течение первых 11 дней от начала заболевания были достоверно выше, чем у людей в возрасте 4-49 лет. У детей в период с 12 по 17 дни заболевания титры IgG резко возрастали и на 18-24 дни становились существенно выше, чем у больных юношеского, молодого, среднего и старшего возраста. К концу срока наблюдения (24 день) самые высокие титры специфических IgG встречались у больных в возрасте 4-14 лет, промежуточное положение занимали показатели у лиц 50 лет и старше, самые низкие - в возрастной группе 15-49 лет. Максимальные титры IgG у больных в возрастных группах 4-14 и 15-49 лет были обнаружены к 18-24 дням (соответственно 4,8±0,31 lg и 3,61±0,23 lg), у людей 50 лет и старше - на 12-17 дни (3,90±0,20 lg).
Уровень антигемагглютининов у людей старше 50 лет в течение 11 дней от начала заболевания был достоверно выше, чем в возрасте 4-49 лет. У детей 4-14 лет антигемагглютины к вирусу ЗН появлялись лишь на 12-17 дни от начала заболевания в титре 2,50 ±0,31 lg. Максимального уровня антигемагглютинины к вирусу ЗН у больных в возрасте 4-14,15-49 и 50 и старше достигали к 18-24 дню заболевания, составляя 3,0±0,40 lg, 2,5±0,2
lg и 2,5±0,2 lg соответственно.
Уровень специфических IgG у женщин был достоверно выше, чем у мужчин, в течение всего срока наблюдения (2-24 дни болезни), а уровень IgM и антигемагглютининов - до 17 дня от начала заболевания.
На 2-5 дни заболевания СГТ IgM к вирусу ЗН у больных мужского и женского пола составляли 1,6 ±0,11 lg и 2,1±0,14 lg. На 6-11 дни - 3,6±0,10 lg и 4,1±0,16 lg соответственно. Максимального уровня СГТ IgM к вирусу ЗН у женщин достигали на 12-17 дни заболевания (4,6±0,11 lg), а у мужчин - на 18-24 дни (4,4±0,11 lg). К концу срока наблюдения (24 дня) титры IgM у женщин снизились до 4,3 ±0,12 lg, у мужчин оставались на максимальном уровне.
СГТ IgG к вирусу ЗН у мужчин и женщин, больных ЛЗН, на 2-5 дни заболевания составляли соответственно 0,39±0,10 lg и 1,7±0,15 lg, на 6-11 день -1,7±0,12 lg и 2,9±0,18 lg соответственно. Максимальный уровень IgG отмечен на 18-24 дни заболевания: 3,7±0,10 lg у мужчин и 4,1 ±0,19 lg у женщин.
На 2-5 дни заболевания СГТ антигемагглютининов к вирусу ЗН у мужчин и женщин составляли 0,8±0,11 lg и 0,4±0,15 lg, на 6-11 дни -1,3 ±0,11 lg и 2,0 ±0,19 lg соответственно. Максимального уровня СГТ антигемагглютининов достигали к 18-24 дню заболевания: 2,6±0,2 lg у мужчин и 2,7±0,14 lg у женщин.
Установленные нами данные о преобладании показателей специфических антител у больных нейроинфекционной формой ЛЗН и лиц старше 50 лет согласуется с предположением Ройт, Бростофф, Мейл (36) о значении иммунопатологических процессов в патогенезе наиболее тяжело протекающих случаев ЛЗН.Сетезси et al. (64) при обследовании больных ЛЗН в Румынии в 1996 г. отметили крайне тяжелое течение заболевания у 14 больных с ранним появлением антител.
При анализе динамики специфических антител у больных ЛЗН нами выявлены два основных типа иммунного ответа: первичный и вторичный. При первичном типе иммунного ответа титры специфических IgM на 2-7 день заболевания не превышали 2,06±0,3 lg, титры IgG к вирусу ЗН - 1,85±0,2 lg, антигемагглютининов - 1,93±0,1 lg. К 11-24 дню уровни IgM возрастали до 4,37±0,11 lg, IgG - до 3,52±0,08 lg, антигемагглютининов до 2,74±0,05 lg, что позволяло выявлять диагностически значимую сероконверсию. Вторичный тип характеризовался более высокими показателями специфических IgM и IgG уже на 2-7 день болезни: 4,68±0,1 lg и 3,75±0,14 lg соответственно, и относительно высокими титрами антигемагглютининов (2,7±0,09 lg). К 24 дню заболевания наблюдалась тенденция к снижению титров IgM до 4,28±0,1 lg, IgG - до 3,4±0,18 lg, антигемагглютининов - до 2,3±0,09 lg. При вторичном типе иммунного ответа динамика антител к вирусу ЗН в парных сыворотках обнаруживалась не во всех случаях: титры IgM к вирусу ЗН в 14,0% случаев на 2-7 и 11-24 дни болезни были одинаковыми и составляли 4,36±0,09 lg. Титры IgG в 19,3% случаях сохранялись на уровне 3,64±0,08 lg, титры антигемагглютининов в 50,7% - на уровне 2,78±0,08 lg. В ИФА-IgG и РТГА соответственно у 4,8 и 6,0% больных, с подтвержденным диагнозом ЛЗН, в парных сыворотках, взятых с 3 по 15 дни болезни, не было обнаружено антител к вирусу ЛЗН, что скорее всего связано с незначительными интервалами обследования (в среднем 5±0,7 дней).
При лихорадочной форме ЛЗН первичный тип ответа специфических IgM и IgG наблюдался значительно чаще, чем вторичный: соответственно в 78,9 и 21,1% (р<0,001); 70,8 и 12,5 % случаев (р<0,001). При нейроинфекционной форме соотношение частоты выявления первичного и вторичного типов ответов IgM равнялось соответственно 43,6 и 56,4 % (р<0,317), IgG - 64,4 и 35,6% (р<0,003). Первичный и вторичный типы продукции антигемагглютининов к вирусу ЗН при лихорадочной форме болезни встречались примерно с одинаковой частотой: соответственно 38,4 и 30,8 % . При нейроинфекционной форме ЛЗН вторичный тип ответа антигемагглютининов наблюдался значительно чаще, чем первичный: соответственно в 63,0 и 37,0 % случаев (р<0,010).
Во время эпидемической вспышки ЛЗН в 1999 г. на юге Российской Федерации по результатам серологической диагностики было выявлено 560 больных ЛЗН. С целью уточнения эпидемиологической и клинической характеристики заболевания нами было проанализировано 529 случаев случаев ЛЗН: 380 из Волгоградской области, 95 из Астраханской области и 54 из Краснодарского края.
Все случаи ЛЗН наблюдались с конца июля до начала октября 1999 г., то есть в период наибольшей активности основных переносчиков вируса. Hubalek and Halouzka (99) также отмечали, что численность и зараженность кровососущих комаров в эндемичных регионах Европы достигает максимальных показателей в июле-августе, что совпадает с началом заболеваемости ЛЗН. По наблюдениям Andreadis et al. (51), White et al. (199), Kulasekera et al. (113) в Нью-Йорке и окрестностях в 2000 г. максимальная зараженность комаров С. pipiens и С. salinarius вирусом ЗН наблюдалась в начале августа, что предшествовало последующиму пику заболеваемости ЛЗН.
Относительные показатели заболеваемости на 100000 населения составляли 12,2 в г. Астрахани (при соответствующем областном показателе - 9,3), 32,7 в г. Волжском Волгоградской области, 25,9 - в г. Волгограде и 10,1 по эндемичным сельским районам Вологоградкой области (при соответствующем областном показателе - 14,4), что в целом превышало показатели заболеваемости (12,4 на 100000) в Румынии в 1996 г. (64,65,100); в США в 1999 г. (0,65 на 100000) (141) и в Израиле в 2000 г.(7 на 100000) (86,196).
Среди заболевших преобладали городские жители (72,6-93,7%), что было характерно для всех последних крупных эпидемических вспышек ЛЗН в Румынии в 1996 г. (64,65,100), США в 1999 г. (141) и Израиле в 2000 г. (86,196).
Более 60% больных ЛЗН в 1999 г. в Российской Федерации были в возрасте старше 50 лет. По данным Cemescu et al. (64,65) в Румынии в 1996 г. средний возраст заболевших был 51,1 год, в США в 1999 г. - 71 год (141), в Израиле в 2000 г. - 57 лет, 46% составляли лица старше 60 лет (86,196).
По трем регионам Российской Федерации в 1999 г. среди заболевших ЛЗН лица мужского пола составляли 75,6%.
Во время вспышки в Волгоградской области умерли 38 больных (10,0%), в Астраханской области - 5 человек (5,3%). В целом по двум регионам летальность составила 7,7%. В Краснодарском крае летальных исходов не была зарегистрировано. В Румынии в 1996 г., в США в 1999 г. и в Израиле в 2000 г. летальность составляла соответственно 4,3%, 9,5% и 7,9% (64,65,86,100,141,196).
По результатам опросов, проведенных сотрудниками ЦГСЭН в Волгоградской и Астраханской областей, было установлено, что за 10 дней, предшествующих заболеванию, 47% больных лихорадкой ЗН выезжали из города на дачные участки, 29,8% - на отдых и купанье на Волгу, Ахтубу и другие водоемы, 20,2% - на рыбную ловлю. Присасывания или нападения клещей не отмечали. 70% заболевших - жителей сельских районов, проживали вблизи рек, прудов или канала в радиусе менее 3 км. Наличие комаров на дачных участках, в жилых помещениях, а также в местах отдыха и рыбной ловли отмечали практически все опрошенные. Заболеваний и гибели диких и домашних птиц в местах возможного заражения не было установлено. Проведенный анализ заболеваемости в Астраханской области позволил сделать заключение о том, что к категории повышенного риска заражения ЛЗН относятся рыбаки, охотники, лица занятые сельскохозяйственной деятельностью, проживающие в местах или посещающие территории с высокой численностью комаров, диких и синантропних птиц (10,48). Никто из больных ЛЗН из Волгоградской, Астраханской областей и Краснодарского края за пределы своих территорий не выезжал (10,32,39,48).
Суммарный показатель гуморального иммунитета к вирусу ЗН у населения Астраханской области за 1998 и 1999 г.г., по данным обследования сывороток крови доноров в PH, ИФА-IgG и РТГА, составил 37,9%. После эпидемической вспышки ЛЗН 1999 г., по сравнению с 1998 г., произошло увеличение серопозитивных лиц с 31,6 до 50,0% (р<0,001), в основном, за счет возрастания (на 18,1%) числа доноров, имеющих нейтрализующие антитела к вирусу ЗН.
При обследовании сывороток крови 142 доноров, собранных в июле-сентябре 1998 г. IgM к вирусу Западного Нила не были обнаружены ни в одном случае.
У 5 из 162 (3,1%) практически здоровых жителей г. Астрахани, обследованных в июле-октябре 1999 г., были обнаружены IgM к вирусу ЗН, что свидетельствовало о недавно перенесенной инаппарантной форме ЛЗН. Сравнение этих данных с относительным показателем заболеваемости на 100000 населения по г. Астрахани и области (12,2) позволило определить примерное соотношение манифестных и инапарантных форм ЛЗН в 1999 году как 1:250.
Анализ распределения антител к вирусу ЗН в зависимости от возраста не выявил статистически достоверных различий уровней гуморального иммунитета в возрастных группах 20-29, 30-39, 40-49 и 50-59 лет в 1998 и 1999 г.г. Дальнейшие исследования предусматривают необходимость серологического обследования детей и подростков.
По суммарным данным за 1998 и 1999 гг. не было обнаружено статистических различий между показателями иммунной прослойкой к вирусу ЗН у мужчин и женщин, которые составляли соответственно 39,7 и 32,8% (р<0,32). Однако в 1999 г. антитела у мужчин встречались значительно чаще (54,4%), чем у женщин (39,6%) (р<0,001), что согласуется с фактом преобладания лиц мужского пола (75,6%) среди больных ЛЗН во время эпидемической вспышки ЛЗН в 1999 г.
В 1998 году иммунная прослойка к вирусу ЗН была практически одинаковой среди городских и сельских жителей: 31,7 и 30,4% соответственно. В 1999 году наблюдалась
другая ситуация: в сыворотках крови доноров, проживающих в сельской местности, антитела к вирусу ЗН обнаруживались достоверно чаще, чем у горожан: в 44,2% и 60,3% (р<0,045). При этом, после эпидемической вспышки ЛЗН в 1999 г., число иммунных людей в г. Астрахани и сельских районах области выросло по сравнению с 1998 г. В общем, по результатам исследований за два года 51,9% доноров из сельской местности и 35,0% горожан имели антитела к вирусу Западного Нила.
Показатель гуморального иммунитета к вирусу ЗН у населения трех районов Астраханской области в декабре 2001 г., по данным обследования сывороток крови доноров в ИФА-IgG, составил 19,4%. Иммунная прослойка в Приволжском районе составила 25,5 %, в Наримановском - 16,4 %, в Камызякском -18,2 %.
При обследовании сывороток крови 145 доноров, собранных в декабре 2001 г., IgM к вирусу Западного Нила не были обнаружены ни в одном случае.
Анализ распределения антител к вирусу ЗН в зависимости от возраста выявил статистически достоверное увеличение уровней гуморального иммунитета в возрастных группах 15-39 и 40-75 лет в 2001 г.: IgG к вирусу ЗН встречались соответственно в 12,7 и 24,6 % (р<0,02).
Проведенные нами исследования указывают на хорошую корреляцию результатов PH и ИФА-IgG при изучении иммуноструктуры населения к вирусу ЗН. В целом за два года, результаты PH и ИФА- IgG совпадали в 79,9±2,0% , PH и РТГА - в 71,7±2,4%, ИФА-IgG и РТГА - в 80,8±1,9%. При изучении корреляционной связи между результатами PH и ИФА- IgG, PH и РТГА, ИФА-IgG и РТГА была выявлена умеренная прямолинейная зависимость. При обследовании сывороток крови, собранных в 1998 г. результаты PH и ИФА-IgG оказались практически одинаковыми: 26,3 и 27,1% положительных ответов соответственно. Однако по данным 1999 г. вируснейтрализующие антитела у доноров, вьмвлялись чаще (44,4%), чем IgG (27,1%).
РТГА обладает значительно меньшей чувствительностью, чем PH и ИФА-IgG для обнаружения анамнестических антител к вирусу ЗН, поэтому информативность, полученных с помощью этой реакции данных, менее значительна. Показатели обнаружения специфических антигемагглютининов у населения г. Астрахани и области за последние 37 лет практически не изменились: в 1964-1965 г.г. - 10,3% (5), в 1967-1970 г.г. от 4,1% до 16,1% (2), в 1998 г. - 7,8%, в 1999 г. - 6,9%.
Клинический анализ 529 случаев ЛЗН, показал, что клинические проявления заболевания разнообразны и не имеют ярко выраженных патогномоничных симптомов. Инфекционистами было выделено две формы ЛЗН (29,30,40,48): без поражения центральной нервной системы (лихорадочная) и с синдромом острой нейроинфекции. Лихорадочная форма ЛЗН встречалась у 110 больных (20,8%). В зависимости от выраженности и продолжительности тех или иных неврологических симптомов и данных исследования ликвора было выделено три варианта течения нейроинфекционной формы заболевания: менингеальный, протекавшего по типу серозного менингита у 364 больных (68,8%), менингоэнцефалитический, наблюдавшегося у 54 больных (10,2%) и энцефалитический (1 случай - 0,2%).
Во всех случаях заболевание характеризовалось острым началом, лихорадкой (чаще до 38-40° С), головной болью и длительной слабостью. 22,4% переболевших ЛЗН выписывались с сохраняющимся выраженным астено-вегетативным синдромом. Из других симптомов наиболее часто наблюдались рвота (52,2%), тошнота (54,1%), повышенное артериальное давление при поступлении (30,7%), мраморностью кожных покровов и похолоданием конечностей (26,9%), миалгии в нижних конечностях (15,3%).
Менингеальный синдром проявлялся преобладанием ригидности мышц затылка, при слабо выраженных симптомах Кернига и Брудзинского. У большинства больных менингит развивался уже на 1 -3 сутки заболевания. Обратное развитие менингеальных симптомов происходило в течение 7-10 суток. Из других симптомов наиболее часто наблюдались нарушения сознания (36,9%), сонливость (35,9%), нистагм (35,8%), общий тремор (33,3%), а также парезы и параличи, преимущественно нижних конечностей (17,9%), судорожный синдром (10,5%), расстройство мышления (10,2%).
1. Впервые получены данные, указывающиеся на значение вируса Западного Нила в этиологии крупной эпидемической вспышки на юге России (Астраханская и Волгоградская области, Краснодарский край), где в 1999 году при участии автора диссертации было верифицировано S60 случаев лихорадки Западного Нила.
2. Установлены критерии для постановки этиологического диагноза «лихорадка Западного Нила»: регулярное выявление специфических IgM, IgG и антигемагглютининов в сыворотках крови и пробах СМЖ, сероконверсия антител в парных сыворотках, высокое совпадение данных обследования сывороток методами MAC-ELISA, ИФА-IgG и РТГА, выделение штаммов вируса Западного Нила от больных людей и обнаружение в их крови специфических антигенов.
3. В результате серологического обследования больных людей проведена дифференциация лихорадки Западного Нила от этиологически родственных флавивирусных инфекций (японского энцефалита, желтой лихорадки і энцефалита Сент-Луис), а также эндемичных
арбовирусных заболеваний (крымская І трагическая лихорадка и лихорадка Синдбис),
встречающихся в южных регионах.
4. В процессе работы установлена практически одинаковая эффективность методов ИФА- IgM (MAC-ELISA), ИФА-IgG и РТГА для выявления специфических антител у больных ЛЗН: результаты ИФА-IgM и ИФА-IgG совпадали в 88,5%, ИФА-IgM и РТГА — в 94,2%, ИФА-IgG и РТГА — в 92,9%.
5. У больных ЛЗН выявлено два основных типа ответов гуморальных антител: первичный, преобладающий при лихорадочной форме заболевания, и вторичный, преобладающий при нейроинфекционных формах.
6. Установлена зависимость титров IgM, IgG и антигемагглютининов у больных ЛЗН от тяжести заболевания, возраста и пола. В целом, показатели титров антител в течение первых 1,5 недель заболевания значительно выше у больных в возрасте старше 50 лет, при нейроинфекционной форме заболевания, и выше у женщин, чем у мужчин.
7. Показано, что наилучшим методом серодиагностики ЛЗН является МАС-ELISA. В случае обследования на антитела класса IgM диагноз ЛЗН может быть поставлен по результату обследования одной сыворотки крови (в титре >1:800) или СМЖ (в титре >1:10), взятых у больного в острый период болезни, а также на основании выявления положительной или отрицательной динамики IgM, IgG и антигематлютининов в парных сыворотках. При обследовании на антитела IgG и антигемагглютинины необходимо проводить сравнительное титрование парных сывороток, взятых у больного в острый период заболевания и через 1,5-2 недели.
8. Показано, что в Астраханской области после эпидемической вспышки ЛЗН 1999 г., по сравнению с 1998 г., произошло увеличение серопозитивных лиц с 31,6 до 50,0%. В целом за 1998-1999 г.г. в Астраханской области 51,9% сельских жителей и 35,0% горожан имели антитела к вирусу ЛЗН. По данным ИФА-IgG достаточно высокий уровень иммунной прослойки населения (19,4%) сохранился и в 2001 г.
9. По данным анализа серологически подтвержденных случаев, вспышка лихорадки Западного Нила на юге России в 1999 г. характеризовалась высокой заболеваемостью городских жителей, что ранее не наблюдалось в эндемичных регионах СНГ и России. Более 60 % больных были в возрасте старше 50 лет. ЛЗН протекала в двух формах: лихорадочной (20,8%) и нейроинфекционной (79,2%) с тремя вариантами течения (менингеальным, по типу серозного менингита. (68,8%), менингоэнцефалитическим (10,2%) и энцефалитическим (0,2%). Летальность составила 7,7%.