Цвігун Вікторія Олександрівна Різноманіття вірусів рослин родини Cucurbitaceae на території України

Краткое описание

Цвігун Вікторія Олександрівна, аспірант кафедри вірусо­логії ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського націо­нального університету імені Тараса Шевченка: «Різноманіття вірусів рослин родини Cucurbitaceae на території України» (03.00.06 - вірусологія). Спецрада Д 26.001.14 у Київсько­му національному університеті імені Тараса Шевченка

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
Цвігун Вікторія Олександрівна
УДК 578.85/.86
ДИСЕРТАЦІЯ
РІЗНОМАНІТТЯ ВІРУСІВ РОСЛИН РОДИНИ CUCURBITACEAE
НА ТЕРИТОРІЇ УКРАЇНИ
03.00.06 – вірусологія
природничі науки
Подається на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук (доктора філософії)
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
В.О. Цвігун
(підпис, ініціали та прізвище здобувача)
Науковий керівник Поліщук Валерій Петрович доктор біологічних наук,
професор

КИЇВ – 2017

ЗМІСТ
ВСТУП ………………………………………………………………………………10
РОЗДІЛ 1 Характеристика деяких вірусів, що уражують рослини родини
Cucurbitaceae ………………………………………………………………………...15
РОЗДІЛ 2 Загальна характеристика Cucumber mosaiс virus ……………………..19
РОЗДІЛ 3 Загальна характеристика Zucchini yellow mosaic virus …………...….28
РОЗДІЛ 4 Загальна характеристика Watermelon mosaiс virus 2 …….…………...30
РОЗДІЛ 5 Генетична варіабельність Cucumber mosaiс virus, Watermelon mosaiс
virus 2 та Zucchini yellow mosaic virus …………………………………………..…34
РОЗДІЛ 6 Об'єкти, матеріали та методи досліджень …………………………….39
6.1. Віруси ……………………………………………………………….…………...39
6.2. Рослини ……………………………………………………………….…………39
6.3. Матеріали та реактиви, використані у роботі ……………………….………..39
6.4. Методи досліджень …………………………………………………….……….40
6.4.1. Відбір зразків ……………………………………………………….………...40
6.4.2. Біологічне тестування ……………………………………………….…….....40
6.4.3. Електронна мікроскопія ……………………………………………….……..41
6.4.4. Імуноферментний аналіз в модифікації “сендвіч” ………………….……42
6.4.5. Метод непрямого імуноферментного аналізу ……………………………...44
6.4.6. Виділення Cucumber mosaiс virus …………………………………………...45
6.4.7.Виділення Watermelon mosaiс virus 2 та Zucchini yellow mosaic virus
…………………………………………………………………………….…….…….45
6.4.8. Вимірювання концентрації вірусних препаратів …………………...............46
6.4.9. Електрофорез білків в поліакриламідному гелі за Леммлі ……………..….46
6.4.10. Отримання поліклональної кролячої антивірусної сироватки до СMV …49
6.4.11.Отримання поліклональної кролячої антивірусної сироватки до WMV 2.49
6.4.12.Виділення тотальної РНК за допомогою кіта RNeasy Plant Minikit (Qiagen,
Великобританія) ……………………………………………………………………..50
6.4.13. Полімеразна ланцюгова реакція ……………………………………………51
6.4.14. Електрофорез нуклеїновових кислот ………………………………………53
8
6.4.15. Сиквенування нуклеїнової кислоти ………………………………………..54
6.4.16. Побудова філогенетичних дерев за допомогою програми MEGA ……....55
6.4.17. Статистична обробка результатів ……………….…………………………55
РОЗДІЛ 7 Вірусні хвороби рослин родини Cucurbitaceae, що циркулюють на
території України ……………………………………………………………………57
РОЗДІЛ 8 Біологічні властивості ZYMV, WMV 2 та CMV ………………….….67
РОЗДІЛ 9 Фізико-хімічна та серологічна характеристика ізолятів ZYMV, WMV
2 та CMV ……………………………………………………………………………..72
РОЗДІЛ 10 Філогенетичний аналіз генів капсидних білків Українських ізолятів
………………………………………………………………………………………...76
10.1. Філогенетичний аналіз ділянки геному капсидного білка Watermelon mosaiс
virus 2 ……………………………………………………………………………......76
10.2. Філогенетичний аналіз ділянки геному капсидного білка Zucchini yellow
mosaic virus …………………………………………………………………………..82
10.3. Філогенетичний аналіз гена капсидного білка Cucumber mosaiс virus.........88
РОЗДІЛ 11 Вірусна контамінація насіння рослин родини Cucurbitaceae ……...98
УЗАГАЛЬНЕННЯ ………………………………………………………………..104
ВИСНОВКИ ……………………………………………………………………….111
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ………………………………………113
9
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АГ – антиген
АС – антисироватка
АТ – антитіло
ZYMV – Zucchini yellow mosaic virus
ВЗКМО – вірус зеленої крапчастої мозаїки огірка
ВКПТ – вірус кільцевої плямистості тютюну
ВМГ – вірус мозаїки гарбуза
WMV 2 – Watermelon mosaiс virus 2
ВМДО – вірус мозаїки дикого огірка
CMV – Cucumber mosaiс virus
ВНТ – вірус некрозу тютюну
ВНПБ – вірус некротичної плямистості бальзаміну
ВПО – вірус пожовтіння огірка, що передається попелицями
ВТМ – вірус тютюнової мозаїки
ЗТ-ПЛР – зворотньотранскрипційна полімеразна ланцюгова реакція
кДНК – комплементарна дезоксирибонуклеїнова кислота
ІФА – імуноферментний аналіз
МЕ – меркапто етанол
ПЛР – полімеразноланцюгова реакція
РНК – рибонуклеїнова кислота
BSA – albumin bovine fraction v (бичачий сироватковий альбумін)
CP – coat protein
EDTA– ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt
Mr- молекулярна маса
MP – movement protein (білок руху)
ORF – open reading frame
РBS – phosphate buffer solution
SDS – sodium dodecyl sulphate
10
ВСТУП
На сьогодні одними із найбільш розповсюджених патогенів є фітовіруси,
які здатні завдавати значних збитків рослинам різних таксономічних груп. Серед
цих збудників хвороб особливу небезпеку викликають віруси, які уражують
рослини родини Cucurbitaceae у різних кліматичних регіонах світу, де
інтенсивно займаються вирощуванням сільськогосподарської продукції [1]. У
регіонах світу на рослинах родини Cucurbitaceae найбільш детектуються
збудники вірусної природи, а саме: Cucumber mosaiс virus (CMV), Watermelon
mosaiс virus 2 (WMV-2) та Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) [2]. В Україні
дослідження вірусних захворювань рослин родини Cucurbitaceae проводились у
60 – 80 роки і показали наявність лише WMV-2 і CMV, переважно в
промислових агроценозах [3]. Ринковий обмін насінневим матеріалом, зміни в
популяціях комах-переносників, а також виникнення нових змішаних інфекцій
сприяють зміні патогенності вірусів. Пітвердженням цього є повідомлення про
появу високо вірулентних штамів та ізолятів вірусів, що уражують дані
культури. Вражені вірусами рослини стають сприйнятливими до факторів
навколишнього середовища, а також до збудників грибних і бактеріальних
хвороб. За останні 30-40 років спектр вірусів, що уражують представників
родини Cucurbitaceae на території України, розширився [4]. Необхідність
вивчення Cucumber mosaiс virus, Watermelon mosaiс virus 2 та Zucchini yellow
mosaic virus зумовлена тим, що ці збудники рослинних хвороб завдають значних
збитків сільському господарству України. Зважаючи на те, що держава
займається постачанням власної продукції в інші країни світу, постає важливе
завдання для науковців створення нових, екологічно безпечних методів захисту
сільськогосподарських угідь від хвороб. Найбільш дієвими заходами
протистояння вірусним хворобам є вчасна діагностика та проведення
профілактичних заходів по виділенню рослин-резерваторів інфекцій,
запровадження стійких сортів та отримання безвірусного посадкового матеріалу.
Вивчення генетичної мінливості вірусів рослин допоможе ширше зрозуміти
еволюційні зв′язки, їх вірулентність, відтворити можливі шляхи поширення та
11
спрогнозувати ймовірність виникнення нових ізолятів та патогенних штамів. Ці
дослідження безсумнівно мають як теоретичне, так і практичне значення,
оскільки з їх допомогою стає можливим створення власних сучасних
діагностикумів як от тест-систем чи використання їх для створення стійких
сортів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконувалася у межах наукового-дослідної роботи кафедри
вірусології ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за темою «Збереження біорізноманіття та
комплексне дослідження стратегій адаптації фіто-, зоо- та віробіоти України з
використанням біоінформаційних технологій» (номер держреєстрації:
0111U004649).
Мета та завдання дослідження. Мета роботи – ідентифікація та
дослідження вірусів рослин родини Cucurbitaceae на території України.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Проаналізувати вірусні хвороби рослин родини Cucurbitaceae в Україні.
2. Провести ідентифікацію та виділити вірусні ізоляти з інфікованих
рослин родини Cucurbitaceae.
3. Дослідити біологічні властивості вірусних ізолятів, виділених з рослин
родини Cucurbitaceae.
4. Отримати поліклональні кролячі антивірусні сироватки до WMV-2 та
CMV.
5. Провести ампліфікацію та сиквенування найбільш варіабельної ділянки
геномів ізолятів вірусів ZYMV, WMV-2 та CMV виділених із рослин
родини Cucurbitaceae.
6. Проаналізувати філогенетичні зв'язки отриманих ділянок геномів
ізолятів ZYMV, WMV-2 та CMV.
12
7. Провести тестування насіння рослин родини Cucurbitaceae на наявність
вірусних антигенів.
8. Дослідити антифітовірусну дію препарату Деконекс-50 ФФ, відносно
CMV.
Об‘єкт дослідження – віруси, які інфікують рослини родини
Cucurbitaceae, а саме Cucumber mosaiс virus (CMV), Watermelon mosaiс virus 2
(WMV-2) та Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV).
Предмет дослідження – молекулярно-біологічна характеристика вірусів,
що інфікують рослини родини Cucurbitaceae на території України.
Методи дослідження: Для виконання поставлених завдань застосовували
наступні методи: візуальне обстеження насаджень, біологічне тестування,
імуноферментний аналіз, електронну мікроскопію, електрофорез білків та
нуклеїнових кислот, виділення РНК, полімеразну ланцюгову реакцію,
сиквенування ділянок нуклеїнової кислоти та філогенетичний аналіз.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено молекулярну
характеристику найбільш шкодочинних вірусів, які уражують рослини родини
Cucurbitaceae на території України. Проведено філогенетичний аналіз вірусів
рослин родини Cucurbitaceae, які є актуальними для економіки України. Вперше
проведено філогенетичний аналіз кДНК гена капсидного білка українських
ізолятів WMV-2, ZYMV та CMV. Українські ізоляти WMV-2 2g і 4k, які
виявилися спорідненими з ізолятами Франції, Іспанії, Туреччини, Чилі, Ірану.
Українські ізоляти ZYMV представлені у першій підгрупі групи А та є
споріднені з ізолятами із Австрії, Словенії, Сербії, Угорщини, Словаччини та
Венесуели. Українські ізоляти CМV представлені лише у кластері групи І
підгрупи ІА і ІВ. Найбільш спорідненими до українських ізолятів виявилися
штами Т35 і Т19 з Китаю, штам I17F з Франції та banana з Ізраїлю.
13
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
досліджень можуть бути використані українськими вченими як підґрунтя для
зниження та розповсюдження вірусів, для отримання здорового посадкового
матеріалу, пошуку стійких сортів насіння, а також передбачати появу нових
штамів та ізолятів. Українські ізоляти ZYMV, WMV-2 та CМV поповнили
колекцію вірусів кафедри вірусології ННЦ «Інститут біології та медицини»
Київського національного університету імені Тараса Шевченка і застосовуються
для порівняння їх властивостей з нововиділеними ізолятами, а також як тестоб'єкти вірусів рослин у навчальному процесі. Отримано поліклональні
антисироватки до WMV-2 та CМV, що дає нам можливість створення власних
тест-систем для діагностики цих вірусів. Було встановлено антифітовірусну дію
препарату Деконекс-50 ФФ щодо CМV. Результати роботи можуть бути
впровадженні для покращення методики діагностики вірусів родини
Cucurbitaceae в Україні.
Особистий вклад здобувача. Дисертаційна робота є науковою працею, що
виконана самостійно автором, в якій висвітлено власні ідеї та розробки
здобувача, що дозволили вирішити поставлені завдання. Дисертантом
опрацьовано і узагальнено дані джерел літератури за темою дисертації, підібрано
методики, проведено польові та лабораторні дослідження, узагальнено й
систематизовано одержані результати, статистично їх проаналізовано,
сформовано висновки. Підготовка публікацій отриманих результатів роботи
здійснювалася за участю наукового керівника роботи д.б.н. проф. В.П.
Поліщука. Дослідження біологічних властивостей та імуноферментний аналіз
здійснено самостійно автором, філогенетичний аналіз проведено за участю
консультативної допомоги – д.б.н. проф. І.Г. Будзанівської.
Апробація результатів десертації. Основні результати досліджень і
положення дисертації роботи доповідались та обговорювалися на таких
конференціях: VΙΙΙ Міжнародній конференції „Молодість і поступ біології” м.
Львів, 3-6 квітня 2012р.; 16 Международной Пущинской школе-конференции
молодых учених „Биология наука XXI века”, (Пущино, 2012); конференції
14
„Вірусологія: минуле, сьогодення, майбутнє” м. Київ, 12 квітня 2012р.; IX
Міжнародній науковій конференції студентів та аспіратів „Молодість і поступ
біології” м. Львів, 16-19 квітня 2013р; конференції „Мікробіологія в сучасному
сільськогосподарському виробництві” м. Чернігів, 25-27 вересня 2012р.; VII
Міжнародній конференції „Біоресурси та віруси” м. Київ, 10-13 вересня 2013 р
Публікації. Результати досліджень представлені в 15 опублікованих
працях, із них 9 статей в профільних вітчизняних виданнях і 6 тез в матеріалах
конгресів, з'їздів і конференцій. Права співавторів не порушені.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із
вступу, 11 розділів, висновків, списку використаної літератури, який охоплює
148 найменувань. Робота викладена на 127 сторінках машинописного тексту.
Фактичний матеріал дисертаційної роботи викладений у вигляді 30 рисунках і 9
таблицях

Список литературы

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі здійснено аналіз вірусних хвороб рослин родини
Cucurbitaceae в Україні. Було виділено та ідентифіковано віруси з інфікованих
рослин родини Cucurbitaceae. Отримано поліклональну антисироватку до WMV2 та CМV. Здійснено аналіз насіння рослин родини Cucurbitaceae на вірусну
контамінацію. Проведено філогенетичний аналіз ділянок геномів CMV, ZYMV
та WMV-2 виділених на території України. Отримані результати представлені у
наступних висновках:
1. За характерними симптомами, з використанням біологічного тестування,
електронної мікроскопії та імуноферментного аналізу доведено наявність
трьох актуальних для Європи вірусів, що уражують рослин родини
Cucurbitaceae, а саме: представників вірусів роду Cucumovirus (CMV) і
роду Potyvirus (ZYMV та WMV-2) в досліджуваних областях України.
2. Українські ізоляти CMV, ZYMV та WMV-2, виділені з рослин родини
Cucurbitaceae в Україні, за своїми біологічними властивостями є
тотожними їх типовим представникам.
3. З відібраних зразків рослин родини Cucurbitaceae отримано кДНК гена
капсидного білка українських ізолятів WMV 2– 2g–Ukr і WMV 2– 4k–Ukr
розміром 825 п.о. У результаті проведеного філогенетичного аналізу та
порівняння WMV 2– 2g–Ukr і WMV 2– 4k–Ukr з відомими ізолятами і
штамами із GenBank , було встановлено, що виділені патогени споріднені з
ізолятами з Франції, Іспанії, Туречини, Чилі, Ірану.
4. Філогенетичний аналіз кДНК ділянки Nib-CP ZYMV розміром 605 п.о.
встановив, що українські ізоляти представлені у першій підгрупі групи А і
є спорідненими з ізоляти із Австрії, Словенії, Сербії, Угорщини,
Словаччини та Венесуели.
5. Українські ізоляти CMV з рослин родини Cucurbitaceae представлені лише
у кластері групи І підгрупи ІА і ІВ. Найбільш спорідненими до українських
112
ізолятів виявилися: штами Т35 і Т19 з Китаю, штам I17F з Франції та
banana з Ізраїлю.
6. Результати аналізу насіннєвого матеріалу рослин родини Cucurbitaceae за
допомогою ІФА показали, що 34% серед асортименту перевіреного
насіння рослин родини Cucurbitaceae виявилося контамінованим вірусами.
Спостерігалася наявність антигенів CMV та ZYMV.
7. Дослідження "Деконексу-50ФФ " показало, що обробка насіння
препаратом у концентраціях 0,5% та 1% зумовлювала зниження вмісту
вірусних антигенів CMV на 26 та 51% відповідно. Отже, досліджений
препарат може бути рекомендований для знезараження контамінованого
насіння огірків CMV та для профілактичної обробки насіння інших
овочевих культур.