Влияние искусственных наночастиц минеральных веществ на токсическое действие приоритетных химических контаминантов пищевых продуктов в эксперименте Шумакова Антонина Александровна

Краткое описание

Шумакова Антонина Александровна. Влияние искусственных наночастиц минеральных веществ на токсическое действие приоритетных химических контаминантов пищевых продуктов в эксперименте: диссертация ... кандидата Биологических наук: 14.02.01 / Шумакова Антонина Александровна;[Место защиты: ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2019.- 162 с.
Влияние искусственных наночастиц минеральных веществ на токсическое действие приоритетных химических контаминантов пищевых продуктов в эксперименте Шумакова Антонина Александровна
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
кандидат наук Шумакова Антонина Александровна
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Научная новизна работы

Практическая значимость

Апробация работы

Личный вклад соискателя

Объём и структура диссертации

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Токсикологическая характеристика свинца и кадмия

1.2 Токсичность наночастиц диоксида кремния, диоксида титана, оксида алюминия и фуллеренола в системах in vitro и in vivo

1.3 Влияние наночастиц и наноматериалов на действие веществ традиционной степени дисперсности

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Животные, состав экспериментальных рационов

2.2 Характеристика используемых материалов и реактивов

2.2.1 Наночастицы и наноматериалы

2.2.2 Токсиканты традиционной степени дисперсности

2.2.3 Прочие материалы и реактивы

2.3 Список использованного оборудования

2.4 Схемы экспериментальных моделей, использованные в биологических экспериментах

2.4.1 Эксперимент по изучению совместного поступления свинца и наночастиц диоксида титана

2.4.2 Эксперимент по изучению совместного поступления свинца и наночастиц диоксида кремния (220 м2/г)

2.4.3 Эксперимент по изучению совместного поступления свинца и наночастиц диоксида кремния (300 м2/г)

2.4.4 Эксперимент по изучению совместного поступления свинца и наночастиц оксида алюминия

2.4.5 Эксперимент по изучению совместного поступления кадмия и наноматериалов (наночастицы диоксида титана, диоксида кремния (300 м2/г) и фуллеренол)

2.5 Методы отбора субстратов и пробоподготовки биологических образцов

2.6 Аналитические методы исследований

2.6.1 Спектрометрические методы

2.6.2 Динамическое рассеяние света

2.6.3 Атомно-абсорбционная спектрометрия

2.6.4 Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой

2.7 Определение термодинамических параметров адсорбции ионов свинца и кадмия на наночастицах диоксида кремния (300 м2/г), диоксида титана и оксида алюминия

2.8 Методы статистической обработки экспериментальных данных

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Характеристика исследуемых наноматериалов методом динамического рассеяния света

3.1.1 Наночастицы диоксида титана

3.1.2 Наночастицы диоксида титана (220 м2/г)

3.1.3 Наночастицы диоксида титана (300 м2/г)

3.1.4 Наночастицы оксида алюминия

3.1.5 Фуллеренол

3.2 Изучение совместного поступления свинца и наночастиц диоксида титана в

эксперименте

3.2.1 Масса тела и внутренних органов

3.2.2 Содержание гемоглобина в крови

3.2.3 Содержание свинца во внутренних органах

3.3 Изучение совместного поступления свинца и наночастиц диоксида кремния (220 м2/г)

3.3.1 Масса тела и внутренних органов

3.3.2 Содержание гемоглобина в крови

3.3.3 Экскреция 5-аминолевуленовой кислоты в моче

3.3.4 Содержание свинца во внутренних органах

3.4 Изучение совместного поступления свинца и наночастиц диоксида кремния (300 м2/г)

3.4.1 Масса тела и внутренних органов

3.4.2 Содержание гемоглобина в крови

3.4.3 Экскреция 5-аминолевуленовой кислоты и порфобилиногена с мочой

3.4.4 Содержание свинца и ряда других элементов во внутренних органах

3.5 Изучение совместного поступления свинца и наночастиц оксида алюминия

3.5.1 Масса тела и внутренних органов

3.5.2 Содержание гемоглобина в крови

3.5.3 Экскреция 5-аминолевуленовой кислоты и порфобилиногена с мочой

3.5.4 Содержание свинца во внутренних органах

3.6 Изучение совместного поступления кадмия и наноматериалов (наночастицы

диоксида титана, диоксида кремния (300 м2/г) и фуллеренол)

3.6.1 Масса тела и внутренних органов

3.6.2 Влияние наноматериалов на содержание кадмия и других элементов во внутренних органах

3.7 Определение термодинамических параметров адсорбции ионов свинца и кадмия на наночастицах диоксида кремния (300 м2/г), диоксида титана и оксида алюминия

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5 ВЫВОДЫ

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список литературы

Токсичность наночастиц диоксида кремния, диоксида титана, оксида алюминия и фуллеренола в системах in vitro и in vivo
Наночастицы диоксида кремния
С каждым годом в мире растет оборот продукции, содержащей НМ, в частности НЧ SiO2, которые применяются в упаковке пищевых продуктов [9], производстве пищевых добавок [240], фармацевтических и медико-диагностических препаратов [183]. В связи с этим оценка их возможного токсического действия, а также оценка риска от применения содержащей их потребительской продукции представляет огромный интерес.
По данным авторов работы [109] НЧ SiO2 вызывают окислительный стресс в клетках бронхиального эпителия человека линии Beas-2B, поскольку в их присутствии отмечается значительное увеличение уровня реакционноспособных соединений кислорода (РСК), а также индуция гемоксигиназы-1 посредством сигнального пути белка Nrf-2-ERK - MAP киназы. То, что в основе негативных эффектов НЧ SiO2 может лежать каталитическая генерация РСК, подтверждается данными экспериментов в бесклеточной системе [258], в культуре кератиноцитов [192] и альвеолярных эпителиоцитов человека [109].
По результатам исследования [296], проведенного на зародышевых клетках почек человека линии HEK293, для НЧ аморфного SiO2 не отмечается выраженных проявлений генотоксических эффектов, вовлеченных в процессы канцерогенеза. Тем не менее, при концентрации этих наночастиц на уровне 120 мг/см3 наблюдали изменение уровней экспрессии отдельных генов.
Цитотоксические эффекты НЧ SiO2 для клеток линии EAHY926 были выявлены в исследовании [194]. При этом частицы субмикронного размера (100-330 нм) не были токсичны. В культуре стволовых клеток эмбриона мыши НЧ аморфного SiO2 диаметром 10 и 30 нм (но не 80 нм) подавляли дифференцировку этих клеток в нормальные кардиомиоциты [209]. В культуре эпителиоцитов бронхов Beas-2B НЧ силики активно захватывались клетками, проникали в ядро и вызывали повреждение ДНК по данным комет-теста (щелочного электрофореза) [273]. Эти эффекты в значительной мере зависели от размера частиц и практически уже не проявлялись у частиц микронного размера.
Апоптоз и изменения в экспрессии его регуляторов р53 и Вах/Bcl-2 под действием НЧ SiO2 размером 21 нм были выявлены в нормальных клетках печени линии L-02 [288]. На наличие у НЧ SiO2 цитотоксических свойств указывают также данные работ [110; 283; 287].
Таким образом, данные ряда исследований in vitro на моделях клеточных культур показали наличие у НЧ аморфного SiO2 цитотоксического действия. Его механизм, скорее всего, является неспецифическим в том отношении, что он не связан с действием кремния как химического элемента на те или иные биохимические механизмы клетки, а обусловлен, скорее всего, процессами каталитической генерации РСК на межфазной границе SiO2 -вода. Известные противоречия в оценке этого эффекта в разных работах в отношении его связи с размером, формой, способом получения НЧ могут быть связаны с пробелами в физико-химической характеристике исследуемых НМ. В частности, не во всех работах было соблюдено такое обязательное требование к НМ, применяемым в in vitro тестах, как отсутствие контаминации бактериальным эндотоксином (липополисахаридом) [111].
Обсуждая возможные механизмы воздействия НЧ SiO2 на клетки иммунной системы in vivo, следует упомянуть, что в литературе имеются свидетельства неблагоприятного воздействия этого НМ на иммунологические и гематологические показатели. В их числе -усиление продукции провоспалительных цитокинов [150], агрегация тромбоцитов [88], гемолиз [169]. При введении НЧ SiO2 крысам внутрибрюшинно отмечены сдвиги в функции перитонеальных макрофагов, экспрессии генов IL-1,6, TNF-, синтазы оксида азота, циклооксигеназы-2, а также повышение продукции IL-1, TNF-, NO, [208].
Авторы исследования [293] изучали острую токсичность НЧ SiO2, вводимых внутривенно мышам в дозах 29,5, 103,5 и 177,5 мг/кг массы тела. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индукционно-связанной плазмой (ИСП-АЭС) определяли содержание кремния в печени, селезенке и легких. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) показала наличие небольшого количества НЧ в гепатоцитах печени и в капиллярных эндотелиальных клетках легких и почек. При гистологических исследованиях была выявлена лимфоцитарная инфильтрация, образование гранулемы, дегенерация гепатоцитов печени, гиперплазия мегакариоцитов в селезенке, пневмония и утолщение стенок легких во всех опытных группах. Результаты данного исследования подтверждают способность НЧ SiO2 вызывать повреждения печени, селезенки и легких.
Авторы работы [197] обращают внимание на обнаруженный гепатотоксический эффект НЧ SiO2 с размером частиц 70 нм, вводимых внутривенно дважды в неделю на протяжении 4 недель в дозе 10 мг/кг массы тела. При этом отмечалось также достоверное повышение уровней сывороточных маркеров повреждения печени, таких, как аминотрансферазы, и противовоспалительных цитокинов сыворотки. Использованные в данной работе микрочастицы SiO2 с диаметром 300 и 1000 нм не показали каких-либо воздействий даже при дозе 100 мг/кг массы тела.
Ингаляционная токсичность in vivo НЧ SiO2 была подтверждена результатами работ [170; 208; 209; 225; 234]. Так, в работе [225] ингаляция НЧ SiO2 мышам вызывала у них легочный нейтрофилез, сопровождаемый повышенной экспрессией TNF- и нейтрофил-привлекающего хемокина CXCL1 в легочной ткани.
В работе [162] изучали токсичность трех видов НЧ SiO2 с различным отношением максимального поперечного размера к минимальному (aspect ratios): 1, 1,75 и 5 после внутрижелудочного введения. По мере увеличения aspect ratios наблюдалось снижение биодеградации, абсорбции и экскреции НЧ, а также снижение их накопления в печени и выведения с мочой.
Подострая (в 84-х дневном эксперименте) токсичность двух видов НЧ SiO2 при пероральном введении крысам в очень высоких дозах (100-2500 мг/кг массы тела ежедневно) была оценена в исследовании [246]. При этом отмечали дозозависимое усиление фиброза в печени и экспрессию генов, ответственных за этот процесс. Пороговая токсическая доза (LOAEL) НЧ SiO2 при подострой пероральной экспозиции составила по этим показателям 2500 мг/кг массы тела. Отсутствие наблюдаемых эффектов при меньших дозах вводимого НМ может быть связано с ограниченным числом и недостаточной чувствительностью изученных в данной работе биомаркеров, что отмечется самими авторами статьи.
В ряде других публикаций при изучении воздействия НЧ SiO2 в краткосрочных экспериментах были выявлены такие эффекты, как незначительное увеличение числа микроядерных клеток в толстой кишке крыс (при дозе 5 мг/кг массы тела в день), гепатотоксичность, тромбоцитопения [61; 131; 153; 255].
Предметом исследований значительного числа работ в системах in vitro и in vivo являются отдалённые неблагоприятные эффекты действия НЧ SiO2 на биологические объекты, в частности, генотоксичность, иммунотоксичность и аллегенность. В работе [130] сравнивали цитотоксичность и генотоксичность пяти образцов НЧ SiO2 промышленного производства на клетках фибропластов хомячков (V79), которые обрабатывали суспензиями частиц, разведенными бычим сыровоточным альбумином. Показано, что пирогенный и осажденный образцы НЧ SiO2 с размерами частиц 20 нм, и коллоидный образец с размером частиц 15 нм достоверно снижали клеточную активность через 24 часа экспозиции, в то время как для пирогенного образца с размером частиц 20/75 нм и коллоидного образца с размером частиц 40/80 этот эффект был пренебрежимо малым. Ни один из представленных образцов не показал образование микроядер или геномных мутаций в клетках. Интересно отметить, что пирогенные, осажденные и коллоидные образцы НЧ SiO2 с размером частиц около 20 нм показали большую цито- и генотоксичность в клетках V79, в отличие от аналогичных образцов с размером частиц около 50 нм, несмотря на то, что процесс производства был идентичным.
Как сообщают авторы работы [256], наблюдаемые генотоксические эффекты коллоидных НЧ SiO2 размером 15 и 55 нм на эпителий кишечника могут быть опосредованы окислительным стрессом, а не непосредственным взаимодействием с ДНК. Это может свидетельствовать о потенциальных неблагоприятных эффектах в отношении эпителия кишечника в естественных условиях.
В исследовании [104] высказано предположение о том, что НЧ SiO2 инициируют вторичные генотоксические эффекты посредством привлечения клеток воспаления подобно тому, как это описано для кристаллического диоксида кремния (кварц). В своей работе авторы не выявили каких-либо генотоксических эффектов на низких дозах НЧ SiO2, в то время как на высоких в системе in vitro на эпителиальных клетках человека HT-29 наблюдалось [237] увеличение в степени повреждения ДНК и образование микроядерных ретикулоцитов.
Атомно-абсорбционная спектрометрия
Метод ИСП-МС комбинирует использование индуктивно связанной плазмы в качестве источника ионов с квадрупольным масс-спектрометром, выступающем в роли масс-анализатора (фильтра) и дискретно-динодным детектором, который используется для регистрации отдельных ионов и их потоков. Индуктивно связанная плазма, поддерживаемая в специальной горелке, способна эффективно возбуждать однозарядные ионы из атомов вводимого образца. Далее ионы фокусируются ионно-оптической системой и попадают в анализатор масс-спектрометра, где разделяются по отношению массы к заряду (m/z). Ионный поток регистрируется детектором. Через масс-спектрометр в каждый момент времени пропускаются ионы со строго определенным m/z, которые затем попадают в детектор для количественной регистрации. Число соударений за единицу времени пропорционально количеству атомов каждого определяемого изотопа в исходном образце.
В работе использовали масс-спектрометр с индуктивно-связанной плазмой ICP-MS серии 7700x, снабженный расположенной перед квадруполем масс-анализатора октопольной реакционной системой (Octopole Reaction System, ORS), которая позволяет избегать возникновения в ходе ионизации интерферирующих полиатомных ионов путем их избирательного разрушения в результате столкновений с нейтральными атомами реакционного газа (гелия). Помимо удаления мешающих анализу полиатомных ионов, ORS обеспечивает динамическое выделение узкого диапазона пропускания определяемых ионов и препятствует продвижению паразитных продуктов реакций к квадруполю масс-анализатора. В результате, ORS осуществляет эффективную фильтрацию полиатомных ионов, уменьшает общий фон и увеличивает стабильность сигнала.
Для минерализации проб биологических образцов применяли метод микроволнового разложения (кислотного разложения, «мокрого» озоления), который обеспечивает по сравнению с описанным выше методом сухого озоления следующие преимущества: высокую производительность, полное окисление органической матрицы практически любых биосубстратов в результате проведения реакции в жидкой фазе при высокой температуре (180-200оС) под давлением (40-50 бар) и существенное уменьшение потерь летучих элементов при разложении (ввиду проведения реакции в закрытом объёме).
Использовали микроволновую систему минерализации проб «TOP WAVE» и сосуды высокого давления PM40, изготовленные из тефлона (TFM), производства фирмы «Analytik Jena AG», Германия.
После механического измельчения образцов органов в блендере, полученные гомогенаты тщательно перемешивали, отбирали навеску примерно по 500 мг и помещали в сосуд высокого давления. Добавляли 5 см3 концентрированной HNO3 (квалификации о.с.ч или перегнанной в системе перегонки кислот), закрывали блокирующими крышками и оставляли на ночь под тягой. На следующие сутки добавляли 1 см3 концентрированной перекиси водорода (х.ч.), плотно закрывали сосуды блокирующими крышками, энергично встряхивали закрытые сосуды и производили минерализацию при параметрах, указанных в Таблице 9.
После проведения разложения сосуды встряхивали для перемешивания содержимого и приоткрывали блокирующую крышку для уравновешивания давления. Пробы после отхождения окислов азота представляли собой бесцветные или желтоватые прозрачные растворы, без нерастворившихся частиц на дне и на стенках. Растворенную пробу количественно переносили в мерную полиэтиленовую пробирку, доводили до объема 50 см3 раствором 2% HNO3, закрывали и перемешивали.
Приготовление рабочих растворов:
В качестве калибровочного раствора использовали тюновый раствор «Tuning solution Li, Y, Ce, Tl and Co, 10 g/L», матрицу (фоновый раствор) 2% HNO3, производства фирмы «Agilent Technologies», США, а для построения градуировочных графиков элементов мультиэлементный стандартный раствор Ag, Al, As, Ba, Be, Ca, Cd, Co, Cr, Cs, Cu, Fe, Ga, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, Pb, Rb, Se, Sr, Tl, U, V, Zn, с концентрацией каждого элемента 10 мг/дм3 и матрицу (фоновый раствор) 5% HNO3, производства фирмы «Agilent Technologies», США.
Готовили 7 стандартных растворов сравнения с концентрацией элементов 0,1 мкг/см3, 1 мкг/см3, 10 мкг/см3, 25 мкг/см3, 100 мкг/см3, 500 мкг/см3 и 1000 мкг/см3 путем разбавления основного мультиэлементного раствора в 1% HNO3. Бланк представлял собой раствор 1% HNO3. Градуировочные графики считали пригодными для использования при коэффициенте корреляции R0,996.
Подготовка масс-спектрометра к работе и условия измерения
Квадрупольный масс-спектрометр с индуктивно связанной плазмой ICP-MS готовили к работе в соответствии с руководством пользователя (инструкцией по эксплуатации). Необходимые режимы работы устанавливали в соответствии с рекомендациями производителя. Условия анализа и рабочие параметры прибора были следующими:
- скорость потока плазменного газа (аргона) 16,0 дм3/мин;
- скорость потока вспомогательного газа (гелия) 0,04 дм3/мин;
- скорость потока газа-носителя 1,07 дм3/мин;
- распылитель - тип Micromist;
- 2-проходная кварцевая распылительная камера - температура распыления 2оС;
- система ввода образца, скорость перистальтического насоса 0,5 см3/мин;
- количество точек на ед. массы- 3. Первичную обработку сигналов и расчет концентраций проводили с помощью программного обеспечения автоматически, на основании параметров используемого метода и данных проведенной градуировки.
Аналитические сигналы обрабатывали программным обеспечением масс-спектрометра с помощью градуировочных графиков, построенных методом наименьших квадратов по модели линейной регрессии с учетом коррекции фона и сигнала от внутренних стандартных образцов. Результат определения представляли как среднее из нескольких (не менее двух) параллельных измерений анализируемого образца. Обработку результатов измерений проводили в соответствии с ГОСТ Р 8.736-2011 «Государственная система обеспечения единства измерений. Измерения прямые многократные. Методы обработки результатов измерений. Основные положения». Результаты измерений распечатывали и сохраняли в виде файла на электронном носителе.
Расчёт концентрации элемента в образце проводили по формуле:
Х= [(СVK] /M, где Х- искомое содержание элемента в биопробе, мкг/г;
C- концентрация элемента, определённая по калибровочному графику, мкг/дм3, скорректированная на величину сигнала контрольной пробы (бланка), не содержащей образца; V - объем пробы после минерализации, см3; K коэффициент разведения пробы; M - навеска пробы, г.