Особенности заготовки и криоконсервирования тромбоцитов для клинического применения Высочин Игорь Валерьевич

Краткое описание

Высочин Игорь Валерьевич. «Особенности заготовки и криоконсервирования тромбоцитов для клинического применения»: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.01.21 / Высочин Игорь Валерьевич;[Место защиты: ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2019
Особенности заготовки и криоконсервирования тромбоцитов для клинического применения Высочин Игорь Валерьевич
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
кандидат наук Высочин Игорь Валерьевич
Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель и задачи исследования

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробации результатов

Публикации

Объем и структура диссертации

Основная часть

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Современные способы криоконсервирования тромбоцитов

1.2 Токсическое действие диметилсульфоксида при внутривенном

введении

1.3 Методы контроля качества криоконсервированных тромбоцитов

1.4 Клиническое применение тромбоцитных компонентов

1.5 Иммунологическая совместимость донорских тромбоцитов с

реципиентами

Глава 2 Материалы и методы исследования

2.1 Объем и дизайн исследования качества тромбоцитных концентратов и криоконсервированных тромбоцитов, а также их клинической эффективности

2.2 Заготовка и хранение тромбоцитных концентратов

2.3 Морфофункциональный анализ тромбоцитов

2.4 Определение рН и осмолярности в тромбоцитных концентратах и криоконсервированных тромбоцитах

2.5 Цитометрия тромбоцитов

2.6 Методы криоконсервирования тромбоцитов

2.7 Определение концентрации диметилсульфоксида в

криоконсервированных тромбоцитах

2.8 Определение иммунологической совместимости тромбоцитных концентратах и криоконсервированных тромбоцитах с реципиентами

2.9 Оценка эффективности трансфузии тромбоцитных концентратов и криоконсервированных тромбоцитов

2.10 Статистический анализ

Глава 3. Морфофункциональный анализ тромбоцитов в крови доноров и в тромбоцитных концентратах, используемых в клинической практике

3.1 Концентрация и активность тромбоцитов в крови доноров и в тромбоцитных концентратах

3.2 Оценка качества тромбоцитов доноров с учетом гендерных

различий

3.3 Анализ качества тромбоцитов в процессе хранения тромбоцитных

концентратах

Глава 4. Разработка способа криоконсервирования тромбоцитов с учетом морфофункциональных характеристик клеток

4.1 Оценка эффективности существующих способов криоконсервирования тромбоцитов

4.2 Влияние различных концентраций диметилсульфоксида и времени экспозиции на качество тромбоцитов

4.3 Обоснование к совершенствованию метода криоконсервирования тромбоцитов

4.4 Влияние качества исходных тромбоцитных концентратов на сохранность тромбоцитов после криоконсервирования

4.5 Оценка рН и осмолярности в исходных тромбоцитных концентратах и в криоконсервированных тромбоцитах после размораживания

4.6 Разработка устройств для криоконсервирования тромбоцитов

4.7 Разработка устройства для подготовки криоконсервированных тромбоцитов к трансфузии

4.8 Принципы автоматизации производства криоконсервированных тромбоцитов

4.9 Принцип разработанного метода криоконсервирования

тромбоцитов

4.10 Объем производства и потребность ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ» в тромбоцитных концентратах и

криоконсервированных тромбоцитах

Глава 5. Оценка клинической эффективности и безопасности применения

криоконсервированных тромбоцитов у больных с хирургической

патологией

5.1 Оценка качества тромбоцитов у больных до трансфузии тромбоцитных концентратов

5.2 Примеры клинического использования тромбоцитных концентратов

5.3 Оценка клинической эффективности криоконсервированных тромбоцитов

5.4 Карантинизация криоконсервированных тромбоцитов для обеспечения инфекционной безопасности гемокомпонентной терапии

5.5 Клиническое применение криоконсервированных тромбоцитов в лечебно-профилактических учреждениях Владимирской и Тюменской

области

5.6 Влияние индивидуальной совместимости тромбоцитных концентратов и криоконсервированных тромбоцитов с реципиентами на их клиническую

эффективность

Глава 6. Обсуждение

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Список сокращений и условных обозначений

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложения

Список литературы

Современные способы криоконсервирования тромбоцитов
В настоящее время ТК эффективно используют для лечения и профилактики геморрагических осложнений, обусловленных тромбоцитопенией или тромбоцитопатией [1, 18, 21, 77, 154]. Начиная с середины XX века, трансфузии ТК позволили обеспечить коррекцию тромбоцитопенических геморрагий, которые приводили к 60-70% летальности больных с гемобластозами [93, 98]. В начале ХХI века отмечается бурный рост числа трансфузий ТК, что увеличило нагрузку на банки крови во всем мире [2, 48, 74]. Интенсивные трансфузии ТК позволили значительно снизить летальность у больных с тромбоцитопеническим ГС, который развивался на фоне гемобластозов, апластической анемии, злокачественных новообразований, лучевой болезни и т. д. Трансфузии ТК способствовали разработке высокотехнологичных лечебных программ в гематологии, онкологии, трансплантологии, что позволило проводить интенсивную высокодозную полихимиотерапию и оперативные вмешательства в сердечнососудистой хирургии, ортопедии, травматологии и т. д. [18, 71, 72, 147, 170].
Однако следует учитывать, что трансфузии ТК могут сопровождаться: аллоиммунизацией и рефрактерностью больных к трансфузиям ТК, передачей опасных гемотрансмиссивных инфекций (вирусных гепатитов, ВИЧ и др.) [40, 59, 153, 162]. Для решения этих проблем могли бы быть использованы технологии КК и долгосрочного хранения тромбоцитов. Эти технологии дали бы возможность дополнительно обследовать донора на наличие возбудителей инфекционных заболеваний, исключить возможность бактериальной контаминации при хранении, создавать банки аутологичных ТК или HLA- и HPA-типированных аллогенных донорских ТК, транспортировать ТК длительное время на большие расстояния и т. д. [71, 147, 154]. Наличие банка с КТК может значительно облегчить обеспечение больных достаточным количеством ТК. Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что основной проблемой КК тромбоцитов является выбор КП, защищающего клетки от разрушения в процессе КК. Установлено, что гибель клетки при замораживании происходит в результате потерь клеточной воды или из-за образования внутриклеточного льда [122, 123, 158]. Согласно теории Н. Meryman, при медленном замораживании и формировании льда во внеклеточном пространстве происходит концентрирование внеклеточных растворов и увеличение их осмотического давления. В результате возникшего осмотического градиента вода покидает клетку. Обезвоживание клетки и уменьшение ее объема приводят к повреждению мембраны. Наоборот, при быстром замораживании формируется внутриклеточный лед, разрушающий структуру клетки. Добавление КП к суспензии клеток увеличивает концентрацию растворимых веществ, что приводит к снижению точки замерзания и уменьшает количества льда, который образуется при субзамораживаюших температурах [122]. Для того чтобы эффективно защищать клетки при замораживании КП должны быть нетоксичными для клеток и легко проникали в них. Большие концентрации КП способны значительно уменьшить количество образуемого льда и повреждение клеток дегидратацией. Однако известно, что тромбоциты, имеют низкую резистентность к неизотоническим условиям. В отличие от эритроцитов, которые выдерживают осмоляльность 1500 мОсмоль и более, тромбоциты начинают терять свои функциональные свойства уже при 800 мОсмоль [122, 123]. Введение и удаление КП обуславливает транзиторный гипер- и гипотонический эффект. Замораживание и размораживания приводит к существенным осмотическим перегрузкам в клетках. В связи с этим становится понятно, что тромбоциты КК труднее, чем другие клетки с более высокой осмотической резистентностью.
Исследования по созданию технологий КК тромбоцитов для клинической практики, за последние 50 лет, оказались не такими успешными, как в случае с другими клетками и тканями. В связи с низкой лечебной эффективностью (30 40% от соответствующего показателя для свежезаготовленных ТК) КТК пока широко не применяют в лечебной практике [1, 71, 72, 147]. Анализ зарубежной литературы показал, что наиболее эффективным КП для КК и хранения КТК как при ультранизких, так и при умеренно низких температурах является ДМСО в конечной концентрации 4 — 6% [2, 69, 157, 170]. В качестве КП испытаны разные соединения проникающие внутрь клетки (эндоцеллюлярные): диметилацетамид (ДМАЦ) [1, 2], глицерин [27, 69, 157], 1,2-пропандиол (1,2-ПД) [18, 20, 27, 64] и не проникающие (экзоцеллюлярные - декстран, гидроксиэтилированный крахмал [157] и т.д.).
Вещество ДМСО обладает уникальными фармакологическими свойствами. Благодаря этому ДМСО нашел широкое применение в клинической практике для лечения ряда патологических состояний [113]. В основном, методы КК тромбоцитов с ДМСО согласуются между собой и указывают, что количественные потери клеток после размораживания составляют от 5 до 30% [25, 84, 170]. Результаты исследования качества КТК различными тестами показали, что ФАТ сохраняется на уровне 30—70% [2, 18, 20, 25, 42, 53, 57, 60, 61]. Клинические исследования КТК, меченных радиофармпрепаратом показали, что размороженные тромбоциты оказывают гемостатический эффект и рециркулируют в кровяном русле реципиента [53, 73, 149, 150, 151]. Некоторыми исследователями ДМСО признан наиболее эффективным КП для КК тромбоцитов [60, 118, 143]. Однако при КК большая часть тромбоцитов не жизнеспособна. Это показано в исследованиях in vitro, которые выявили: сниженную резистентность к гипотоническому стрессу после КК, низкую агрегационную активность на действие агонистов, ослабленную способность к поглощению серотонина и др. [71, 87, 128]. G.W. van Imhoff и соавт. было выявлено, что низкая агрегационная активность тромбоцитов, КК с ДМСО, является следствием дефицита в тромбоцитах содержимого плотных телец и альфа-гранул [71]. Также, тромбоциты после размораживания имели сниженную способность к секреции содержимого этих гранул. Определено 50%-ное падение количества цитозольной АТФ при незначительном уменьшении концентрации АДФ; а содержание связанных с гранулами АТФ и АДФ снижалось на 21 и 17 %, соответственно [71]. Т.к. морфологические исследования КТК показали, что около 40% клеток теряют форму диска, авторы предположили, что страдает не вся популяция тромбоцитов, а лишь ее часть. Подобные изменения выявлены в ТК, которые хранили при комнатной температуре; через 72 ч хранения содержание АТФ и АДФ уменьшилось на 27% и 34%, соответственно, в результате выходы содержимого плотных гранул [139].
Большое число исследований посвящено изучению криопротективных свойств глицерина при замораживании тромбоцитов. Глицерин имеет преимущество перед ДМСО, т.к. длительный опыт его применения для криоконсервирования эритроцитов показал безвредность для реципиентов. Исследования P. Cohen и F. Gardner [82] продемонстрировали, что медленное замораживание тромбоцитов с 12% глицерином привело к значительным клеточным потерям и создало сложности при удалении глицерина из клеточной суспензии после размораживания тромбоцитов. С. Dayian и соавт. [90, 91] определили, что глицерин оказывает повреждающее действие на лизосомы тромбоцитов, которое усиливается при замораживании. Эти авторы установили, что глицерин, относительно медленно проникает внутрь тромбоцитов и уменьшает клетки в объёме [89]. Осмотический стресс, возникающий в момент контакта КП с клетками после размораживания, наиболее выражен при использовании его высоких концентраций, и обусловлен различиями в скорости прохождения воды внутрь тромбоцитов и выхода глицерина из тромбоцитов. Armitage W. и соавт показал, что кинетика проникновения 5-гидрокситриптамина не нарушалась при инкубации тромбоцитов с 0,5 М глицерина [62]. Концентрации глицерина более высокие оказывали влияние на транспорт 5-гидрокситриптамина зависящее от времени. G. Dayian и A. Rowe [92], впервые разработали метод КК тромбоцитов с глицерином в конечной концентрации 5% для клинического применения. Замораживали ТК со скоростью не более 300С/мин до температуры минус 800С, затем хранили в жидком азоте. Оценка метода in vitro показала, что сохранность тромбоцитов после размораживания составила не более 70%. При этом по тестам поглощения серотонина и АДФ индуцированной агрегации показатели качества тромбоцитов были близки к норме. Однако при повторном применении этого метода КК результаты значимо отличались. Так, Korbling M. и coавт. получили 70% сохранность клеток [73]. Velden K. и соавт. при сравнении методов КК тромбоцитов с ДМСО и глицерином обнаружили, что сохранность тромбоцитов по реакции на гипотонический стресс была близка к нулю [150]. Вероятно, нестабильность результатов, получаемых при использовании глицерина, является медленная диффузия через мембрану тромбоцитов, в связи с чем осмотический градиент, развивающийся во время введения и удаления КП, может быть более высоким и длительным. Armitage W. G. [63] представил данные о том, что тромбоциты толерантны к изменениям объема клетки в пределах от 30% до 40% от их физиологической величины. Группой исследователей [65, 69] при разработке методов КК тромбоцитов с применением КП глицерина и 1,2-пропандиола (1,2-ПД) была установлена эффективная концентрация глицерина (1,4 М), поддерживающая при замораживании концентрацию натрия хлорид, не превышающую предельных для неё значений. Отработаны способы введения и отмывания глицерина, обеспечивающие поддержание физиологического объема клеток в пределах величин, к которым они толерантны. В результате исследований была разработана методика замораживания тромбоцитов с КП, содержащим 1,4 М глицерина, обеспечивающая удовлетворительную сохранность клеток по количественным и качественным параметрам после КК. Так, реакция на гипотонический стресс тромбоцитов сохранилась в среднем почти на 50% и была в 3,5 раза выше, чем при замораживании тромбоцитов с 0,5 М глицерина. Однако при воспроизведении методики для рутинного КК лечебных доз ТК в банках крови могут возникнуть трудности, связанные со сложностью многоэтапной методики добавления КП в ТК и его удаления после оттаивания.
Объем и дизайн исследования качества тромбоцитных концентратов и криоконсервированных тромбоцитов, а также их клинической эффективности
Диссертационная работа состояла из трех этапов исследования:
1-й этап морфофункциональный анализ тромбоцитов, используемых в клинической практике;
2-й этап разработка оригинальной методики КК тромбоцитов;
3-й этап оценка клинической эффективности КТК.
Объекты исследования включали: кровь доноров, кровь больных с изменениями в системе клеточного гемостаза, ТК и КТК.
На 1-м этапе исследовали тромбоциты в крови и в ТК, полученных методом афереза. Исследованы тромбоциты крови 1000 доноров; 800 лечебных доз ТК. Кровь доноров набирали в пробирки с цитратом натрия в соотношении 9:1. ТК получали методом афереза на сепараторе крови Trima Accel в отделении клинической, производственной трансфузиологии и гравитационной хирургии крови ГБУЗ «НИИ СП им.Н.В.Склифосовского ДЗМ» (зав. отделением, к.м.н. Костин А.И.). Дизайн и объем исследования представлен на рисунке 1.
На 2-м этапе анализировали качество тромбоцитов в 735 лечебных дозах ТК на разных стадиях КК. На первом этапе оценили эффективность известных способов КК тромбоцитов (45 исследований), влияние разных доз ДМСО на качество тромбоцитов (90 исследований). Затем разработали оригинальный способ и устройства для КК тромбоцитов (100 исследований), исследовали морфофункциональные свойства тромбоцитов в ТК после КК (200 исследований), оценили влияние исходного качества тромбоцитов в ТК на эффективность КК тромбцоитов (300 исследований).
На 3-м этапе исследовали клиническую эффективность 90 доз ТК, полученных методом афереза, и 230 доз КТК, заготовленных по разработанной методике. Кроме того, провели сравнительный анализ качества тромбоцитов в крови 143 пацентов, которым переливали КТК (основная группы) и ТК (контрольная группы) для коррекции клеточного гемостаза при различных патологических состояниях: 13 пациентов с множественной и сочетанной травмой; 60 кардиохирургических больных после операции протезирования клапанов сердца и восходящего отдела аорты с использованием АИК; 10 больных после трансплантации легких с экстракорпоральной мембранной оксигенацией (ЭКМО); 10 больных с ХПН после трансплантации печени на 1-7 сутки после трансплантации; 50 больных с нейрохирургической патологией. Показания к трансфузии включали тромбоцитопению потребления, а также клинически выраженный ГС или массивная кровопотеря от 1000 до 5000 мл (II-IV степени по шкале ВОЗ). Характеристика больных представлена в таблице 1 и 2.
У всех пациентов определяли количество и качество тромбоцитов в крови до трансфузии, через 1 час и через 24 часа после окончания трансфузий, рассчитывали СПТ через 1 час и через 24 часа после окончания трансфузий. Кроме того, у 132 пацинетов проводили тест на иммунологическую совместимость с ТК и КТК.