МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНА ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ МІКОБАКТЕРІЙ, ВИДІЛЕНИХ В УКРАЇНІ, ТА ЇХ ФІЛОГЕНЕТИЧНІ ВЗАЄМОЗВ’ЯЗКИ

Краткое описание

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР
«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ
ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

На правах рукопису

СКРИПНИК АРТЕМ ВАЛЕРІЙОВИЧ

УДК 619:579:575.8:577.2

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНА ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ
МІКОБАКТЕРІЙ, ВИДІЛЕНИХ В УКРАЇНІ,
ТА ЇХ ФІЛОГЕНЕТИЧНІ ВЗАЄМОЗВ’ЯЗКИ

16.00.03 ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Д И С Е Р Т А Ц І Я
на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Науковий керівник:
доктор ветеринарних наук, професор,
член-кореспондент УААН
Стегній Б.Т.

Харків 2007

ЗМІСТ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

5

ВСТУП

7

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

15

1.1

Історична довідка

15

1.2

Загальна характеристика мікобактерій

16

1.3

Класифікація, таксономія та етіологічна роль мікобактерій

18

1.3.1

Mycobacterіum tuberculosіs комплекс

19

1.3.2

Атипові мікобактерії, Mycobacterium avium intracellulare комплекс

22

1.4

Методи лабораторної діагностики туберкульозу

27

1.4.1

Мікроскопія

30

1.4.2

Культивування

32

1.4.3

Біохімічні тести

34

1.4.4

Екстракція ДНК мікобактерій

35

1.4.5

Полімеразна ланцюгова реакція

36

1.4.6

Рестрикційно-ензимний аналіз ділянки гена groEL2 (hsp65)

39

1.4.7

Споліготайпінг

40

1.4.8

Гель-електрофорез у пульсуючому полі

44

1.4.9

Секвенування ділянки гена 16S рибосомальної РНК

45

1.5

Філогенетичні зв’язки мікобактерій

48

1.6

Теоретичні основи створення праймерів

50

1.7

Висновок з огляду літератури

52

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

55

2.1

Культури

55

2.2

Культивування

56

2.3

Мікроскопічні дослідження

57

2.4

Методи екстракції мікобактеріальної ДНК

57

2.4.1

Визначення екстинції суспензії мікобактерій

57

2.4.2

Екстракція мікобактеріальної ДНК способом ультразвукової дезінтеграції клітин з подальшою їх обробкою високою температурою

57

2.4.3

Екстракція мікобактеріальної ДНК способом обробки клітин високою температурою

58

2.4.4

Екстракція мікобактеріальної ДНК за допомогою впливу на клітини мікрохвильового випромінювання

58

2.4.5

Екстракція мікобактеріальної ДНК способом руйнації клітин скляними бусинками

58

2.4.6

Екстракція мікобактеріальної ДНК способом фенол-хлороформної екстракції

58

2.4.7

Визначення ефективності методів екстракції ДНК за допомогою ПЛР

59

2.5

Визначення генотипової варіабельності специфічних ознак мікобактерій

59

2.5.1

Видова диференціація культур мікобактерій за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

59

2.5.2

Рестрикційно-ензимний аналіз ділянки гена groEL2 (hsp65)

61

2.5.3

Споліготайпінг

63

2.5.4

Дослідження атипових мікобактерій за допомогою гель-електрофорезу в пульсуючому полі (ГЕПП)

65

2.5.5

Секвенування ділянки гена 16S рибосомальної РНК

66

2.5.6

Філогенетичний аналіз

69

2.6

Розробка тест-системи для детекції ДНК бактерій роду Mycobacterium методом полімеразної ланцюгової реакції

70

РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

72

3.1

Вивчення культуральних, тинкторіальних та морфологічних особливостей досліджуваних мікобактерій

72

3.2

Порівняльні дослідження ефективності методів екстракції мікобактеріальної ДНК

80

3.3

Визначення генотипової варіабельності специфічних ознак мікобактерій

83

3.3.1

Видова диференціація культур мікобактерій методом полімеразної ланцюгової реакції

83

3.3.2

Рестрикційно-ензимний аналіз ділянки гена groEL2 (hsp65)

88

3.3.3

Споліготайпінг

92

3.3.4

Дослідження атипових мікобактерій за допомогою гель-електрофорезу в пульсуючому полі (ГЕПП)

95

3.3.5

Видова диференціація мікобактерій за допомогою секвенування ділянки гена 16S рибосомальної РНК

98

3.3.6

Результати множинного вирівнювання секвенованих ділянок 16S рибосомальної ДНК

103

3.3.7

Філогенетичний аналіз

112

3.3.8

Розробка системи видової диференціації мікобактерій і визначення їхньої генетичної спорідненості за допомогою генотипування

117

3.3.9

Розробка тест-системи для детекції ДНК бактерій роду Mycobacterium методом полімеразної ланцюгової реакції

120

3.3.9.1

Конструювання специфічних олігонуклеотидів (праймерів)

120

3.3.9.2

Оптимізація параметрів тест-системи, перевірка її специфічності, чутливості та відтворюваності

123

РОЗДІЛ 4. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

128

ВИСНОВКИ

147

ПРОПОЗИЦІЇ ДЛЯ ПРАКТИКИ

150

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

151

ДОДАТКИ

183

П Е Р Е Л І К У М О В Н И Х С К О Р О Ч Е Н Ь

ВРХ велика рогата худоба;
ГЕПП гель-електрофорез у пульсуючому полі (Pulsed field gel electrophoresis, PFGE);
ДНК дезоксирибонуклеїнова кислота;
дНТФ дезоксинуклотидтрифосфати;
M моль;
мM мілімоль;
мкМ мікромоль;
НТМ нетуберкульозні мікобактерії;
пкМ пікомоль;
п.н. пара нуклеотидів;
ПДРФ поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів;
ПЛР полімеразна ланцюгова реакція;
рДНК ген рибосомальної РНК;
РЕА рестрикційно-ензимний аналіз;
РНК рибонуклеїнова кислота;
ТВЕ трис-боратний буфер;
ФСБ фосфатно-сольовий буфер;
DDBJ база даних ДНК Японії (DNA Data Base of Japan);
DR прямі повтори (direct repeats);
DSM Німецька колекція мікроорганізмів (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen);
DVR прямий варіюючий повтор (direct variable repeat);
EMBL Європейська база даних нуклеотидних послідовностей (The European Molecular Biology Laboratory);
hsp хіт-шок протеїн (heat shock protein);
IS інсерційний елемент (інсерційна послідовність, Insertion Sequence);
MAIC Мycobacterium avium Мycobacterium intracellulare complex;
M. a. avium, Maa Мycobacterium avium subsp. avium;
M. a. hominissuis, Mah Мycobacterium avium subsp. hominissuis;
M. a. silvaticum Мycobacterium avium subsp. silvaticum;
MIRU мікобактеріальні розсіяні повторювані юніти (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units);
MTC Мycobacterium tuberculosis complex;
NALC N-ацетил-L-цистеїн (N-acetyl-L-cysteine);
NRLRTP Національна референс-лабораторія вивчення туберкульозу та паратуберкульозу великої рогатої худоби (Федеральний дослідний інститут здоров’я тварин імені Ф. Льофлера, м.Йєна, Німеччина);
OADC олеїнова кислота, альбумін, декстроза, каталаза (oleic acid, albumin, dextrose, catalase);
PZA піразинамід (pyrazinamide);
RIDOM проект рибосомальної диференціації мікроорганізмів (Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms);
SDS додецил сульфат натрію (sodium dodecyl sulphate);
subsp. підвид (subspecies);
VNTR варіююча кількість тандемних повторів (Variable Number of Tandem Repeats);
WHO Всесвітня організація охорони здоров’я (World Health Organization).

В С Т У П

Актуальність теми. Туберкульоз сільськогосподарських тварин має велике економічне і епідеміологічне значення. Збитки, яких завдає Mycobacterium bovis сільському господарству у світі, сягають 3 млрд. доларів США щорічно [276], кожного року в світі від туберкульозу вмирає близько 2млн. чоловік. Згідно з даними звіту WHO за 2006 рік, щорічно реєструється близько 9 мільйонів нових випадків, і захворюваність на туберкульоз продовжує збільшуватися, переважна більшість інфікованих людей перебуває в країнах, що розвиваються [236, 251, 311].
В Україні це зооантропонозне захворювання також залишається надзвичайно гострою та актуальною проблемою як для гуманної, так і для ветеринарної медицини. Так, за даними WHO, інцидентність захворюваності на туберкульоз в Україні становить 101, а превалентність 151 на сто тисяч населення, при цьому зберігається тенденція до збільшення інцидентності [310]. Порівняно зі станом захворюваності на 1990 рік у 2004 році рівень інцидентності зріс на 315,6 %. Інфіковано 8090 % громадян України [16].
Незважаючи на значні досягнення ветеринарної служби в боротьбі з туберкульозом тварин, захворювання на туберкульоз реєструється в регіонах усіх природно-географічних зон і завдає значних збитків тваринництву України [5, 30]. За період із 2001 по 2005 рр. зареєстровано 238 неблагополучних щодо туберкульозу ВРХ господарств у 12 областях України. За цей період у господарствах України виділено 186 636 голів реагуючої худоби, з яких з діагностичною метою забито 63 322 голови, патологоанатомічні зміни виявлені у 2317 голів, що становить 3,7 %. Кількість туш із туберкульозними ураженнями зросла більше ніж вдвічі від 3,1 % оглянутих туш у 2001 році до 8,8 % у 2005 р.
На сьогодні діагностика туберкульозу в Україні здійснюється із застосуванням комплексу епізоотологічного, алергічного, патологоанатомічного та бактеріологічного методів досліджень.
Алергічна діагностика на туберкульоз ускладнюється наявністю неспецифічних реакцій на туберкулін для ссавців, зумовлених непатогенними для тварин атиповими мікобактеріями [3]. Визначення епізоотичної ситуації щодо туберкульозу в гуртах тварин можливе завдяки застосуванню симультанної проби в комплексі з іншими методами [6]. У багатьох благополучних щодо туберкульозу господарствах етіологічний фактор реактивності ВРХ до туберкуліну залишається не встановленим [4]. Кількість господарств, де діагноз на туберкульоз виключено комплексно, за період 20012005 роки дорівнює 6911. Для здійснення таких досліджень необхідно мати високоспецифічні алергени.
Згідно з чинною Інструкцією «Про заходи з профілактики та оздоровлення тваринництва від туберкульозу», результати лабораторних досліджень з урахуванням епізоотологічних даних є регламентуючими у постановці діагнозу. У державних лабораторіях ветеринарної медицини України застосовують методи бактеріологічної діагностики, зокрема визначення фенотипових ознак мікобактерій (кислотостійкість, характер і швидкість росту, наявність або відсутність певних біохімічних характеристик, вірулентність для лабораторних тварин тощо) [7, 8, 17]. Чинна методика ідентифікації та видової диференціації мікобактерій, яка включає в себе 10 культурально-морфологічних, біохімічних і біологічних тестів, дозволяє протягом 3090 діб визначити видову належність тільки 18 видів епізоотичних культур з 90 систематизованих [7, 8, 70, 89, 294].
Розробка методів ранньої діагностики цієї інфекції є найважливішою складовою в системі контролю за поширенням туберкульозу. Розвиток новітніх технологій на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і секвенування відкриває нові перспективи щодо діагностики туберкульозу, зокрема детекції та диференціації збудників, проведення їх генотипування та молекулярно-епізоотологічного моніторингу [40, 124, 236]. Перспективність використання молекулярно-генетичних методів полягає в дуже високій специфічності та чутливості, можливості встановлення джерела інфекції та шляхів передачі збудника на ранніх стадіях інфекційного й епізоотичного процесів, значному скороченні терміну постановки діагнозу на туберкульоз [13, 18, 21, 31], що дає можливість встановлення або спростування діагнозу на туберкульоз у господарствах шляхом підтвердження наявності атипових мікобактерій і відсутності мікобактерій туберкульозного комплексу, скорочуючи вимушений забій худоби, проведення оздоровчих заходів у коротший час.
Наведені обставини викликають необхідність дослідження генетичної варіабельності штамів мікобактерій, виділених на території України, визначення їхніх філогенетичних взаємозв’язків, дослідження видового спектра мікобактерій, що циркулюють у гуртах тварин та в об’єктах навколишнього середовища, з метою розробки ефективних систем епізоотологічного моніторингу та вдосконалення методів діагностики для боротьби з туберкульозом із застосуванням нових діагностичних препаратів і технологій, що сприятиме встановленню ефективного контролю над цією небезпечною зооантропонозною інфекцією.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася згідно з тематичним планом наукових досліджень ННЦ «ІЕКВМ», завдання 04.04 «Розробити тест-системи для детекції збудників інфекційних захворювань за допомогою полімеразної ланцюгової реакції» (20022005рр., номер держреєстрації 040101U001616), 37.01-005 «Вивчити генетичні особливості мікобактерій туберкульозу та атипових мікобактерій, ізольованих від сільськогосподарських тварин у різних регіонах України та розробити ПЛР тест-системи для їх детекції» (20062010рр., номер держреєстрації 0106U000350).
Мета і задачі дослідження. Мета досліджень визначити видовий склад мікобактерій, виділених в різних регіонах України, вивчити їхні культурально-морфологічні властивості, філогенетичні взаємозв’язки, розробити систему молекулярно-генетичної детекції та видової диференціації мікобактерій.
Для досягнення мети були поставлені такі задачі:
1. Провести видову диференціацію культур мікобактерій, ізольованих у різних регіонах України впродовж 19822004 років, з використанням молекулярно-генетичних методів, дослідити їхні культурально-морфологічні властивості.
2. Визначити видову належність і питому вагу атипових мікобактерій, виділених від ВРХ, що реагує на туберкулін для ссавців.
3. Провести порівняльний аналіз ефективності використання молекулярно-генетичних методів для діагностики туберкульозу тварин.
4. Провести секвенування послідовності гена 16S рРНК досліджуваних мікобактерій, множинне вирівнювання секвенованих послідовностей та їхній філогенетичний аналіз.
5. Розробити метод екстракції ДНК з бактеріальної маси мікобактерій.
6. Розробити систему видової диференціації та визначення генетичної спорідненості мікобактерій.
7. Розробити родоспецифічну тест-систему для детекції роду Mycobacterium за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.
Об’єкт дослідження: туберкульоз сільськогосподарських тварин: збудники туберкульозу та атипові мікобактерії.
Предмет дослідження: молекулярно-генетична детекція та диференціація мікобактерій, культури туберкульозних і атипових мікобактерій, їхні культурально-морфологічні властивості, генетична варіабельність, філогенетичні зв’язки, засоби діагностики, методи виділення ДНК, тест-система для детекції роду Mycobacterium методом ПЛР, молекулярна епізоотологія.
Методи дослідження. Робота виконана з використанням бактеріологічних, молекулярно-біологічних, генетичних та статистичних методів досліджень.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні здійснено порівняльну оцінку діагностичної ефективності молекулярно-генетичних методів видової диференціації мікобактерій і молекулярної епізоотології, а саме: полімеразної ланцюгової реакції, рестрикційно-ензимного аналізу ділянки гена groEL2 (hsp65), споліготайпінгу, гель-електрофорезу в пульсуючому полі, секвенування гіперваріабельної ділянки гена 16S рРНК.
За допомогою молекулярно-генетичних методів визначено видову належність 125 штамів мікобактерій, уперше отримано дані щодо циркуляції на території України таких видів мікобактерій, як Mycobacterium caprae, Mycobacterium frederiksbergensе, Mycobacterium engbackii, Mycobacterium doricum, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium hassiacum, Mycobacterium confluent

Список литературы

В И С Н О В К И

1. За результатами тинкторіальних, культуральних, молекулярно-біологічних та філогенетичних методів дослідження визначено видовий склад та філогенетичні взаємозв’язки мікобактерій, ізольованих у різних регіонах України; здійснено порівняльну оцінку наявних молекулярно-генетичних методів, теоретично та експериментально обґрунтовано їх застосування для видової диференціації та генотипування мікобактерій. Запропоновано систему молекулярно-генетичної детекції та видової диференціації мікобактерій, яка містить комплекс послідовного застосування полімеразної ланцюгової реакції, рестрикційно-ензимного аналізу ділянки гена groEL2 (hsp65), споліготайпінгу, гель-електрофорезу в пульсуючому полі, секвенування гіперваріабельної ділянки гена 16S рибосомальної РНК, а також культивування та мікроскопію.
2. За результатами визначення видової належності 125 штамів М.tuberculosis complex та атипових мікобактерій, виділених в Україні з 1982 по 2004 роки, уперше показано циркуляцію на її території таких видів: M.caprae, M.frederiksbergensе, M.engbackii, M. hassiacum, M.doricum, M.parascrofulaceum, M. confluentis, M.elephantis. Здійсненим уперше типуванням 38 штамів M.аvium до підвидів установлено, що співвідношення між M. avium subsp. hominissuis та M.aviumsubsp. avium становить 1:1.
3. Під час дослідження атипових мікобактерій, виділених від ВРХ, що реагуює на туберкулін, встановлено, що головна роль у сенсибілізації ВРХ до туберкуліну належить M. аvium (32,0% ізолятів атипових видів мікобактерій), зокрема M.aviumsubsp.hominissuis 22,7 %, і M.fortuitum (17,3%), на долю M.nonchromogenicum припадає 9,3 %, M. phlei 8,0%, інших 9 видів атипових мікобактерій 33,3%.
4. За результатами дослідження культурально-морфологічних властивостей 125 культур мікобактерій встановлено, що найшвидші темпи росту культур з одночасною можливістю докладного вивчення їхніх культурально-морфологічних властивостей можуть бути отримані за паралельного використання різних поживних середовищ: яєчних, агарвміщуючих і рідких.
5. Вивчення генетичної варіабельності досліджених культур дало можливість визначити діагностичну цінність молекулярно-генетичних методів. При цьому встановлено, що для видової ідентифікації представників комплексу М.tuberculosis ефективним є споліготайпінг, для підвидів М.avium найбільш придатним є метод ПЛР, для атипових мікобактерій секвенування гіперваріабельної ділянки гена 16S рРНК та РЕА-hsp65, однак останній має суттєві обмеження в специфічності порівняно із секвенуванням. Використання IS902 як специфічного маркера для диференціації M.аviumsubsp.silvaticum виявилося неможливим.
6. Ефективним методом молекулярно-епізоотологічних досліджень представників М. tuberculosis complex (MTC) є споліготайпінг, за допомогою якого було диференційовано 15 штамів МТС: 12 M. bovіs і 3 M. caprae, з них 2 сполігопрофіля є унікальними. Для генотипування атипових видів мікобактерій ефективним є гель-електрофорез у пульсуючому полі, за допомогою якого у всіх 23 досліджених штамів було визначено унікальні фінгерпринтинги і встановлено високий ступінь гетерогенності штамів M.fortuitum.
7. У результаті аналізу топографії побудованого філогенетичного древа 17видів мікобактерій виявлено наявність трьох кластерів: швидкозростаючих мікобактерій (3види), «термотолерантних» швидкозростаючих мікобактерій (7видів) і повільнозростаючих мікобактерій (7 видів). Класифікація мікобактерій за Раньйоном не відображає філогенетичні взаємозв’язки мікобактерій.
8. Розроблений метод виділення ДНК з бактеріальної маси мікобактерій для її використання в ПЛР не поступається за ефективністю іншим лабораторним методам, дозволяє здійснити екстракцію ДНК протягом 20 хвилин і не потребує реагентів.
9. Розроблено систему видової диференціації мікобактерій (за допомогою ПЛР, РЕА-hsp65, секвенування ділянки гена 16S рРНК, споліготайпінгу) та визначення їхньої генетичної спорідненості за допомогою генотипування (з використанням споліготайпінгу та ГЕПП).
10. На основі розрахованих олігонуклеотидних послідовностей розроблена тест-система для діагностики роду Мycobacterium, яка дозволяє виявляти 100 клітин збудника в мілілітрі, що відповідає найкращим світовим аналогам.

ПРОПОЗИЦІЇ ДЛЯ ПРАКТИКИ

1. Методичні рекомендації «Лабораторна діагностика туберкульозу тварин і птиці», затверджені НТР Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України, протокол № 3 від 23 грудня 2005 р.
2. Технічні умови на тест-систему для виявлення ДНК бактерій роду Mycobacterium методом полімеразної ланцюгової реакції «TUBMYC-Україна» ТУ У 24.4-00497087-014:2005.
3. Настанова по застосуванню тест-системи для виявлення ДНК бактерій роду Mycobacterium методом полімеразної ланцюгової реакції «TUBMYC-Україна».
4. Cистема видової диференціації мікобактерій і визначення їхньої генетичної спорідненості за допомогою генотипування.
5. Спосіб виділення ДНК мікобактерій із живильних середовищ для діагностики туберкульозу та мікобактеріозів в полімеразній ланцюговій реакції (Деклараційний патент України № 8094 від 15.07.2005).
6. Спосіб діагностики туберкульозу та мікобактеріозів тварин (Деклараційний патент України № 3080 від 15.10.2004).

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. Арефьев, В.А. Англо-русский толковый словарь генетических терминов / В.А. Арефьев, Л.А. Лисовенко; Науч. ред. Л.И. Патрушев. М.: Изд-во ВНИРО, 1995. 407 с.
2. Вільні жирні кислоти M. bovis та інфекційний процес / В. Бусол [ та ін.] // Ветеринарна медицина України. 2007. № 3. С.10-13.
3. Горжеєв, В.М. Епізоотологічний моніторинг та удосконалення системи боротьби з туберкульозом великої рогатої худоби у господарствах України: дис канд. вет наук: 16.00.08 /Горжеєв Володимир Михайлович. Х., 2005. 126с.
4. Динаміка епізоотологічного процесу при мікобактеріальних інфекціях великої рогатої худоби в господарствах Причорномор’я / Н. Селіщева [та ін.] // Ветеринарна медицина України. 2006. № 12. С.12-14.
5. До питання діагностики туберкульозу тварин / Ю. Колос [та ін.] // Ветеринарна медицина України. 2006. № 11. С.10-12.
6. Достижения науки и практики в борьбе с туберкулезом животных в хозяйствах Украины / Ю.Я. Кассич [и др.] // Ветеринарная патология. 2004. № 12 (9). С.38-41.
7. Дяченко, Г. Проблема діагностики туберкульозу сільськогосподарських тварин у сучасних умовах / Г. Дяченко, Н. Кравченко, В. Романенко // Ветеринарна медицина України. 2006. № 1. С.5-7.
8. Завгородний, А.И. Виды микобактерий, распространенные в хозяйствах Украины, и их эпизоотическое значение: дис д-ра вет наук: 16.00.03 / Завгородний Андрей Иванович. Х., 1997. 298с.
9. Зелінський, М. Туберкульоз великої рогатої худоби. Причини виникнення та фактори, що стримують оздоровлення неблагополучних господарств / М. Зелінський // Ветеринарна медицина України. 2000. № 6. С.15-16.
10. Інструкція про заходи з профілактики та оздоровлення тваринництва від туберкульозу // Тваринництво України. 1994. №2. С.14-18.
11. Кассич, В.Ю. Микобактериозы как паразитозы и сапронозы / В.Ю. Кассич // Ветеринарная патология. 2004. № 12 (9). С.127-129.
12. Коничев, А.С. Молекулярная биология / А.С. Коничев, Г.А.Севастьянова. М., 2005. 397 c.
13. Костюк, Р.В. ПЦР при контроле благополучия скота по туберкулезу / Р.В. Костюк // Ветеринарная патология. 2004. № 1-2 (9). С.105-107.
14. Мартма, О.В. Атипичные микобактерии и их диагностическое и эпизоотологическое значение при туберкулезе крупного рогатого скота: автореф. дис д-ра вет. наук / Мартма ......... Тарту, 1971. 43 с.
15. Мельник, В.М. Тубеpкулез на Укpаине: состояние, пpоблемы и пpогноз (медико-статистические исследования) / В.М. Мельник // Проблемы туберкулеза. 2000. №5. С. 28-32.
16. Мельник, В.М. Социальные и медицинские проблемы туберкулеза в Украине / В.М. Мельник, В.В. Волошина // Проблемы туберкулеза. 2004. № 2. С.22-24.
17. Методические рекомендации по уточнению диагноза на туберкулез у крупного рогатого скота благополучных хозяйств и определению видовой принадлежности культур микобактерий / Ю.Я. Кассич [ и др.] // Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии. Х., 1987. 19 с.
18. Молекулярные методы исследования в диагностике туберкулеза / Т.В. Гребенникова [и др.] // Ветеринарная патология. 2004. № 12 (9). С.92-93.
19. Определитель бактерий Берджи // Под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. М.: Мир, 1997. Т. 2. С. 607.
20. Ощепков, В.Г. До питання оптимізації протитуберкульозних заходів / В.Г. Ощепков // Ветеринарна медицина України. 2006 № 3. С.19.
21. Полимеразная цепная реакция (система senX3-regX3) при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / А.Х. Найманов [ и др.] // Ветеринарная патология. 2004. № 1-2 (9). С.96-99.
22. Пузанов, В.А. Бактериемия при туберкулезе и других микобактериальных инфекциях / В.А. Пузанов, М.В. Косарева // Проблемы туберкулеза. 1999. №1. С.54-59.
23. Ратнер, В.А. Молекулярная эволюция / В.А. Ратнер // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 3. С. 41-47.
24. Румачик, И.И. Синантропные птицы механические переносчики микобактерий / И.И. Румачик, А.Э. Высоцкий // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы междунар. науч.-практ. конф., 16-18 апреля 2002г / ВНИИ вет. вирусологии и микробиологии. Покров, 2002. С. 258-259.
25. Савченко, П.Е. Лабораторная диагностика туберкулеза животных: Практ. пособие / П.Е. Савченко. Чернигов, 1998. 64 с.
26. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов / М.А.Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов. М.: Колос, 1995. 319 с.
27. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза / В.А.Аникин [и др.] // Ветеринарная патология. 2004. №1-2(9). С.30-31.
28. Тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для идентификации возбудителя туберкулеза / Л.Н. Нестеренко [и др.] // Проблемы туберкулеза. 1994. № 2. С. 29-32.
29. Ткаченко, О. Швидкоростучі M. bovis у проблемі туберкульозу / О. Ткаченко // Ветеринарна медицина України. 2004. № 7. С.14-17.
30. Ткаченко, О.А. Туберкульоз і мікобактеріозна інфекція великої рогатої худоби: автореф. дисс доктора вет. наук / Ткаченко Олексій Андрійович. Київ, 1999. 36 с.
31. Тунгусова, О.С. Молекулярная генетика микобактерий туберкулеза / О.С. Тунгусова, А.О. Марьяндышев // Проблемы туберкулеза. 2003. №2. С. 43-45.
32. Урбан, В.П. Туберкулез как антропозооноз / В.П. Урбан, М.М. Широбокова, Ю.Ю. Данко // Тез. докл. 3-й науч.-практ. конф. Гродно, 1987. С.74-75.
33. Характеристика циркулирующих на Северо-Западе России штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием сполиготипирования / О.В. Нарвская [и др.] // Проблемы туберкулеза. 2002. №4. С. 44-48.
34. Чемерис, А.В. Новая старая ДНК. Уникальные черты самой главной молекулы, или Почему ученые разных специальностей в последнее время обращают на ДНК все больше внимания / А.В. Чемерис, В.А. Вахитов. Уфа, 2002. 80с.
35. Шишков, В.П. Туберкулез сельскохозяйственных животных / В.П. Шишков, В.П. Урбан. М.: Агропромиздат, 1991. 255 с.
36. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex / R. Brosch [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. Vol. 99. Р.3684-3689.
37. A novel insertion element from Mycobacterium avium, IS 1245, is a specific target for analysis for strain relatedness / S. Guerrero [et al] // J. Clin. Microbiol. 1995. Vol.33. P.304-307.
38. A novel method for the isolation of mycobacterial DNA / J.A. Gongalez-y-Merchand [et al] // FEMS Microbiol. Lett. 1996. Vol.135. P.71-77.
39. A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis complex, Canetti: characterization of an exceptional isolate from Africa / D. van Soolingen [et al.] // International Journal of Systematic Bacteriology. 1997. Vol. 47, №. 4. P.1236-1245.
40. A standardized restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for typing Mycobacterium avium isolates links IS901 with virulence for birds / L. Dvorska [et al.] // J. Microbiol. Methods. 2003. Vol.55. Р.11-27.
41. Aiyar, A. The Use of CLUSTAL W and CLUSTAL X for multiple sequence alignment / A. Aiyar // Bioinformatics. Methods in Molecular Biology / Eds. S.Misener, S.A. Krawetz. Totowa: Humana Press, 2000 P.221-241.
42. Allen, B.W. Mycobacteria: general culture methodology and safety considerations / B.W. Allen // Mycobacteria protocols. Methods in molecular biology / Eds. T. Parish, N.G. Stoker. Totowa: Humana Press, 1998. Vol.101. Р.15-31.
43. Analysis of multidrug-resistant Mycobacterium bovis from three clinical samples from Scotland / V.M. Hughes [et al.] // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2003. Vol. 7, №12. P.1191-1198.
44. Assessment of genetic markers for species differentiation within the Mycobacterium tuberculosis complex / E. Lie´bana [et al] // Journal of Clinical Microbiology. 1996. Vol. 34, №. 4. P.933-938.
45. Atypische Mykobakterien. Möglichkeiten der Diagnostik und klinische Relevanz / I. Moser [et al.] // Arbeitskreis für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik: Materialen der Konferenz , BFAV, 17 September, Jena, Deutschland. Jena, 2003.
46. Baess, I. Isolation and purification of deoxyribonucleic acid from mycobacteria // Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B. 1974. Vol. 82. P.780-784.
47. Bagasra, O. In situ PCR techniques / O. Bagasra, J. Hansen. New York: Wiley-Liss, 1997. 127 p.
48. Barrera, L.F. Assessment of mycobacterial infection and multiplication in macrophages by polymerase chain reaction / L.F. Barrera, E. Skamene, D. Radzioch // Journal of Immunological Methods. 1993. Vol. 157. P.91-99.
49. Bartlett, J.M.S. Extraction of nucleic acid templates / J.M.S. Bartlett, D. Stirling // PCR protocols, 2nd ed. Methods in molecular biology. Totowa: Humana Press, 2003. Vol. 226. P.27-29.
50. Bedell, J. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) / J. Bedell, I. Korf, M. Yandell. O'Reilly & Associates, Inc., USA, 2003. 360 p.
51. Belisle, J.T. Isolation of genomic DNA from Mycobacteria / J.T. Belisle, M.G. Sonnenberg // Methods in molecular biology / Eds. T. Parish, N.G. Stoker. Totowa: Humana Press, 1998. Vol. 101. P.323-347.
52. Besra, G. Lipids and carbohydrates of Mycobacterium tuberculosis / G. Besra, D. Chatterjee // Tuberculosis: pathogenesis, protection and control / Eds. B.R. Bloom. Washington, 1994.
53. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting / W.A. Rees [et al.] // Biochemistry. 1993. Vol. 32, №1. P.137-144.
54. Bloom, B.R. Tuberculosis: pathogenesis, protection and control / B.R. Bloom. Washington: ASM Press, 1994. 637 p.
55. Boxall, N. Pulsed-field gel electrophoresis: a tool for molecular epidemiology: diss Master of Veterinary Studies (Epidemiology) / Boxall Naomi. Massey University, Australia, 1999. 108 p.
56. Boеttger, E.C. Approaches for identification of microorganisms / E.C. Boеttger // ASM News. 1996. Vol. 62. P.247-250.
57. Braden, C.R. Assessment of Mycobacterium tuberculosis genotyping in a large laboratory network / C.R. Braden, J.T. Crawford, B.A. Schable // Emerg Infect Dis. 2002. № 8. Р.1210-1215.
58. Bradley, S.G. Relationships among Мycobacteria and Nocardiae based upon deoxyribonucleic acid reassociation / S.G. Bradley // Journal of Bactеriology. 1973. Vol.113. P.645-651.
59. Brennan, P.J. The envelope of Mycobacteria / P.J. Brennan, H. Nikaido // Annu. Rev. Biochem. 1995. Vol. 64. P.29-63.
60. Chamberlin, W.M. Integrating theories of the etiology of Crohn’s disease. On the etiology of Crohn’s disease: questioning the hypotheses / W.M. Chamberlin, S.A. Naser // Med. Sci. Monit. 2006. Vol. 12, № 2. P.27-33.
61. Characterization of Mycobacterium avium isolated from veterinary sources in Latvia / A. Zirnitis [et al.] // European Society of Mycobacteroilogy: 27th Annual Congress, 9-12 July 2006, University of Greenwich, London, UK. London, 2006. Р. 29.
62. Characterization of Mycobacterium caprae isolates from Europe by mycobacterial interspersed repetitive unit genotyping / W.M. Prodinger [et al.] // J. Clin. Microbiol. 2005. Vol. 43, №10. P.4984-4992.
63. Clinical, microscopic, and molecular aspects of canine leproid granuloma in the United States / J.E. Foley [et al.] // Vet Pathol. 2002. Vol. 39. Р.234-239.
64. Collins, C.H. A study of bovine strains of Mycobacterium tuberculosis isolated from humans in South-East England, 1977-1979 / C.H. Collins, M.D. Yates, J.M. Grange // Tubercle. 1981. Vol. 62. Р.113-116.
65. Comparative macrorestriction and RFLP analysis of Mycobacterium avium subsp. avium and Mycobacterium avium subsp. hominissuis isolates from man, pig, and cattle / P. Möbius [et al.] // Vet. Microbiol. 2006. Vol. 117. P.284-291.
66.&