ВОРОНКІНА ІРИНА АНАТОЛІЇВНА ОСОБЛИВОСТІ БІОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ БАКТЕРІЙНИХ ЗБУДНИКІВ ГОСТРОЇ КИШКОВОЇ ІНФЕКЦІЇ У ДІТЕЙ ТА НОВІ ПІДХОДИ ДО ІДЕНТИФІКАЦІЇ ЕНТЕРОБАКТЕРІЙ

Краткое описание

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА
„ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ім. І.І. МЕЧНИКОВА
АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ”

На правах рукопису

ВОРОНКІНА ІРИНА АНАТОЛІЇВНА

УДК 579.842.1/.2+579.61:616.34-002-053.2-078(043.3)

ОСОБЛИВОСТІ БІОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ БАКТЕРІЙНИХ ЗБУДНИКІВ ГОСТРОЇ КИШКОВОЇ ІНФЕКЦІЇ У ДІТЕЙ ТА НОВІ ПІДХОДИ ДО ІДЕНТИФІКАЦІЇ ЕНТЕРОБАКТЕРІЙ

03.00.07 - мікробіологія

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата
медичних наук

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК
Волянський Юрій Леонідович,
доктор медичних наук, професор,
заслужений діяч науки і техніки

Харків – 2009
ЗМІСТ

С.
СПИСОК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
ВСТУП . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.1. Матеріали для досліджень.. . . . . . . . . . . . . . 37
2.2. Методи досліджень. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
РОЗДІЛ 3 ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА
ЗАХВОРЮВАНОСТІ НА ГКІ В СХІДНОМУ ТА
ЗАХІДНОМУ РЕГІОНАХ УКРАЇНИ. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .

43
РОЗДІЛ 4 БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ПАТОГЕННИХ ТА
УМОВНО-ПАТОГЕННИХ МІКРООРГАНІЗМІВ,
ВИЛУЧЕНИХ ВІД ХВОРИХ НА ГКІ. . . .. . . . . . . . . . . . . . . .

51
РОЗДІЛ 5 ЧУТЛИВІСТЬ МІКРООРГАНІЗМІВ, ВИЛУЧЕНИХ ВІД
ХВОРИХ ДІТЕЙ НА ГКІ, ДО АНТИБІОТИКІВ ТА
БАКТЕРІОФАГІВ . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1. Визначення чутливості патогенної та умовно-
патогенної мікрофлори до антибактеріальних препаратів. . . .
5.2. Визначення чутливості патогенної мікрофлори до
бактеріофагів . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

64

64

78
РОЗДІЛ 6 ПОБУДОВА МАТЕМАТИЧНОЇ МОДЕЛІ ТА СТВОРЕННЯ
КОМП´ЮТЕРНОЇ ПРОГРАМИ ДЛЯ СПРОЩЕНОЇ
ІДЕНТИФІКАЦІЇ ЕНТЕРОБАТЕРІЙ . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .
6.1. Визначення тест-комплексів ентеробактерій за допомогою
методу мозаїчного портрету (ММП) . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2. Оцінка інформативності тестів . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.3. Експериментальна перевірка ефективності використання
створеної комп’ютерної програми . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

89

89
92

95

РОЗДІЛ 7 АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ 110
ВИСНОВКИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

СПИСОК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
АЛА – антилізоцимна активність
АКА – антикомплементарна активність
АТФ – аденозинтрифосфат
ВООЗ – Всесвітня Організація Охорони Здоров'я
ГКІ – гострі кишкові інфекції
г – грами
ДУ – Державна Установа
ДНК – дезоксірібонуклеїнова кислота
ІФА – імуноферментний аналіз
ІЕІХ – Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ІАМ – індекс адгезивності мікроорганізмів
К – коефіцієнт участі еритроцитів в адгезії
КУО/мл – колонієутворюючі одиниці в міллілітрі
мл – міллілітр
мкг/мл – мікрограм в міллілітрі
ММП – метод мозаїчного портрету
НДР – науково-дослідна робота
НФ – некультурабельні форми
НДІ – Науково-дослідний інститут
ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція
ПК – персональний комп’ютер
pРНК – рибосомальна рібонуклеїнова кислота
РНГА – реакція непрямої гемаглютинації
РКОА – реакція коаглютинації
РЗК – реакція зв’язування комплементу
РА – реакція аглютинації
СПА – середній показник адгезії
УПМ – умовно-патогенні мікроорганізми
УПЕ – умовно-патогенні ентеробактерії
ФП – фактори патогенності
ЧДА – чистий для аналізу
ШКТ – шлунково-кишковий тракт
IS – інсерційні елементи
XLD – ксилозо-лізино-дезоксіхолатний агар
SS-агар – середовище для сальмонел і шигел

ВСТУП

Актуальність теми

Гострі кишкові інфекції (ГКІ) мають суттєвий вплив на здоров’я населення України та світу в цілому. Так, лише за останні 10 років захворюваність на сальмонельоз в Україні збільшилась майже у два рази, були зареєстровані спалахи шигельозу та інших кишкових інфекцій (О.В. Прокопів, 1998; О.В. Лапушенко та ін., 2004; М.А. Андрейчин, 2007). Причинами такої ситуації вважають мінливість збудників бактеріальних діарей, їх факторів патогенності, що, в свою чергу, призводить до зміни клінічної картини в бік зростання питомої ваги стертих та атипових форм захворювання, несвоєчасного звернення хворого до лікаря, зниження рівня бактеріологічного та серологічного підтвердження діагнозу, збільшення кількості невиявлених джерел інфекції та зниження ефективності протиепідемічних заходів у боротьбі з ГКІ (В.Ф.Марієвський, 1996; Т.Є. Петренко і співавт., 2002).
У сучасних умовах йде перегляд ролі тих чи інших серотипів та внутрішньовидових варіантів не лише патогенних, але й умовно-патогенних мікроорганізмів (УПМ), у тому числі нових видів бактерій (О.В. Стольникова, В.С. Копча, 2002). Коливання видових і внутрішньовидових характеристик збудників, зміна біологічних та епідеміологічних властивостей вимагає їх постійного дослідження та моніторингу. Патогенність та вірулентність є основними критеріями, які використовуються фахівцями для характеристики мікроорганізмів, здатних викликати інфекційний процес (В.Д. Тимаков, 1973; J.M. Johnson, R. Ziegler, 1989; В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, 2002; О.В. Бухарин, 2006), розвиток якого відбувається завдяки наявності у мікроорганізмів цілого арсеналу цих факторів: адгезинів, антилізоцимної та антикомплементарної активностей, резистентності до антибактеріальних препаратів і фагів. Зростання захворюваності на ГКІ вчені пов’язують із наявністю та ступенем прояву агресивності у бактерій саме вказаних властивостей (R.L. Guerrant, C.A. Wanke, 1997; В.С. Копча, С.А. Деркач, 2004).
Своєчасна діагностика завжди була і є одним із найважливіших завдань медицини. Із більш широким використанням у наукових дослідженнях електронно-обчислювальної техніки і розвитком прикладної математики з’явилась велика кількість робіт, пов’язаних із намаганням формалізувати процес діагностики гострих кишкових інфекцій за допомогою математичних моделей (Г.М. Яковлєв, В.Н. Ардашев, 1981; В.А. Лісовський, Г.М. Яковлєв, 1988). Значний прогрес у галузі діагностики і перетворення її з інтуїтивного мистецтва висококваліфікованих лікарів у чітку науку з високим рівнем формалізації, на думку вчених, може бути досягнутий лише при переході від використання суб’єктивної діагностичної інформації експертів до об’єктивної, що генерується за допомогою методів штучного інтелекту (М.Д. Кац, В.Н. Ардашев, 1981; М.Д. Кац, Л.М. Цогоєва, 1991; O. Mayorov, M. Kats, 2000).
Звичайний, стандартний метод таксономічної ідентифікації ентеробактерій за фенотипічними ознаками передбачає проведення 49 біохімічних тестів. Отриману сукупність фенотипічних ознак аналізують шляхом візуального зіставлення з сукупностями ознак, характерних для окремого представника сімейства, наведеними в таблицях визначника Берджі. Такий спосіб ідентифікації є досить рутинний, крім цього виникають труднощі при отриманні нетипових значень біохімічних тестів та їх комбінацій. Розробка ефективних методів діагностики за допомогою комп’ютерних програм дозволить значно спростити діагностику ГКІ та підвищити її точність.
У основі існуючих схем лікування ГКІ, як і раніше, лежить використання антибактеріальних препаратів. Генетична пластичність патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, здатність набувати та втрачати плазміди веде до формування штамів, резистентних до протимікробних засобів. За даними дослідників, близько 60% шигел та сальмонел резистентні до антибіотиків, що застосовуються в сучасних умовах (P.J. Sansonetti, 2000; В.І. Сергевнін, Т.М. Лебедєва, Е.В. Сармометов, 2001; Н.А. Галушко, А.Г. Дьяченко, 2005; Vito Ricci, Peter Tzacas et al., 2006). Перспективним є вивчення чутливості патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів до антибіотиків з урахуванням регіональних особливостей циркулюючих штамів, пошук найбільш ефективних серед них, розробка нових, більш досконалих, лікувальних схем із використанням альтернативних препаратів, у тому числі й бактеріофагів. Бактеріофагія та можливість використання цього феномену для лікування інфекційних хвороб вивчається досить давно та з різною інтенсивністю (A. Sulakvelidze, Z. Alavidze, J.G. Morris, 2001). Із появою антибіотиків, їх широким застосуванням фаготерапія не мала широкого використання (особливо у країнах Заходу). В останні роки інтерес до фагів відновився, що пов’язано з появою великої кількості антибіотикорезистентних штамів та зростанням інфекційної захворюваності (В.Н. Крилов, 2002). Цілий ряд повідомлень свідчить про різну ефективність фагів (З.І. Алавідзе, Т.Г. Чанішвілі, 1989; Е.Б. Лазарєва, 2002; N. McKinney, 2008). Постає необхідність визначення ступеня літичної дії існуючих комерційних препаратів-фагів на циркулюючі штами шигел та сальмонел у кожному регіоні з метою подальшого раціонального використання їх у клінічній практиці.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційна робота пов’язана з плановою темою ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України» «Диференційна діагностика та прогноз наслідків захворювань шлунково-кишкового тракту (інфекційного та неінфекційного генезу), що супроводжуються синдромом дисбактеріозу кишечнику», № держреєстрації 0105U001111. Дисертант особисто вивчив адгезивність, антилізоцимну активність, чутливість до антибіотиків та бактеріофагів патогенних та умовно-патогенних бактерій, збудників ГКІ, брав участь у розробці макетів таблиць та їх заповненні для подальшої обробки і побудови синхронної математичної моделі.
Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої ради ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України» (протокол № 3 від 20 березня 2005 року).

Мета і завдання дослідження

Мета роботи – підвищення ефективності мікробіологічної діагностики та лікування дітей з ГКІ шляхом удосконалення методів диференціації збудників і тактики антибактеріальної терапії.
Для досягнення мети сформульовано основні задачі:
1. Охарактеризувати епідеміологічні особливості ГКІ у Східному та Західному регіонах України (на прикладі м. Харкова та м. Тернополя).
2. Вивчити фактори патогенності (адгезивну, антилізоцимну та антикомплементарну активність) циркулюючих у сучасних умовах штамів шигел, сальмонел та УПМ різних видів – збудників ГКІ.
3. Дослідити фактори патогенності музейних штамів шигел та сальмонел, вилучених у 1950-1960 роки, провести порівняльне вивчення біологічних властивостей з нині циркулюючими штамами.
4. Оцінити чутливість сучасних та музейних штамів мікроорганізмів роду Shigella, Salmonella до антибактеріальних препаратів.
5. Провести вивчення чутливості мікроорганізмів роду Shigella та Salmonella різних термінів вилучення до комерційних зразків бактеріофагів.
6. Створити авторську колекцію штамів мікроорганізмів роду Shigella та Salmonella.
7. Розробити математичну модель спрощеної ідентифікації ентеробактерій.
Об,єкт дослідження: захворюваність ГКІ, випорожнення дітей, хворих на гостру кишкову інфекцію; штами мікроорганізмів (Shigella, Salmonella, K.pneumoniae, P.mirabilis, E.cloacae, S.aureus).
Предмет дослідження: інтенсивні показники захворюваності на ГКІ; фактори патогенності шигел, сальмонел та УПМ (адгезивність, антилізоцимна, антикомплементарна активність); антибіотикочутливість; фагочутливість.
Методи дослідження: мікробіологічні, біохімічні, математичні, математико-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів

Уперше на основі результатів експериментів та за допомогою методу штучного інтелекту виявлено основні тест-комплекси для ідентифікації бактерій сімейства Enterobacteriaсeae.
Уперше шляхом розробки тест-комплексів побудована математична модель та створена комп’ютерна програма для спрощеної ідентифікації родів і видів бактерій родини Enterobacteriaceae. На розроблений спосіб ідентифікації ентеробактерій отримано патент України.
Уперше проведено ретроспективне вивчення факторів патогенності збудників ГКІ. Визначено, що в останні роки спостерігається очевидне зростання вірулентності шигел та сальмонел.

Практичне значення одержаних результатів

Додатковими епідеміологічними маркерами для диференціації патогенності збудників дизентерії та сальмонельозу можуть бути їх адгезини, ступінь антилізоцимної та антикомплементарної активності.
Отримані дані щодо зростання вірулентності збудників ГКІ можуть бути використані для аналізу та прогнозу епідемічної ситуації, удосконалення системи епіднагляду і розробки нових протиепідемічних заходів.
Доведена необхідність проведення постійного динамічного моніторингу щодо чутливості збудників до антибактеріальних препаратів та фагів, що дозволить чітко визначати засоби та схеми індивідуальної оптимальної терапії, складати формуляр ефективних антибіотиків для окремих регіонів, доповнити існуючі протоколи і визначити загальну стратегію і тактику боротьби з ГКІ.
Розроблена математична модель ідентифікації ентеробактерій дозволяє спростити та полегшити мікробіологічну діагностику ГКІ і може бути використана в діяльності клініко-діагностичних лабораторій, насамперед під час проведення епідеміологічного моніторингу. Дана комп’ютерна програма впроваджена в роботу практичної бактеріологічної лабораторії Комінтернівської СЕС м. Харкова.

Особистий внесок здобувача

Проведено ретроспективний аналіз епідемічної ситуації захворюваності на ГКІ у Східному та Західному регіонах України. Виконано практичну та експериментальну частини роботи: здійснено аналіз і узагальнення даних історій хвороб та інформаційних матеріалів за останні та попередні роки щодо захворюваності на ГКІ, виділено збудники ГКІ, вивчено їх біологічні властивості (адгезивну, антилізоцимну та антикомплементарну активність) та порівняно отримані дані із біологічними властивостями музейних штамів, визначено чутливість мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів і бактеріофагів. Дисертант здійснив відбір критеріїв для створення комп’ютерної програми спрощеної ідентифікації ентеробактерій та внутрішньолабораторну апробацію самої програми, провів статистичну обробку результатів досліджень. Постановка мети, завдань та обговорення одержаних результатів проводилась спільно із науковим керівником.
Побудова математичної моделі та створення комп’ютерної програми спрощеної ідентифікації ентеробактерій здійснювались за допомогою консультацій професора Каца М.Д. та с.н.с., к.м.н. Деркач С.А., за що ми висловлюємо їм подяку.
У роботі використано архівну та звітну документацію, клінічний матеріал, наданий співробітниками Обласної дитячої інфекційної клінічної лікарні м. Харкова.

Апробація результатів дисертації

Основні наукові положення дисертації доповідались та обговорювались на науково-практичній конференції за міжнародної участі і пленумі Асоціації інфекціоністів України «Хіміотерапія та імунокорекція інфекційних хвороб» (м. Тернопіль, 30 травня-1 червня 2005 р.), Українському конгресі з питань антимікробної терапії (м. Харків, 2006 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції за міжнародної участі (м. Харків, 12 квітня 2006 р.), науково-практичній конференції за міжнародної участі «Експериментальна та клінічна ендокринологія: від теорії до практики (Шості Данілевські читання)» (м. Харків, 22-23 лютого 2006 р.), VIІ Міжнародній міждисциплінарній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми науки та освіти» (Харків-Сімеїз, 25 червня-2 липня 2006 р.), Національному з`їзді фармацевтів України «Досягнення та перспективи розвитку фармгалузі України» (м. Харків, 28-30 вересня 2005 р.), науково-практичній конференції «Пошук та розробка профілактичних і лікувальних протимікробних засобів, антисептиків, дезінфектантів та пробіотиків» (м. Харків, 20-21 листопада 2006 р.), ІІІ з’їзді мікробіологів Узбекистану (Ташкент, 9-10 листопада, 2005р.), науково-практичній конференції за міжнародної участі «Інфекції в практиці клініциста. Антибактеріальна та антивірусна терапія на догоспітальному та госпітальному етапах» (м.Харків, 27-28 березня 2008 р.).

Публікації

На тему дисертації опубліковано 18 наукових праць (3 одноосібно), у тому числі 8 статей у фахових виданнях, визначених ВАК України, 1 патент на винахід, 9 тез в матеріалах науково-практичних конференцій, з’їздах, конгресах та пленумах.

Обсяг і структура дисертації

Повний обсяг дисертації становить 144 сторінки машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, чотирьох власних розділів, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків. Робота ілюстрована 27 таблицями та 12 рисунками. Список використаних джерел викладено на 25 сторінках; робота містить 219 посилань, серед яких 180 – на українські та російські джерела, 39 – на роботи іноземних авторів.

Список литературы

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання щодо підвищення ефективності мікробіологічної діагностики гострих кишкових інфекцій.
1. Сучасний рівень захворюваності на ГКІ як у Східному, так і у західному регіонах України (на прикладі м. Харкова і м. Тернополя) залишається на досить високому рівні, хоча її показники не перевищують загальноукраїнські. За період із 1990 року по 2007 рік інтенсивні показники захворюваності ГКІ на Харківщині були дещо вищими, ніж на Тернопіллі (за винятком 1990р., 1994р. та 2003р.).
2. Захворюваність на шигельоз у вище зазначених регіонах має ряд особливостей. У м. Харкові дизентерія реєструється у 1,4-2,9 рази частіше, ніж на Тернопільщині. Більшість хворих в обох регіонах становлять діти віком до 14 років. У Східному регіоні домінує шигельоз Зонне, у Західному – має перевагу шигельоз Флекснера. Це вказує на необхідність постійного моніторингу рівня захворюваності на ГКІ як на території окремих областей, так і по Україні в цілому. Збір таких даних та їх аналіз можуть бути використані для підвищення ефективності профілактичних заходів.
3. Шигели, сальмонели та умовно-патогенні мікроорганізми (S.aureus, E.cloacae, P.mirabilis, K.pneumoniae), виділені від хворих на ГКІ дітей, мають різний ступінь прояву факторів патогенності: адгезивної, антилізоцимної та антикомплементарної активності. Існують внутрішньовидові відмінності збудників, виділених від хворих на дизентерію та сальмонельоз. Для більшості штамів S.sonnei характерна середня адгезивність та висока антикомплементарна активність, а для S.flexneri притаманна висока адгезивність (р