Музика Денис Васильович. Ортоміксовірусні та параміксовірусні інфекції дикої та сільськогосподарської птиці в Україні (епізоотологія, засоби діагностики та специфічної профілактики)

Краткое описание

Музика Денис Васильович. Ортоміксовірусні та параміксовірусні інфекції дикої та сільськогосподарської птиці в Україні (епізоотологія, засоби діагностики та специфічної профілактики).- Дисертація д-ра вет. наук: 16.00.03, Нац. акад. аграр. наук України, Нац. наук. центр "Ін-т експерим. і клін. вет. медицини". - Харків, 2015.- 578 с.

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР
ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ
ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

На правах рукопису

МУЗИКА ДЕНИС ВАСИЛЬОВИЧ

УДК: 619:616.98:578.831/.832:616-036.22-078:615.371:636.5+568.2

ОРТОМІКСОВІРУСНІ ТА ПАРАМІКСОВІРУСНІ ІНФЕКЦІЇ
ДИКОЇ ТА СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ ПТИЦІ В УКРАЇНІ
(ЕПІЗООТОЛОГІЯ, ЗАСОБИ ДІАГНОСТИКИ
ТА СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ)

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія, епізоотологія,
інфекційні хвороби та імунологія

ДИСЕРТАЦІЯ
на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук

Науковий консультант:
доктор ветеринарних наук,
професор, академік НААН
Стегній Б.Т.

ХАРКІВ - 2015

ЗМІСТ
С.
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ВСТУП
РОЗДІЛ 1
Огляд літератури 20
1.1 Ортоміксовірусні інфекції птиці 20
1.2 Параміксовірусні інфекції птиці 56
1.2.1 Ньюкаслська хвороба (параміксовірус птиці 1 серотипу) 57
1.2.2 Параміксовіруси птиці 2–9 серотипів 69
1.3 Сучасний стан діагностики орто- та параміксовірусних інфекцій птиці 72
1.4 Сучасний стан специфічної профілактики грипу 78
1.5 Сучасний стан специфічної профілактики ньюкаслської хвороби 86
РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ 90
2.1 ВІДБІР МАТЕРІАЛУ 90
2.1.1 Еколого-географічна характеристика місць відбору біологічного матеріалу від диких птахів 90
2.1.2 Відбір біологічного матеріалу від диких птахів 93
2.1.3 Відбір біологічного матеріалу від свійських птахів 97
2.2 Імунологічні дослідження 99
2.3 Вірусологічні дослідження 99
2.4 Експериментальна інфекція 103
2.5 Патоморфологічні та імуногістохімічні дослідження 105
2.6 Орто- та параміксовіруси, використані під час досліджень 107
2.7 Експериментальні серії вакцин і вакцинація сільськогосподарської птиці 108
2.8 Молекулярно-біологічні дослідження 112
РОЗДІЛ 3
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ 116
3.1 Епізоотологічний моніторинг орто- та параміксовірусних інфекцій серед диких та сільськогосподарських птахів 116
3.1.1 Імунологічний моніторинг грипу та ПМВ серед диких птахів 116
3.1.2. Вірусологічний моніторинг грипу та ПМВ серед диких птахів 136
3.1.3 Імунологічний моніторинг грипу та ПМВ серед сільськогосподарської птиці 182
3.1.4. Вірусологічний моніторинг грипу та ПМВ серед сільськогосподарської птиці 193
3.2 Вивчення біологічних і молекулярно-генетичних властивостей вірусів грипу та параміксовірусів, виділених від диких і сільськогосподарських птахів в Україні 203
3.2.1. Секвенування та філогенетичний аналіз геному параміксовірусів птиці різних серотипів, ізольованих від свійських і диких птахів в Україні 203
3.2.2. Секвенування та філогенетичний аналіз геному вірусів грипу, ізольованих від свійських і диких птахів в Україні 212
3.2.3. Вивчення біологічних властивостей вірусів грипу та параміксовірусів птиці 230
3.2.3.1 Визначення патогенності вірусів грипу, ізольованих від свійської птиці 230
3.2.3.2 Вивчення біологічних властивостей вірусів грипу, ізольованих від диких птахів 232
3.2.3.3 Дослідження здатності вірусів грипу, ізольованих від диких птахів, викликати захворювання у сільськогосподарської птиці 234
3.2.3.4 Вивчення патогенності параміксовірусів птиці 243
3.2.3.5 Дослідження здатності ізолятів ПМВ викликати захворювання у сільськогосподарської птиці 248
3.2.3.6 Визначення рецепторної специфічності та термочутливості вірусів грипу А та ньюкаслської хвороби 252
3.2.3.7 Вивчення антигенних властивостей вірусів грипу
та параміксовірусів птиці 259
3.2.4 Патоморфологічні та імуногістохімічні дослідження курчат, інфікованих вірусами НПГП 265
3.2.4.1 Патоморфологічні дослідження 265
3.2.4.2 Імуногістохімічні дослідження 271
3.3 Розробка та вдосконалення засобів специфічної профілактики орто- та параміксовірусних інфекцій птиці 288
3.3.1 Отримання виробничого штаму вірусу ВПГП 290
3.3.2 Накопичення вірусної сировини вірусу ВПГП 295
3.3.3 Вивчення стабільності інактивованих антигенів вірусу грипу та параміксовірусів 296
3.3.4 Удосконалення схеми специфічної профілактики сільськогосподарської птиці проти ВПГП H5N1 300
3.3.5 Вивчення стабільності антигенних властивостей інактивованої вакцини проти ВПГП за тривалого зберігання 312
3.3.6 Вивчення рівня антитіл та напруженості імунітету до вірусу грипу в сільськогосподарської птиці в залежності від рівня гемаглютинінів 314
3.3.7 Вивчення антигенних властивостей інактивованої вакцини проти ВПГП з гетерологічного штаму 318
3.4 Розробка та вдосконалення інактивованих асоційованих біопрепаратів орто- та параміксовірусів і вивчення їх антигенних властивостей 320
3.4.1 Розробка технології виготовлення інактивованої бівалентної вакцини проти ВПГП підтипів Н5 і Н7 та вивчення її антигенних властивостей 320
3.4.2 Розробка технології виготовлення інактивованої тривалентної вакцини проти ВПГП Н5, Н7 і НХ. 325
3.5 Розробка та вдосконалення засобів діагностики орто-
та параміксовірусних інфекцій птиці 334
3.5.1 Розробка технології виготовлення тест-системи «АвіФлуТест Н5N1» для виявлення антитіл до вірусу грипу Н5N1 334
3.5.2 Удосконалення технології виготовлення тест-системи для виявлення антитіл до вірусу грипу А підтипів Н1-Н14 340
3.5.3 Розробка технології очищення антигену вірусу грипу А для ІФА 346

РОЗДІЛ 4
УЗАГАЛЬНЕННЯ, АНАЛІЗ ТА ОБГОВОРЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ 355
ВИСНОВКИ 398
ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ 404
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 406
ДОДАТКИ 481

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

АТ – антитіла
ВПГП – високопатогенний грип птиці
ВНХ – вірус ньюкаслської хвороби
ВНДІЗТ – Всеросійський науково-дослідний інститут захисту тварин
ВПФ – вільні від патогенної флори
ВООЗ – Всесвітня організація охорони здоров’я
ГАО – гемаглютинуючі одиниці
ДКВМУ – Державний комітет ветеринарної медицини України
ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота
ЕЕР – екстра-ембріональна рідина
ЕЛД50 – ембріональна летальна доза, яка викликає загибель 50 % інфікованих ембріонів
ЕІД50 – ембріональна інфекційна доза, яка викликає інфікування 50 % ембріонів
ЗТ-ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція методом зворотної транскрипції
ІФА – імуноферментний аналіз
ІЦІП – інтрацеребральний індекс патогенності
кДНК – комплементарна дезоксирибонуклеїнова кислота
КЕ – курячі ембріони
КЛ – клоакальний змив
МЕБ – Міжнародне епізоотичне бюро
НПГП – низькопатогенний грип птиці
НХ – ньюкаслська хвороба
НФ – назофарингіальний змив
ОД – одиниці дії
О.щ. – Оптична щільність
ОФД – ортофенілиндіамін
п.н. – пар нуклеотидів
ПП – приватне підприємство
ПЗБ – Покровський завод біопрепаратів
ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція
ПМВ 1-9 – параміксовіруси серотипів 1-9
ПМ – патологічний матеріал
РНК – рибонуклеїнова кислота
РГА – реакція гемаглютинації
РН – реакція нейтралізації
РЗГА – реакція затримки гемаглютинації
РДП – реакція дифузної преципітації
РЗК – реакція зв’язування комплементу
СЧЗ – середній час загибелі
ТР – трахеальний змив
ТМБ – тетраметилбензидин
Ф – фекалії (зразки фекалій для вірусологічних досліджень)
ФСБ – фосфатно-сольовий буфер
DIVA – Differentiation of vaccinated and infected animals (система диференціації інфікованих тварин від вакцинованих)
НА
Н 1-15 – позначення гемаглютиніну підтипів 1–15 вірусів грипу
NА
N 1-9 – позначення нейрамінідази підтипів 1–9 вірусів грипу
LSAB-method – Labelled streptavidin-biotin method (метод міченого стрептавідин-біотину)
S/N – співвідношення оптичної щільності досліджуваної проби до оптичної проби негативного контролю в ІФА

ВСТУП

Актуальність роботи. На сьогоднішній день Україна є державою з розвиненим промисловим птахівництвом. Так, за даними Міністерства аграрної політики, Асоціації «Союз птахівників України», птахівництво України нині стрімко розвивається та має найкращі показники з-поміж інших галузей тваринництва. За приростом виробництва м’яса птиці Україна займає перші місця в світі та входить до списку 20 країн-лідерів, за обсягами виробництва харчових яєць посідає 13 місце [1]. Так, у 2013 р. в Україні зросло виробництво замороженого м’яса птиці для експорту на 91,4 %, до 136 тис. тон, у протилежність 2012 р., коли цей показник виріс тільки на 6 %. Що стосується свіжого або охолодженого м'яса, яке виробляється виключно для внутрішнього ринку, то в 2013 р. обсяги його виробництва також зросли на 6,8 %, до 732 тис. тон. На сьогоднішній день цей сегмент внутрішнього ринку майже на 100 % заповнений вітчизняними виробниками, тому українські виробники птахівничої продукції досить активно ведуть пошуки зовнішніх ринків збуту продукції – це країни Європейського союзу, а також Близького Сходу, загалом 45 країн світу. У 2013 р. деякі птахівничі господарства отримали дозвіл експортувати свою продукцію до країн ЄС. Вітчизняні птахівничі підприємства в 2014 р. можуть збільшити обсяг виробництва яєць до 19,28–19,38 млрд шт., що на 1,5–2 % більше, ніж в 2013 р., а обсяги виробництва сухих і рідких яєчних продуктів може зрости на 15-20 %. О. Бакуменко також відмітив, що в 2014 р. обсяги експорту яєць та яєчних продуктів з України збільшаться на 10–15 %, а географія експорту розшириться до 55-56 країн світу, тоді як в 2013 р. експорт здійснювався в 50 країн. Планується також розширити поставки вітчизняних яєць та яєчних продуктів до країн Європейського союзу [2].
У зв’язку з таким активним розвитком вітчизняного птахівництва виникає необхідність у забезпеченні його стійкого епізоотичного благополуччя. Це дозволить не тільки зберегти здоров’я птиці, а й забезпечити виробництво якісної та біобезпечної продукції птахівництва. Провідна роль у цьому належить ветеринарній службі та ветеринарній науці. Основними загрозами для галузі на сьогодні, які можуть суттєво вплинути на епізоотичну ситуацію, є інфекційні хвороби, у першу чергу особливо небезпечні. До цих інфекцій уся світова спільнота відносить інфекції, що спричиняються орто- та параміксовірусами, і саме тому основну увагу ветеринарні фахівці та науковці приділяють їх постійному моніторингу, вивченню біологічних властивостей збудників, розробці засобів специфічної діагностики та профілактики.
До ортоміксовірусних і параміксовірусних інфекцій відноситься цілий рід вірусних захворювань сільськогосподарської та дикої птиці, з яких особливе епізоотологічне значення мають грип, ньюкаслська хвороба та параміксовірусні інфекції птиці інших серотипів. Грип птиці та НХ є особливо небезпечними інфекційними вірусними хворобами за класифікацією Міжнародного епізоотичного бюро [3]. Ці захворювання можуть бути причиною величезних економічних збитків, пов’язаних із загибеллю або знищенням птиці, витратами на ліквідацію наслідків спалахів хвороб. Так, епізоотія грипу серед курей в Пенсільванії (США) у 1983 р., яка була спричинена вірусом з антигенною формулою H5N2, призвела до знищення 17 млн курей та економічних збитків у розмірі 61 млн доларів США. Під час епізоотії у Гонконзі в 1997 р., спричиненої вірусом H5N1, було знищено 1,5 млн свійських птахів. Епізоотія серед курей в 2002 р. у США, викликана вірусом грипу підтипу H7N2, призвела до загибелі 5 млн птахів і збитків у розмірі 150 млн доларів. Спалах грипу у Нідерландах в 2003 р. (вірус грипу Н7N7) – знищено та загинуло 30 млн. курей. Під час епізоотії, яка охопила майже увесь Євразійський континент та частину Африканського в 2005–2006 рр., було знищено приблизно 250 млн. голів птиці, економічні збитки сягнули 1 млрд доларів США. Загалом, починаючи з 1955 р., коли було ідентифіковано збудника грипу птиці, відбулося 30 епізоотій ВПГП в усьому світі [4 – 9]. На жаль з проблемою грипу в сучасному світі стикаються як високорозвинені країни, так і такі, що розвиваються [10 – 14].
На сьогодні епізоотична ситуація в світі щодо грипу птиці залишається складною. За останнє десятиріччя у світі зафіксовані різні за розмірами епізоотії, що були спричинені вірусами грипу підтипів H5N1, H7N3, H7N7, H9N2. Так, наприклад, що стосується ВПГП H5N1, то за даними Міжнародного епізоотичного бюро за період з 2006 по 2009 рр. кількість країн, в яких зареєстровано епізоотії ВПГП H5N1, в різні роки коливалась від 12 до 51 країни [15]. У 2013 р. у 7 країнах світу були зафіксовані випадки захворювання птиці на високопатогенний грип. Так, спалахи, викликані вірусом грипу підтипу Н7, були зареєстровані у Австралії (H7N2), Італії (H7N7), Мексиці (H7N3), а вірусом підтипу H5N1 – у Камбоджі, Китаї, Індії, В’єтнамі, Кореї. У січні 2014 р. дві країни заявили про випадки захворювання на ВПГП, а на прикінці року спалахи цього захворювання вже реєструвалися в Німеччині, Нідердандах, Великобританії, Італії. В Австралії захворювання було зумовлено вірусом грипу підтипу H7N2, а у Кореї – підтипом H5N8 [15].
Особливе занепокоєння міжнародної спільноти викликає той факт, що деякі віруси грипу, причому як високопатогенні, так і низькопатогенні, здатні викликати захворювання у людей. Так, високопатогенні віруси, такі як H5N1 здатні викликати дуже тяжкі захворювання у людей з дуже великою летальністю. За даними ВООЗ у період з 2003 по 2013 рр. зареєстровано 648 випадків захворювання людей вірусом грипу птиці H5N1, при цьому 384 людини загинули [16]. Що стосується низькопатогенних вірусів, то віруси підтипів H7N7, H7N2, H7N3, H9N2 викликали слабкі та середньої тяжкості захворювання у людей [17], але в 2013 р. вірус НПГП підтипу H7N9, не спричинив захворювання у курей, качок і голубів, а для людей виявився надзвичайно патогенним. Так, за даними ВООЗ на травень 2013 р., цей вірус викликав захворювання 131 людини, з яких 37 загинули [15]. На думку деяких вчених, віруси грипу птиці, в тому числі такі як H7N9, H5N1, можуть стати кандидатами в пандемічні віруси. Небезпека нових штамів вірусу грипу була яскраво доведена під час швидкого розповсюдження вірусу грипу H1N1. Швидкий розвиток подій призвів навіть до того, що ВООЗ оголосила про найвищу стадію пандемії в 2009 р. До речі, цей вірус є потрійним реасортантом, до складу якого входять гени вірусів грипу людини, свиней та птиці [18, 19]. Наведені дані свідчать про те, що грип на сьогодні має величезне епідеміологічне та епізоотологічне значення, що також доводить не тільки необхідність продовження його досліджень, а й їх поглиблення та розширення.
Що стосується ньюкаслської хвороби, то в епідеміологічному плані вона не має такого значення як грип. Вірус НХ спричиняє слабкі кон’юнктивіти у людей, які швидко проходять практично без лікування. Але ця хвороба має величезне епізоотологічне значення для птахівництва, тому що у разі виникнення може призводити до захворювання та загибелі великої кількості птиці, а як наслідок – до величезних економічних збитків [5]. Ця інфекція відома достатньо давно та, не дивлячись на широку програму вакцинації, яка застосовується у більшості країн світу, спалахи НХ реєструються щорічно у великій кількості [20]. За даними МЕБ за період з 2005 по 2014 рр. спалахи ньюкаслської хвороби були офіційно зареєстровані у 126 країнах світу [15].
Інфекції, що викликаються орто- та параміксовірусами птиці, мають велике значення та значний вплив на українське птахівництво. У нашій країні існують потенційні ризики виникнення та поширення цих захворювань, що зумовлені декількома факторами. Зокрема, це розвинене птахівництво, в якому достатньо великою є доля присадибних господарств з недостатнім рівнем біобезпеки та біозахисту. Крім того, географічне розташування України в межах головних шляхів міграції птахів з північної Азії та Європи до Середземномор'я, Африки та Південно-Західної Азії, де перехрещуються напрями прольоту птахів з Балтійського і Каспійського до Чорного та Середземного морів, із Західного Сибіру і Казахстану до Західної Європи та Північної Африки, а також сприйнятливі природні умови для цілорічного перебування диких птахів, створюють потенційні можливості для циркуляції збудників цих інфекцій та проникнення їх у птахівничі підприємства. Проблеми, до яких можуть привести ці інфекції, добре відомі українським фахівцям, тому що і грип, і ньюкаслська хвороба реєструвалися в Україні в період з 2005 по 2008 рр. [15, 21, 22]. Крім того, небезпека, пов’язана з орто- та параміксовірусними інфекціями птиці, зумовлюється відсутністю вітчизняних засобів моніторингу, діагностики, прогнозування та профілактики цих хвороб. У зв’язку з високою мінливістю вірусів грипу та ньюкаслської хвороби, здатності до мутацій та реасортацій виникає необхідність у наукових дослідженнях і розробці вітчизняних засобів діагностики та профілактики цих інфекцій на основі саме штамів, які циркулюють на території України. Що стосується ньюкаслської хвороби, то альтернативи вакцинації не існує. Вона використовується досить давно та багаторазово довела свою ефективність [23 – 26]. Що стосується грипу птиці, то вакцинація знаходиться на другому за пріоритетністю місці після заходів недопущення виникнення та поширення інфекції. Вона може бути використана, але лише з застосуванням інактивованих вакцин та суворим дотримання вимог МЕБ щодо їх застосування [27 – 29]. Не дивлячись на це, постійно виникає необхідність вдосконалення існуючих вакцин, для того щоб вони відповідали штамам, що викликають захворювання на даний момент.
Таким чином, зважаючи на надзвичайне соціально-економічне, епідеміологічне, епізоотологічне значення, наявність ризиків занесення грипу та параміксовірусних інфекцій птиці, актуальним є постійний моніторинг циркуляції збудників цих інфекцій як серед сільськогосподарської птиці промислових та присадибних господарств, так і в популяціях диких птахів різних екологічних груп, створення засобів специфічної діагностики та профілактики цих інфекцій на основі вітчизняних штамів, постійне вдосконалення та модернізація існуючих біопрепаратів з урахуванням епізоотичної ситуації та циркулюючих штамів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з тематичним планом наукових досліджень відділу вивчення хвороб птиці ННЦ «ІЕКВМ», у рамках галузевої програми «Здоров’я тварин, якість та безпека тваринницької продукції в Україні» у 2006–2010 рр., завдання «Вивчити звʼязок біологічних та екологічних властивостей збудників особливо небезпечних вірусних та бактеріальних інфекцій птахів з рушійними силами епізоотичного процесу» (номер державної реєстрації 1007U003192), «Розробити засоби діагностики, профілактики та лікування інфекційних хвороб сільськогосподарських і дрібних сільських тварин, птиці та риб на основі новітніх біотехнологій» (номер державної реєстрації 0107U011719), галузевої програми «Біологічна безпека і здоров’я тварин» у 2011–2015 рр., а саме «Вивчити еволюцію, екогеографію, епізоотологічні закономірності циркуляції особливо небезпечних та найбільш поширених вірусних хвороб птиці. Розробити концепції їх моніторингу, діагностики, профілактики та ліквідації на основі новітніх біотехнологій» (номер державної реєстрації 0111U000831), «Розробити систему епізоотологічного моніторингу, діагностики та прогнозування високопатогенного грипу птиці і ньюкаслської хвороби серед сільськогосподарської, синантропної та дикої птиці (номер державної реєстрації 0111U000833), завдання Міністерства аграрної політики України «Розробити та оптимізувати технології промислового виготовлення і провести виробничі випробування вакцин проти високопатогенного грипу птиці» (номер державної реєстрації 0107U008930), гранту Президента України для найталановитіших молодих учених № GP/F26/0168 «Епізоотологічний моніторинг високопатогенного грипу птиці та ньюкаслської хвороби у мігруючих та колоніальних птахів Азово-Чорноморського регіону України» (номер державної реєстрації 0108U008161).
Мета і задачі дослідження. Мета роботи — провести епізоотологічний моніторинг сільськогосподарської птиці промислових і присадибних птахівничих господарств, диких птахів різних видів та екологічних груп щодо орто- та параміксовірусних інфекцій, теоретично та експериментально обґрунтувати розробку, валідацію, впровадження сучасних вітчизняних засобів діагностики та специфічної профілактики цих інфекцій в Україні.
Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:
 провести епізоотологічний моніторинг диких птахів різних видів та екологічних груп, а також сільськогосподарської птиці промислових і присадибних птахівничих господарств у різних регіонах України за допомогою серологічних і вірусологічних методів щодо грипу підтипів Н1–Н16 і параміксовірусів 1–9 серотипів;
 вивчити особливості циркуляції орто- та параміксовірусів у популяціях сільськогосподарських і диких птахів, ізолювати збудників, дослідити їх біологічні, молекулярно-генетичні властивості та визначити походження ізолятів вірусів;
 вивчити патогенез грипу птиці у курей, інфікованих низькопатогенними вірусами, ізольованими від диких птахів;
 на основі результатів дослідження біологічних і молекулярно-генетичних властивостей ізолятів орто- та параміксовірусів, виділених в Україні, провести відбір перспективних штамів вірусів, які в подальшому можуть бути використані в якості виробничих;
 на основі вітчизняних епізоотичних ізолятів вірусу грипу розробити та удосконалити вітчизняні тест-системи для серологічної діагностики грипу у диких і сільськогосподарських птахів і провести їх порівняння із закордонними аналогами;
 розробити нові та вдосконалити існуючі технологічні підходи щодо створення вітчизняних моно-, бі- та тривалентних інактивованих вакцин для специфічної профілактики грипу птиці підтипів Н5, Н7 та НХ;
 вивчити особливості імунної відповіді у сільськогосподарської птиці різних видів і віку на введення моно-, бі- та тривалентних інактивованих вакцин проти грипу птиці підтипів Н5, Н7 та НХ за різних схем щеплення.
Обʼєкт дослідження: ортоміксовірусні та параміксовірусні інфекції сільськогосподарських та диких птахів.
Предмет дослідження: епізоотична ситуація щодо орто- та параміксовірусних інфекцій серед сільськогосподарських і диких птахів, біологічні та молекулярно-генетичні особливості збудників грипу та параміксовірусів, їх походження та філогенетичні зв’язки, технологічні аспекти виготовлення діагностичних тест-систем, моно-, бі- та тривалентних інактивованих вакцин проти грипу та НХ, патогенез, специфічний імунітет.
Методи дослідження: епізоотологічний, серологічні, вірусологічні, молекулярно-генетичні, імуногістохімічний, патоморфологічний, статистичний.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні проведений епізоотологічний моніторинг диких птахів різних екологічних груп 98 видів 29 родин 11 рядів щодо грипу різних підтипів і параміксовірусів різних серотипів, який дозволив установити широку циркуляцію, а також велике їх підтипове різноманіття (ізольовано віруси 15 з 16 відомих підтипів за гемаглютиніном 27 антигенних комбінацій, а також ПМВ 4 з 10 відомих серотипів). Більшість вірусів уперше ізольовано від диких птахів в Україні.
Уперше проведені молекулярно-епізоотологічні та філогенетичні дослідження ізолятів ВПГП, НПГП, ПМВ 1, ПМВ 4, ПМВ 6, ізольованих від свійських і диких птахів різних видів у 1992–2011 рр. в Україні, які довели велике генетичне різноманіття вірусів. За результатами філогенетичного аналізу встановлено зв’язки орто- та параміксовірусів, ізольованих в Україні, з вірусами із Західної та Центральної Європи, Росії, кавказького регіону, а також Азії. Уперше встановлено зв’язок українських ПМВ 1 і ПМВ 4 з вірусами з Центральної та Північної Африки. Уперше в Україні та Європі ізольовано вірус грипу підтипу Н15 з новою антигенною формулою Н15N7, а також установлено його зв’язок з вірусом із Західного Сибіру. Уперше доведена можливість інтродукції нових генетичних варіантів вірусів грипу та ПМВ в екосистеми України та Європи з інших географічних регіонів. У період першої
(2005–2006 рр.) та другої (2008 р.) хвиль епізоотії ВПГП в Україні ізольовано віруси ВПГП підтипу H5N1 від диких птахів, що дозволило підтвердити їх роль у поширенні збудника на території держави. Установлено, що віруси грипу, ізольовані від диких водоплавних і навколоводних птахів, за природного інфікування не спричиняють клінічного захворювання у курей, але наявність інфекційного процесу підтверджено результатами гістологічних та імуногістохімічних досліджень і присутністю АТ у сироватці крові.
Уперше в Україні розроблено та експериментально перевірено способи отримання вакцинних штамів вірусу грипу з польових епізоотичних ізолятів різної патогенності. На основі вітчизняних вакцинних штамів уперше розроблено підходи створення технології виготовлення багатокомпонентних (бі- та тривалентних) інактивованих вакцин проти грипу птиці підтипів Н5, Н7 та вірусу НХ. Вивчено динаміку формування специфічного імунітету до вірусів грипу та НХ у сільськогосподарської птиці різних видів, його тривалість, напруженість після щеплення різними моно-, бі- та тривалентними вакцинами. Розроблені оптимальні схеми застосування вакцин у птиці різних видів. Оптимізовано та вдосконалено схему специфічної профілактики ВПГП H5N1 із застосуванням інактивованої вакцини «АвіФлуВак-ІЕКВМ». Наукова новизна роботи підтверджена 8 патентами України на корисні моделі.
Практичне значення одержаних результатів. Для використання у наукових дослідженнях і виробництва діагностичних і профілактичних біопрепаратів запропоновані нові для України та інших країн Європи штами вірусу ВПГП та НПГП 15 підтипів, ПМВ 1, ПМВ 4, ПМВ 6, ПМВ 7. Розроблено методику селективного клонування епізоотичних польових ізолятів вірусів ВПГП та НПГП з метою отримання високопродуктивних виробничих штамів. За результатами лабораторних випробувань моно-, бі- та тривалентних інактивованих вакцин розроблено схему їх застосування для специфічної профілактики грипу птиці підтипів Н5, Н7 і НХ у сільськогосподарської птиці різних видів і віку. Удосконалено схему застосування вакцини проти ВПГП «АвіФлуВак-ІЕКВМ», яка забезпечує формування тривалого та напруженого імунітету у свійської птиці у присадибних господарствах. Розроблено технологію виготовлення та контролювання, а також нормативно-технічну документацію на біопрепарати: «Вакцина проти високопатогенного грипу птиці серотипу H5N3 інактивована емульсована» (ТУ У 24.4-00497087-049:2008), «Вакцина проти грипу птиці підтипів Н5 та Н7 бівалентна інактивована емульсована», «Вакцина проти грипу птиці підтипів Н5, Н7 та ньюкаслської хвороби тривалентна інактивована емульсована».
Розроблено технології виготовлення та контролювання, а також нормативно-технічну документацію на тест-системи для серологічної діагностики грипу птиці: «АвіФлуТест Н5N1» тест-система для виявлення антитіл до вірусу грипу Н5N1 в РЗГА (ТУ У 24.4-00497087-052:2007), «Тест-система для виявлення антитіл до вірусу грипу А підтипів Н1–Н14 в реакції затримки гемаглютинації» (ТУ У 24.4-004970087-051:2008, нові ТУ У 21.2-00497087-148:2014), Тест-система для виявлення антитіл до вірусу грипу А імуноферментним методом «АвіФлуТест ІФА» (ТУ У 24.4-00497087-117:2014). Біопрепарати «АвіФлуТест H5N1» тест-система для виявлення антитіл до вірусу грипу H5N1 в РЗГА» та «Тест-системи для виявлення антитіл до вірусу грипу А підтипів Н1–Н14 в реакції затримки гемаглютинації» зареєстровані в Україні (реєстраційні посвідчення №№ 2743-14-0301-07 від 6.06.2007 р. та
ВВ-00568-06-13 від 29.07.2013 р. відповідно).
Особистий внесок здобувача. Огляд та аналіз наукової літератури за темою дисертації, вибір і планування напрямів досліджень, збір біологічного матеріалу, його вірусологічні та серологічні дослідження, розробка схеми експериментальних досліджень та їх проведення, аналіз отриманих даних, їх узагальнення та формулювання висновків проведено дисертантом особисто. Патоморфологічні та імуногістохімічні дослідження виконано у відділі патоморфології, біохімії та імунології ННЦ «ІЕКВМ» спільно із завідувачем відділу, к. вет. н. П. О. Шутченком. Молекулярно-генетичні дослідження проведено в лабораторії молекулярної епізоотології та діагностики ННЦ «ІЕКВМ» за участі завідувача, д. вет. н. А. П. Геріловича, к. вет. н. В. І. Болотіна, а також у Південно-Східній дослідницькій лабораторії з хвороб птиці (м. Атенс, шт. Джорджия, США) спільно з докторами М. Пантин-Джеквуд і К. Афонсо. Частина лабораторних досліджень стосовно розробки технології виготовлення інактивованих вакцин проти ВПГП та НХ (виділення збудника ВПГП, розробка регламенту інактивації, розробка технології виготовлення інактивованої вакцини, вивчення імунної відповіді у курей, проведення виробничих випробувань вакцини) виконана спільно з к. вет.н. А. Б. Стегнієм, к. вет. н. І. Ю. Бісюком, к. біол. Н. М. Ю. Стегній.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались, обговорювались і були схвалені на засіданнях вченої ради ННЦ «ІЕКВМ» (2006–2012 рр.) і на міжнародних науково-практичних конференціях і конгресах: «Високопатогенний грип птиці» (с. Новий Світ, 2006 р.), «Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології» (м. Феодосія, АР Крим, 2007 р.), з птахівництва (м. Судак, 2008 р.), міжнародному конгресі з ветеринарної медицини, присвяченому 85 річчю з дня заснування ННЦ «ІЕКВМ» (м. Харків, 2008 р.), «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики», присвяченій 550 річчю з часу заснування ЛНУВМ та БТ ім. С. З. Ґжицького (м. Львів, 2008 р.), «Моніторинг, прогнозування, діагностика та профілактика інфекційних хвороб тварин із використанням сучасних методів епізоотології, молекулярної біології та біотехнології» (м. Феодосія, 2009 р.), «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (м. Львів, 2009 р.), XVIth World Veterinary Poultry Association Congress (Marrakesh, Morocco, 2009 р.), V міжнародному ветеринарному конгресі з птахівництва (м. Москва, Російська Федерація, 2009 р.), «Сучасні системи біобезпеки та біозахисту у ветеринарній медицині» (м. Феодосія, 2010 р.), «Animal Husbandry, Veterinary Medicine and Economics in Rural Development and the Healthy and Food Safety Production» (Divčibare, Serbia, 2010 р.), 91st Annual Meeting of the CRWAD is dedicated to Dr. S. K. Maheswaran (Chicago, USA, 2010 р.), 4th Oxford International Influenza Conference (Oxford, UK, 2011 р.), 15th Annual Conference of the European Biosafety Association (Manchester, UK, 2012 р.), International Meeting on Emerging Diseases and Surveillance (Vienna, Austria, 2013 р.), «New Technologies in Contemporary Animal Production» (Novi Sad, Serbia, 2013 p.), 32nd Annual Meeting American Society for Virology (Pennsylvania, USA, 2013 p.), 14th International Conference of the Association of Institutions for Tropical Veterinary Medicine (Johannesburg, S. Africa, 2013 p.), XVIIIth Congress World Veterinary Poultry Association (Nantes, France, 2013 p.), Options for the Control of Influenza (Cape Town, S. Africa, 2013 p.), 5th ESWI Influenza Conference (Riga, Latvia, 2014 p.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 61 наукову працю, у тому числі 2 монографії, 24 публікації в наукових фахових виданнях України та інших держав, з яких 6 — за кордоном, а також 8 патентів України на корисну модель.
Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертації викладено на 344 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстровано 101 таблицею та 67 рисунками. Робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень, їх аналізу та узагальнення, висновків, пропозицій виробництву, списку літературних джерел, який містить 693 роботи, у тому числі 642 іноземних авторів, і додатків.

Список литературы

ВИСНОВКИ
1. У дисертації представлено результати досліджень, що підтверджують широку циркуляцію збудників орто- та параміксовірусних інфекцій серед сільськогосподарських, диких і синантропних птахів різних екологічних груп в Україні, вивчені біологічні та молекулярно-генетичні властивості, філогенетичні зв’язки вірусів, які доводять їх походження від вірусів, що циркулюють у Західній Європі, Західному Сибіру та Південно-Східній Азії. Вивчено патогенез, імунну відповідь, стан гуморального та клітинного імунітету в курей після інфікування польовими ізолятами грипу та ПМВ. Науково-експериментально обґрунтовано доцільність розробки вітчизняних засобів специфічної профілактики грипу та НХ за допомогою моно-, бі- та тривалентних інактивованих вакцин. Вивчено особливості формування специфічного імунітету в сільськогосподарської птиці різних видів після щеплення інактивованими моно-, бі- та тривалентними вакцинами проти ВПГП підтипів Н5, Н7 і НХ, які полягали в строках появи захисного рівня АТ, тривалості та напруженості імунітету. Розроблені та апробовані в лабораторних і виробничих умовах вітчизняні тест-системи на основі РЗГА та ІФА для діагностики грипу птиці.
2. Установлено серопозитивність диких птахів різних видів у
2006–2011 рр. до вірусу грипу підтипів Н1 Н14 та ПМВ 1 го, 2 го, 4 го та 6 го серотипів. У заповіднику «Асканія-Нова» АТ до вірусу грипу виявлені в
0,77–13,04 % проб сироваток крові та 3,57–12,5 % проб жовтків яєць, до ПМВ — у 0,77–10,0 % проб сироваток крові та 7,14–18,8 % проб жовтків яєць. У Чорноморському заповіднику в пташенят навколоводних птахів АТ до вірусу грипу та ПМВ не виявлено, але 4,54–23,07 % проб жовтків яєць містили АТ до вірусу грипу та 13,63–46,15 % — до ПМВ. У затоці Сиваш 3,03–40,0 % диких птахів були серопозитивними до вірусу грипу та 2,94–6,06 % — до ПМВ, у жовтку яєць 10,0–33,33 % диких птахів виявлені АТ до вірусу грипу та
20,00–66,66 % — до ПМВ. В АР Крим 14,27–57,14 % диких птахів у сироватці крові містили антитіла до вірусу грипу, в Одеській області 15,38 % — до збудника грипу та 23,04 % — до ПМВ, у Запорізькій обл. 1,61–17,74 і 20,96 % диких птахів були серопозитивними до вірусу грипу та ПМВ відповідно. У деяких особин диких наземних птахів у Сумській та Харківській обл. в жовтку яєць виявлені АТ до вірусу грипу підтипів Н1, Н2, Н5, Н8.
3. Результати серологічних досліджень курей промислових господарств свідчать про серонегативність щодо грипу птиці, а також про наявність у них напруженого імунітету до вірусу НХ. На птахофабриках Харківської, Луганської та Донецької обл. у 10,0–62,5 % курей виявлено антитіла до ПМВ 2, ПМВ 4, ПМВ 8, а у 8,6 % гусей — до ПМВ 4, що свідчить про циркуляцію цих збудників у минулому. У свійської птиці присадибних господарств виявлені значні коливання рівня АТ (0–1:128), напруженості імунітету до вірусу НХ
(0–100 %), а 10 % курей з Одеської обл. мали АТ до ПМВ 7, 40 % — до ПМВ 8, 30 % курей з Харківської обл. — до ПМВ 4, ПМВ 7, ПМВ 8, за результатами ІФА 22,22–62,5 % гусей з Миколаївської та Харківської обл. серопозитивні до вірусу грипу А (за допомогою РЗГА виявлені АТ до підтипів Н5, Н6, Н9, Н10, Н11), що доводить можливість циркуляції цих збудників.
4. Виділення 98 ізолятів вірусів, з яких 23 ізоляти ПМВ (4 з 10 відомих серотипів), 69 ізолятів вірусу грипу (15 з 16 відомих підтипів НА), 6 мікстів вірусу грипу та ПМВ, від 6 281 диких птахів 84 видів у 2006–2012 рр. доводить широку циркуляцію та велике антигенне різноманіття орто- та параміксовірусів у природному резервуарі в Україні. Отримано 27 антигенних комбінацій НА та NA, у тому числі H5N1 — від хворих і загиблих диких птахів під час епізоотії ВПГП, H5N2, H7N3, H7N6, H7N7 — від клінічно здорових диких водоплавних птахів. Підтверджено провідну роль диких птахів рядів Гусеподібні та Сивкоподібні в підтриманні циркуляції вірусів грипу. Найбільшу кількість ізолятів вірусу грипу (51) виділено під час зимівлі від птахів родин Качині (інфікованість — 1,11 %–5,33 %) та Мартинові (інфікованість — 3,44 %), 34 віруси — під час осінньої міграції від птахів родини Качині (інфікованість — 2,85–9,52 %), 13 ізолятів — під час весняної міграції, гніздування та післягніздових переміщень від диких птахів рядів Пірникозоподібні, Пеліканоподібні та Сивкоподібні (інфікованість —
0,76–10,0 %). Із 23 ПМВ, ізольованих від диких птахів рядів Сивкоподібні, Гусеподібні та Горобцеподібні, 12 (ПМВ 1, 4, 6) виділено під час осінньої міграції (інфікованість — 1,92–5,26 %), 11 (ПМВ 1, 4, 6, 7) — зимівлі (інфікованість — 0,93–8,33 %).
5. Доведено циркуляцію вірусу грипу та ПМВ серед сільськогосподарської птиці у присадибних господарствах, а також ПМВ — у популяціях синантропних птахів в Україні. Від сільськогосподарської та синантропної птиці виділено 23 ізоляти, з яких 5 ізолятів вірусу ВПГП підтипу Н5N1 — від курей, і 15 ізолятів серотипу ПМВ 1, з яких 8 ізолятів — від голубів з Харківської, Донецької, Дніпропетровської обл. та АР Крим, 1 — від грака з Харківської обл., 6 — від курей з Харківської та Івано-Франківської обл.
6. Установлено, що віруси ВПГП H5N1 від свійських і диких птахів, ізольовані в Україні у 2005–2008 рр., мали своє походження з Російської Федерації, Європи та належали до кладів 2.2 та 2.2.3. Вірус НПГП H5N2 топологічно розташований окремо від вірусів ВПГП та походить від вірусів НПГП із Західної Європи. Усі ізоляти вірусу НПГП H7N7, H7N3, H7N6, виділені в Україні, відносяться до однієї генетичної групи та споріднені з вірусами цього підтипу, ізольованими у 2010 р. в Грузії. Ізолят вірусу грипу підтипу Н3 споріднений з вірусами з Росії, ізоляти вірусу грипу підтипів Н4, Н8, Н9, Н11 — із Західної Європи, підтипу Н10 — із Західної Європи та Китаю, підтипу Н12 — з Південно-Східної Азії, підтипів Н13, Н15, Н16 — з Монголії та Росії.
7. За результатами філогенетичного аналізу показано, що більшість ПМВ 1 від диких, синантропних і свійських птахів належали до ІІ класу та тільки 1 вірус — до І класу. Патогенні віруси ПМВ 1, ізольовані від курей, належали до VII генотипу, споріднені з вірусами з Туреччини та Ізраїлю. Непатогенні віруси ПМВ 1 від свійських качок належали до І генотипу, споріднені з вірусами з Європи, від голубів, граків, побережників — до І та ІІ генотипів і споріднені з вакцинними вірусами НХ. Ізоляти ПМВ 1 від диких качок належали до ІІ генотипу та мали виражену спорідненість до непатогенних вірусів із Західної Європи, Центральної Африки, Росії, Китаю. ПМВ 4 від диких качок з Азово-Чорноморського регіону України споріднені з ПМВ 4 із Південної Африки, а ПМВ 6 має генетичні зв’язки з вірусами з Японії та Західної Європи.
8. Експериментальні дослідження характеризують віруси грипу підтипів Н4N6, Н5N2, Н6N2, Н7N3 та Н13N8 як низькопатогенні. Вони не спричиняють захворювання курчат за різних шляхів інфікування, але спричиняють напрацювання АТ у 60 % курчат за інтраназального інфікування та у 30–100 % курчат — за інтравенозного інфікування через 10–14 діб. У перші доби після інтраназального інфікування в курчат спостерігалося пригнічення імунної відповіді на рівні всіх субпопуляцій імунокомпетентних клітин CD4, CD8, а також клітин-продуцентів IgM, IgG, IgA та макрофагів, а, починаючи з 7 ї доби та до кінця строку досліджень, спостерігали різке підвищення активності цих клітин.
9. Визначено, що ПМВ 1, ізольовані від хворих курей, належать до велогенних вірусів (ІЦІП 1,61–1,56), від голубів і диких водоплавних птахів — до лентогенних (ІЦІП 0,00–0,61 і 0,00–0,06 відповідно). ПМВ 4 та ПМВ 6, виділені від диких водоплавних і наземних птахів, за ІЦІП (0,00) належать до непатогенних. Велогенні віруси НХ, ізольовані від курей, спричиняють захворювання у них за інтраназального та внутрішньомʼязевого інфікування з типовими клінічними ознаками та загибеллю протягом 4–5 діб. Лентогенний вірус ПМВ 1, ізольований від диких водоплавних птахів, не спричиняє захворювання в курей за будь-якого шляху інфікування, у 20 % курей, інфікованих внутрішньом’язово, у сироватці крові присутні АТ в титрі 1:16, а у вимушено забитої птиці реєструється тільки слабкий катаральний дуоденіт.
10. Доведено, що віруси грипу та ПМВ, ізольовані від диких, свійських і синантропних птахів, володіють різною термочутлівістю, рецепторною специфічністю й антигенною активністю. За температури 56–60 °С віруси ВПГП протягом 30–60 хв повністю втрачають здатність аглютинувати еритроцити півня. Більшість ПМВ стабільні протягом 7–10 хв, а два віруси втрачають гемаглютинуючі властивості вже через 2 хв. Віруси грипу та ПМВ здатні спричиняти аглютинацію еритроцитів 5 видів свійських птахів, 13 видів диких птахів, а також 4 видів ссавців. Інактивовані антигени вірусів грипу різних підтипів, ізольованих від диких і свійських птахів, є антигенно активними та здатними спричиняти напрацювання специфічних антитіл у титрах від 1:16–1:32 до 1:512–1:1024 за щеплення в суміші з ад’ювантами.
11. Експериментально відпрацьовані методики отримання та
клонування виробничих штамів вірусу з польових вірусів ВПГП, ізольованих
від хворих свійських птахів, а також вірусів НПГП, виділених від диких
птахів, що дозволило отримати високоактивні та високоспецифічні виробничі
штами з біологічною активністю високопатогенних вірусів
на рівні 9,0 lg ЕІД50/0,1 см3, 7,24 lg ЕЛД50/0,1 см3 і низькопатогенних —
7,5 lg ЕІД50/0,1 см3, 1,50 lg ЕЛД50/0,1 см3, а також титрами у РГА —
1:256–1:1024.
12. Удосконалена схема специфічної профілактики ВПГП з використанням вітчизняних засобів дозволяє забезпечити напружений імунітет тривалістю до 380 діб з рівнем АТ від 7,15 ± 0,37–8,24 ± 0,33 до 9,06 ± 0,24–9,15 ± 0,46 log2 у курей, щеплених у добовому віці за повторної одноразової вакцинації через 4–5 міс. Дослідження трансоваріального імунітету в курей після щеплення проти ВПГП виявило відповідність рівня АТ до вірусу грипу в жовтку яєць динаміці АТ у сироватці крові незалежно від дози вакцинації, причому максимальний їх рівень (від 8,10 ± 0,33 до 11,63 ± 0,19 log2) виявлено через 60–90 діб. Поглиблене вивчення імунної відповіді в дорослих курей протягом 150 діб після одноразового щеплення проти ВПГП дозволило оптимізувати схему вакцинації та дозволити повторення щеплення після зниження рівня АТ до 5,67 ± 0,81 log2.
13. Вивчення особливостей формування специфічного імунітету, його тривалості та напруженості в качок, гусей та індиків дозволило розробити схему вакцинації, яка забезпечує напружений імунітет у качок і гусей протягом 5 міс. з титрами АТ від 5,20 ± 0,26 до 8,70 ± 0,16 log2, а також 6 міс. — в індиків з титрами від 5,30 ± 0,27 до 8,40 ± 0,17 log2. Повторна вакцинація призводить до відновлення напруженого імунітету проти грипу птиці ще на 4 міс.
14. Експериментальним шляхом вивчено збереженість антигенних властивостей інактивованої вакцини проти ВПГП за температури 4 °С протягом 6–18 міс., та не встановлено при цьому суттєвих змін антигенних властивостей вакцини, щеплення якою спричиняє напрацювання специфічних АТ на рівні від 7,75 ± 0,48 до 10,80 ± 0,89 log2. Дослідження антигенних властивостей інактивованих вакцин проти грипу птиці виявило їхню залежність від рівня гемаглютинінів у антигенах, мінімальний рівень яких повинен бути 1:128, а оптимальний — не менше 1:1024–1:2048, що забезпечить напрацювання АТ після дворазового щеплення на рівні від 7,66 ± 0,44 до 9,0 ± 0,77 log2.
15. Експериментальними дослідженнями розроблено технології виготовлення вітчизняних інактивованих бі- та тривалентної вакцин проти грипу птиці різних підтипів і НХ. Вивчені особливості формування специфічного імунітету до кожного з компонентів у сільськогосподарської птиці різних видів. Інактивовані вакцини проти грипу птиці підтипів Н5, Н7 і НХ забезпечують короткотерміновий імунітет до 120 діб після дворазової вакцинації. Розроблена вакцина проти ВПГП з гетерологічного штаму H5N3 дозволить застосовувати DIVA-стратегію для контролю поширення цього захворювання серед свійських птахів.
16. На основі вітчизняних виробничих штамів розроблені діагностичні біопрепарати «АвіФлуТест Н5N1 для виявлення антитіл до вірусу грипу Н5N1 в РЗГА», «Тест-система для виявлення антитіл до вірусу грипу підтипів Н1 Н14 в РЗГА» з новими антигенами до вірусів грипу Н15, Н16, а також очищений і концентрований антиген тест-системи для виявлення АТ до вірусу грипу А в ІФА, що дозволяють проводити серологічну діагностику та визначення напруженості імунітету в птиці різних видів. Усі вітчизняні діагностичні тест-системи є високочутливими та специфічними, що доведено апробацією в лабораторних і виробничих умовах, а також участю в професійному тестуванні.