Шульга Збудники зеленої плісені (Trichoderma spp.) лікарського їстивного гриба шіі-таке /Lentinula edodes (Berk.) Pegl./ та біологічне обгрунтування заходів обмеження їх розвитку

Короткий зміст

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

            В огляді літератури висвітлено стан вивчення проблеми як в Україні, так і за її межами. Наведені дані щодо історії дослідження зеленої плісені шіі-таке, її морфологічних ознак, спеціалізації збудників роду Trichoderma, поширення, шкідливість та екологічні особливості хвороби. Подано інформацію про шляхи та причини поширення збудників зеленої плісені. Висвітлено сучасний стан заходів захисту їстівних грибів від хвороби.

            Аналіз джерел літератури показує актуальність теми дисертаційної роботи, підтверджує доцільність проведення досліджень, спрямованих на вивчення шкідливості зеленої плісені та заходів обмеження її розвитку.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Відбір зразків та експериментальні дослідження проводили в 2002-2004 рр. на спеціалізованих грибних підприємствах (грибівницях) з вирощування шіі-таке, які розташовані в Луганській, Миколаївській, Одеській, Херсонській, Хмельницькій, Київській областях та в м. Києві.

Видову належність грибів роду Trichoderma визначали за морфологічними ознаками (особливості будови міцелію, характер формування спороношення, розмір та форма фіалід, фіалоспор або конідій, хламідоспор, розгалуження конідієносців, колір колонії, ростові параметри) з використанням сучасних таксономічних підходів (Chaverri P., 2003). Для підтвердження результатів, одержаних традиційними методами для всіх штамів, проведено ідентифікацію методом PCR-аналізy за допомогою ITS послідовностей (Lava-Sanchez P. et al., 1972). ДНК виділяли з чистих культур Trichoderma spp., вирощених на сусло-агаровому середовищі, методом СТАВ за Gerrits van den Ende & De Hoog (1999). Провели порівняння отриманих результатів з даними GenBank sequences провели, використовуючи модифікацію пошукової системи Inte et BLAST - програму BlastN 2.1.1 Національного Центру біотехнологічної інформації Австрії (Dickinson M., 2003). Молекулярно-біологічна ідентифікація двадцяти трьох ізолятів грибів роду Trichoderma була проведена спільно з докторами біологічних наук Р. Пьодером та М. Кірхмайером у Мікробіологічному інституті Інсбрукського університету (Австрія).

Ступінь ураження субстратних блоків у виробничих умовах визначали візуально у відсотках від загальної площі за 5-бальною шкалою, розробленою співробітниками кафедри фітопатології Національного аграрного університету (А.П. Григанський та ін., 2002), де: 0 – ураження відсутнє, бал 1 – уражено 1-5% площі, бал 2 – уражено 6-25% площі, бал 3 – 26-50%, бал 4 – 51-75%, бал 5 – понад 75%.

            У дослідах з визначення швидкості росту L. edodes як щільне живильне середовище використовували нехмільне агаризоване пивне сусло. Вплив температури на ріст і розвиток Trichoderma spp. культуру гриба вивчали на живильних середовищaх КГА та Чапека в чашках Петрі за температур інкубування 15, 20, 25, 30 і 35°С. Для цього з краю колонії лабораторним свердлом вирізали  диски міцелію діаметром 5 мм і переносили в чашки Петрі (Петр С., 1978). Щоденно вимірювали радіус колоній та відмічали появу морфологічних структур – конідій. Зміни у морфології росту колоній досліджуваних штамів описували та фотографували.

            Вплив джерел вуглеводневого та азотного живлення на фізіологічні властивості грибів роду Trichoderma spp. досліджували на середовищі Чапека. Сахарозу середовища замінювали однією із досліджуваних сполук: глюкозою, ксилозою, порошковою целюлозою, розчинним крохмалем, мальтозою, фруктозою, лактозою.

            Дослідження взаємодії культур L. edodes і Trichoderma spp. при сумісному вирощуванні в парних культурах проводили за методикою Samuels G. et al. (2002).  Диск міцелію діаметром 5мм, 8-денної культури L. edodes був інокульований з краю 90 мм чашки Петрі, заповненої 15 мл 2%-го сусло-агарового середовища. Після 5-ти діб інкубації культури L. edodes середовище чашки Петрі інокулювали міцелієм 4-добової культури триходерми з використанням агарового диску, який розміщували з протилежного боку чашки Петрі на відстані 4 см від міцеліального диску L. edodes. Ріст культур обох видів досліджували при температурі 25±1 °С протягом 28 діб. Досліди проводили в п’яти повтореннях. Як контроль використовували чисті культури L. edodes та Trichoderma spp.

   Створення продуктивних і конкурентноздатних до збудників зеленої плісені сортів шіі-таке Риф та Адмірал було здійснено у співпраці із завідуючим відділом фітопатології та ентомології Селекційно-генетичного інституту УААН, м. Одеса, к.б.н. О.В. Бабаянц.

            Статистичну обробку результатів обліків і спостережень проводили за стандартними методиками за допомогою прикладного пакету Statistica 6.0. (Боровиков В.П., 2000; Kempton R., 1997). Для отриманих результатів розраховували середнє

арифметичне, його похибку та стандартне відхилення. Пошаровий розподіл досліджуваних ознак  на гомогенні групи проводили за тестом Дункана (Steel R., Torrie J., 1980).

Поширення, розвиток та шкідливість

зеленої плісені шіі-таке

            Результати фітопатологічних обстежень, проведених нами протягом 2002-2004 рр. у грибівницях з вирощування шіі-таке, засвідчили про значну розповсюдженість зеленої плісені. Однак показники поширення та розвитку останньої в різних грибних господарствах були неоднакові і залежали від ряду факторів. Вищу шкідливість хвороби спостерігали в грибівницях,  де для знезараження субстрату застосовували пастеризацію (при температурі 75 °С протягом 8-12 год.). Так, під час обростання субстрату (інкубації) на цих підприємствах  ураженість субстрату шіі-таке зеленою плісенню становила відповідно 44,0 та 77,3%, а ступінь розвитку – 21 і 46,7%. Найменші показники поширення (10,6 і 16%) та розвитку (1,5 і 2,3%) хвороби відзначено на підприємствах, де для знезараження субстрату використовували стерилізацію при 121°С протягом 2 год.

            На різних фермах втрати врожаю шіі-таке коливалися від 1% до 74%.         

            Як показали мікробіологічні аналізи зразків субстрату на основі дубової   тирси, після жорсткої стерилізації при температурі 121°C в умовах надлишкового тиску (1,2 атм) протягом 2 годин ефективність знезараження субстрату від мезофільної мікобіоти значно зростає. В зразках субстрату, які пройшли жорстку стерилізацію після термообробки (протягом 10 днів) знайшли лише бактерії роду Bacillus. Вибраковка субстратних блоків, приготовлених за такого режиму термообробки, становила 11,5±1,2%, що на третину менше ніж при пастеризації.

Діагностичні ознаки зеленої плісені шіі-таке

            У результаті спостережень за ростом і розвитком шіі-таке в закритому ґрунті було встановлено, що збудники зеленої плісені уражують даний гриб на всіх стадіях його виробничого циклу. Виявлено такі типи прояву хвороби: зміна забарвлення ураженого посівного міцелію та субстрату, некрози, муміфікація та гниль плодових тіл.

Характер взаємодії патогену з культивованим грибом значною мірою залежить від зайнятої ним початкової площі. Ступінь ураження субстрату зеленою плісенню буває настільки сильним, що може повністю пригнітити ріст міцелію шіі-таке.

            Досить часто міцелій шіі-таке при контакті з колонізованими триходермою ділянками формує бараж (коричневий валик чи лінія, утворені скупченням нерухомих повітряних гіф міцелію шіі-таке), який призупиняє подальше розростання Trichoderma spp. Таке відбувалось за умови колонізації міцелієм L. edodes понад 60% субстрату та порівняно нездночної ділянки, зайнятою зеленою плісенню. В такому разі міцелій шіі-таке не лише призупиняє подальше розповсюдження патогену, а й спроможний наростати на його колонії.

Видовий склад збудників зеленої плісені шіі-таке

            Видовий склад збудників зеленої плісені L. edodes визначали, відбираючи зразки ураженого субстрату та хворих плодових тіл із ознаками цього захворювання. З використанням мікроморфологічних та молекулярно-біологічних методів з’ясовано, що збудниками зеленої плісені в умовах України є гриби родів Trichoderma Pers.: Fr., Penicillium Link., Gliocladium Corda і Aspergillus Link. Серед них 86% від кількості отриманих ізолятів займають представники роду Trichoderma (рис. 1).

У результаті 3-х річних досліджень (2002-2004 рр.) нами встановлено видовий склад представників роду Trichoderma в грибівницях з вирощування шіі-таке (рис.2). Так, серед 37 ізолятів цього роду, 26 (70,3%) належали до T. harzianum  Rifai;  4 (10,8%) – до T. koningii Oudem; 2 (5,4%) – до T. viride Pers.: Fr.  і по одному (2,7%) були визначені як T. citrinoviride Bissett та T. hamatum (Bon.) Bainer. Три ізоляти (8,1%) ми не змогли віднести до жодного виду (Trichoderma sp.).

Вид T. harzianum був ізольований з уражених матеріалів, зібраних з усіх семи досліджених ферм по вирощуванню шіі-таке. Це свідчить про домінування та широке розповсюдження T. harzianum у культиваційних приміщеннях досліджуваних грибівниць.

Таким чином, нами встановлено, що серед мікроміцетів, які викликають зелену плісень при вирощуванні шіі-таке, домінують представники роду Trichoderma (86%), серед яких найбільш поширений вид T. harzianum (70,3%). Це було також підтверджено результатами молекулярно-біологічного аналізу виділених ізолятів триходерми.

Біолого-екологічні особливості видів

роду Trichoderma

Вивчення фізіологічних особливостей вегетативної та генеративної фаз розвитку грибів роду Trichoderma дозволяє проводити  науково обґрунтований  підбір умов культивування і контролювати розвиток даного патогену.

            Велике значення в біології триходерми та здатності до ураження нею субстратних блоків має притаманна їй особливість розвиватися в різному діапазоні температур. Було досліджено вплив температури на життєздатність та антагоністичну властивість збудників зеленої плісені. Спостереження за ростом та розвитком штамів T. harzianum Т5, Т10, Т13, Т19 проводили за різних температур у діапазоні від 15 до 35°С на середовищах: картопляно-глюкозному (КГА) і Чапека.

Установлено, що розвиток вищезгаданих штамів T. harzianum на обох типах середовищ можливий у широкому інтервалі температур – від 15 до 35°С з оптимальною швидкістю росту мікроміцетів у діапазоні останніх від 25 до 30°С. Склад середовища мав певний вплив на швидкість росту колоній зеленої плісені. Так, на середовищі Чапека загалом спостерігали уповільнення росту колоній усіх штамів T. harzianum порівняно з КГА. При цьому була зафіксована більша розбіжність у  швидкості міцеліального росту серед даних штамів на середовищі Чапека, ніж на КГА. Це виявлялося у значному варіюванні між максимальним та мінімальним радіусами колоній. Так, при температурі 25°С радіус колоній T. harzianum Т5 на середовищі Чапека досягав 29 мм, а T. harzianum Т19 – 60,35 мм. На середовищі КГА варіювання за даної температури було незначним. Радіуси колоній усіх досліджуваних штамів за температури 25°С становили 54,0; 53,25; 55,3; 51,6 мм відповідно, з максимальною різницею 1,65 мм.

            Таким чином, штами T. harzianum здатні рости в досить широкому діапазоні температур, але найінтенсивніший ріст відбувається при 25°С. Проте слід зазначити, що для T. harzianum Т10 найбільші радіуси колоній були зафіксовані при 30°С на цих середовищах (КГА та Чапека) і становили 54,4 і 64,35 мм за 72 год. відповідно. Найповільніші показники росту на обох середовищах мав штам T. harzianum Т5 за всіх досліджуваних температур. Усі інші штами триходерми змінювали свої ростові показники залежно від температури та складу середовища.

                 Від останнього залежала також оптимальна температура для міцеліального росту патогенів. Для штаму Т10 вона становила: на середовищі Чапека – 25°С, на КГА – 30°С, а для Т19 – відповідно 30 і 25°С; для Т13 найбільші показники росту на обох середовищах були зафіксовані при температурі 30°С.

                 Повний цикл розвитку штамів T. harzianum триває 3 доби. Початок різних фаз та їх тривалість у досліджених штамів має специфіку: поява ростової пори відбувається протягом 19,2-24,0 год., а масове утворення спор – через 61-72 години (при температурі 25 °С).

            При дослідженні впливу джерел живлення на інтенсивність росту міцелію та спороутворення T. harzianum було встановлено, що найбільша кількість конідій утворилась на середовищі з сахарозою як єдиного джерела вуглецю (10,8х10⁵ конідій на 1 см² міцеліальної плівки). На середовищах з крохмалем, мальтозою і фруктозою вихід конідій був нижчим у 38-94 рази порівняно зі сахарозою. Із джерел азоту ефективним був азотнокислий натрій (10,8x10⁵ шт./см²). Окрім нього, утворенню конідій дослідженого штаму сприяли середовища з глікоколом, аргініном і виннокислим амонієм: вихід конідій становив 2,9х10⁵; 2х10⁵; і  1,7х10⁵ шт./см² відповідно. Найменшу кількість конідій забезпечувало середовище із цистеїном як джерелом азоту. Вихід конідій при цьому був нижчий у 67 разів порівняно з азотнокислим натрієм і становив 1,6х10⁴ шт./см².

            За результатами дослідження можна зробити висновок, що введення до складу субстрату живильних додатків, багатих на сахарозу, лактозу і глюкозу (як джерел вуглецю) та NaNO₃, гістидину, аспарагіну і пептону (як джерел азоту) позитивно впливає на утворення конідій триходерми. Отже, при розробці субстратних формул з метою профілактики зеленої плісені слід уникати використання речовин, багатих на зазначені компоненти або планувати серію профілактичних заходів.

Особливості взаємовідносин in vitro

Trichoderma spp. та L. edodes

При вивченні характеру взаємовідносин штамів L. edodes і Trichoderma spp. в лабораторних і виробничих умовах було доведено, що гриби роду Тrichoderma проявляють різний ступінь антагоністичної активності стосовно міцелію їстівного культивованого гриба шіі-таке.

Результати досліджень показали, що за умов  сумісного  росту ізолятів Trichoderma spp. та штамів L. edodes перші виявляли антагоністичну дію лише після контакту колоній.

Згідно з нашими спостереженнями за ростом і морфологією 414 варіантів парних культур досліджуваних штамів грибів, були встановлені основні прояви взаємодії Trichoderma spp. та L. edodes. Вони характеризувались певними морфологічними ознаками колоній досліджених штамів і були розподілені за ними на три основні типи: ТВ-І, ТВ-ІІ, ТВ-ІІІ.

            Тип взаємодії ТВ-І характеризувався високою антагоністичною активністю Trichoderma, яка виражалась у повному пригніченні росту колонії шіі-таке відразу ж після контакту, з наступним наростанням колонії Trichoderma на колонію L. edodes протягом 4-5 днів. У багатьох випадках міцелій триходерми утворював концентричні ростові зони з більш щільно розміщеними гіфами в зовнішніх ділянках колоній (рис. 3). У гіфах шіі-таке часто спостерігали лізис клітин.

Тип взаємодії ТВ-ІІ. При середній антагоністичній активності Trichoderma відбувався обмежений ріст L. edodes з утворенням специфічної зони пригнічення червонувато-коричневого кольору шириною 5-6 мм (рис. 4).

Для типу взаємодії ТВ-ІІІ характерна низька антагоністична активність грибів роду Trichoderma. В перші дні взаємодії між досліджуваними грибами спостерігали гальмування росту шіі-таке порівняно з контролем. Через 3-4 дні на межі контакту колоній грибів утворювались досить чіткі міцеліальні валики L. edodes, що складались із скупчення міцеліальних тяжів, якими шіі-таке продовжував свій ріст на поверхні колонії Trichoderma (рис. 5). Таким чином, міцелій шіі-таке був спроможним обмежувати ріст деяких штамів Trichoderma spp.

            Найчутливішими до дії триходерми виявились штами L. edodes ІBК1627 та ІBК1628, при взаємодії з якими 90% усіх штамів Trichoderma spp. показали високу антагоністичну активність (ТВ-І). Найбільшу резистентність до дії грибів роду Trichoderma зафіксовано в таких сортів та штамів шіі-таке, як: Риф, Адмірал, ІВК 714, ІВК 1658.

Аналогічні результати з вивчення взаємодії різних штамів L. edodes з Trichoderma spp. також були отримані у дослідах з парною культурою на тирсовому середовищі, що відтворює умови промислового культивування шіі-таке.

            Таким чином, вивчення взаємодії між культивованим грибом шіі-таке та ізолятами роду Trichoderma, виділених із різних грибівниць України, дозволило встановити найбільш агресивні штами патогену: T. harzianum (Т2, Т8, Т10, Т11, Т19), T. hamatum (Т1), T. citrinoviride (Т21) та Trichoderma sp. (T22, T24).

            Спостереження за сумісним культивуванням штамів L. edodes з грибами роду Trichoderma показали, що прояви антагоністичної взаємодії двох організмів залежать від температури.

            Зростанню агресивності Trichoderma spp. щодо шіі-таке в більшості випадків сприяло підвищення температури інкубації субстратних блоків з 15 до 30°С. Але також, для деяких штамів, а саме: T. hamatum Т1, T. koningii (Т3, Т18),  T. harzianum (Т8, Т14) було відмічено зниження агресивності щодо L. edodes з підвищенням температури інкубації. При зміні температури в окремих випадках змінюється характер взаємовідносин між їстівним грибом і збудниками хвороби.

Вплив умов культивування на стійкість шіі-таке

до зеленої плісені

            Для обмеження проростання конідій та міцеліального росту Trichoderma spp. можна використовувати природну здатність культивованих грибів шіі-таке утворювати антибіотики та екстрацелюларні ензими, за допомогою яких вони руйнують клітинні стінки патогену, що діє в синергізмі з призупиненням колонізації ним субстрату (Schrimbock M. et al., 1994). На думку Samuels G. (1996), Tsuneda A., (1993), Trichoderma spp. і L. edodes мають здатність утворювати дані сполуки in vitro з  кількісною різницею між штамами, яка виникає під впливом умов навколишнього середовища.

На здатність L. edodes протистояти дії Trichoderma spp. впливає ряд факторів, які пов’язані з балансуванням між потенційними можливостями кожного антагоніста й умовами навколишнього середовища. Спроможність шіі-таке протистояти і навіть конкурувати з триходермою може бути відображенням вибору сприятливих для шіі-таке умов, таких як температура інкубації, вміст живильних домішок, рівень вологості, тривалість стерилізації субстрату, а також регулювання рівня кислотності та підбору мікроелементів.

Метою наших досліджень було виявити умови культивування, які підвищують конкурентноздатність шіі-таке щодо найбільш поширеного збудника зеленої плісені Trichoderma harzianum. Це має значення для розробки заходів захисту шіі-таке від зеленої плісені.