Мацкевич В.В. Удосконалені методи оздоровлення картоплі від вірусів та використання отриманого матеріалу в первинному насінництві

Короткий зміст

ЗВІЛЬНЕННЯ РОСЛИН КАРТОПЛІ ВІД ВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ ТА

 ПРИСКОРЕНЕ РОЗМНОЖЕННЯ ОЗДОРОВЛЕНОГО МАТЕРІАЛУ

(огляд літератури)

            У розділі подано результати досліджень  вітчизняних та зарубіжних вчених, стосовно особливості природи вірусної інфекції, її взаємовідносини в системі рослина живитель – патоген, методів звільнення від вірусів та прискореного розмноження оздоровленого матеріалу. На основі критичного аналізу окремих ланок технологічного процесу оздоровлення обґрунтована потреба і напрями його подальшого вивчення з метою удосконалення.

УМОВИ, МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили в лабораторних та польових умовах, в закритому ґрунті,  лабораторії клонального мікророзмноження Інституту картоплярства УААН протягом 1998-2003 рр.

Для визначення розподілу вірусів (М вірус картоплі,  Y вірус картоплі та їх комплексу) відбирали та індексували рослини сортів Кобза, Світанок київський з урахуванням фракційного складу та зон бульби за схемою: 1. Варіант - верхівка бульби  Ø > 60 мм; 2. Варіант - середина бульби Ø > 60 мм; 3. Варіант - пуповина бульби Ø > 60 мм; 4. Варіант - верхівка бульби Ø 30-60 мм; 5. Варіант - пуповина бульби Ø 30-60 мм; 6. Варіант - верхівка бульби Ø < 30 мм.

Після проходження цими бульбами термотерапії протягом 25-30 днів із них, аналогічно схемі відбору індексів відділяли паростки. З чотирьох зон кожного паростка: апікальної, верхівкової, медіальної та базальної, ізолювали під бінокуляром меристеми розміром до 200 мікрон.

Порівняння методів оздоровлення проводились на сортах Світанок київський і Кобза за схемою: 1. Варіант - культура меристеми в поєднанні з термотерапією (контроль).

2. Варіант - добір здорових рослин діагностованих імуноферментним аналізом (ІФА) і введення їх у культуру in vitro пазуховими бруньками. 3. Варіант - добір здорових рослин із застосуванням діагностики методом ІФА і введення їх у культуру in vitro стебловими живцями.

Контроль на наявність вірусів у рослинах проводили методом імуноферментного аналізу (твердофазний “сандвіч метод”). Реагенти для цього аналізу використовували фірми BOEHRINGER MANNHEIM. Кількісне визначення вірусних субодиниць проводили на  рідері Octeia при довжині хвилі l = 490 нм.

Визначення розподілу вірусної інфекції по зонах рослин  носіїв вірусів в умовах in vitro  здійснювали шляхом культивуванням живців методом накладання на штучному живильному агаризованому середовищі при 8-годинному фотоперіоді. З пробіркових рослин протягом 10 пасажів  відбирали живці 4 типів: 1 тип - перший зверху (верхівка);  2 тип – другий зверху; 3 тип – другий знизу;  4 тип – перший знизу. Після 1, 5 та 10 пасажів аналізували сік рослин на ІФА. Дослід проводили з рослинами сортів Пекуровська й Луговська, які були носіями М-вірусу картоплі (МВК) та рослинами-носіями SВК сортів Цезар, Діамант. Оздоровлені рослини in vitro цих сортів виступали як негативні стандарти.

 Вплив різноякісності вихідних рослин in vitro на процес регенерації визначали живцюванням пробіркових рослин сортів Косень-95 та Слов’янка методом накладання до 10  пасажу і отриманням із них регенерантів за наступною схемою: 1. Варіант - апікальний, 2. Варіант - медіальний, 3. Варіант - базальний. На 21 день росту стебла вимірювали висоту стебла і повторно живцювали. Облікових рослин 30, повторність трьохразова.

В полі матеріал розміщували в насінницькій сівозміні в умовах ізоточки. Захист рослин від перезараження проводили шляхом обробки їх афіцидами (Конфідор - 0,25-0,3 кг/га та Актара - 0,3-0,4 кг/га) через 10-14 днів. Схема посадки 70*35 см. Повторність трикратна. В період вегетації проводили 3 міжрядних обробітки з підгортанням.

РЕПРЕЗЕНТАТИВНІ ВИБІРКИ РОСЛИН В ДОСЛІДЖЕННЯХ З КАРТОПЛЕЮ В КУЛЬТУРІ IN VITRO

При дослідженні мікроклонального розмноження картоплі виникає потреба у встановленні такої кількості рослин, яка б була достатньою для достовірної оцінки впливу фактора, оскільки мала кількість не дає точних результатів, а велика потребує зайвих витрат часу і матеріальних затрат, особливо при значній кількості варіантів. В літературі не зустрічається конкретних рекомендацій з цього приводу. Тому при встановленні найменшої репрезентативної вибірки для кількісних показників ми провели окремі дослідження та розрахунки за формулою Г.Н. Зайцева  (М.: Наука, 1984):

,

де N – необхідний об’єм вибірки; D - допустима погрішність визначення середньої арифметичної (в нашому випадку 1 мм); t – критерій достовірності Стьюдента (при Р_0,95 t = 1,96, при Р_0,99 t = 2,58); s - середнє квадратичне відхилення; N₀ – чисельність генеральної сукупності.

Досліджувались фактори, які обумовлювали  зміну показників:  консистенція середовища (рідке і агаризоване) та сорт (Косень-95 і Віринея). Для встановлення оптимального об’єму вибірки проводили статистичний  аналіз основних показників і порівняння їх у різних за розміром вибірках.

Значення всіх ознак у дослідженні мало тенденцію групування навколо центру. Коефіцієнт варіації залежав  від ознаки та віку рослин у досліді і в більшості випадків не перевищував 20 відсотків. Установили, що помилка досліду суттєво зменшувалася із збільшенням вибірки рослин від 10 до 20. В подальшому при зростанні об’єму вибірки помилка зменшувалася більш поступово, а починаючи зі 100 рослин і до 500 зменшення її зовсім неістотне.

Тому для більшості досліджень картоплі в культурі in vitro репрезентативним об’ємом вибірки є 20 рослин. При врахуванні кількість відхилень (інфекція, калюс, “вітрифікація” та ін., що не входять в облік, і не перевищують 5–7 %) оптимальною на наш погляд кількістю є 30 рослин (вирощуваних у пробірках) на варіант при триразовій повторності в часі.

ЕФЕКТИВНІСТЬ ЗВІЛЬНЕННЯ  КАРТОПЛІ ВІД ВІРУСНОЇ 

ІНФЕКЦІЇ ТА ОЦІНКА ВИХІДНОГО МАТЕРІАЛУ

Особливості накопичення вірусів в вихідному для оздоровлення матеріалі. Концентрація вірусної інфекції у бульбах різного фракційного складу. В зоні досліджень найбільш поширеними та шкодочинними були М та Y віруси картоплі. Вплив шкодочинності вірусної інфекції протягом 1998-2000 рр. на зниження маси бульб  у кущі рослини картоплі при ураженні залежав від виду вірусу та особливостей сорту. Найбільший недобір урожаю відмічено при комплексному ураженні М та Y вірусами (по сортах: Світанок київський 75,7 %,  Кобза  57,1 %)

Для встановлення доцільності добору матеріалу за фракційним складом та зонами бульби при оздоровленні від вище вказаних вірусів, відібрані в полі покущево бульби від хворих (за даними ІФА) рослин проіндексували.

В проіндексованому матеріалі встановлено, що накопичення інфекції залежить від сорту. Так, бульби сорту Світанок київський порівняно із сортом Кобза, не залежно від розміру, містять в соку паростків меншу концентрацію вірусів. Оптична щільність соку з паростків бульб рослин-носіїв YВК сорту Світанок Київський становила від 0,316 до 0,423 оптичних одиниць,  при оптичній щільності рослин сорту Кобза від 0,576 до 0,624 оптичних одиниць. Ця закономірність зберігається і у випадку з МВК. Комплексне ураження призводить до зниження концентрації вірусів по окремо взятих вірусах.

Аналіз оптичної концентрації вірусів в соку  ростків  взятих з індексів не встановив закономірність у розподілі інфекції залежно від різноякісності бульб і не виявлено в межах окремо взятої бульби зони вільної від патогенів. У зв'язку з цим, при активному оздоровленні відбір ростків із врахуванням різноякісності бульб для виділення меристем не можна рекомендувати з метою підвищення ефективності оздоровлення.

Зміна концентрації вірусів по зонах бульби в процесі зберігання. При імуноферментному аналізі соку ростків отриманих із різних зон бульби, що проходили період природного спокою ізольовано і не ізольовано одна від одної, на рівні точності методу (ІФА) не виявлено перерозподілу вірусних частинок МВК та YВК між зонами бульби під час природного спокою. Так, концентрація вірусів  в ростках взятих з верхівки і пуповини бульби істотно не відрізняється.

Такий характер накопичення та розподілу вірусів по бульбах різного фракційного складу і по зонах бульби, не дозволяють розглядати заражену бульбу як об’єкт для пошуку напрямів оптимізації процесу оздоровлення. Доцільним є пошук здорової вихідної для оздоровлення рослини, або удосконалення методів звільнення зараженої рослини.

Вплив сукупної дії факторів на ефективність звільнення рослин від вірусів. При вивченні впливу різних фракції та зон бульб на ефективність оздоровлення, установлено,  що  вплив  такого фактору  відсутній  або  мінімальний  (0,1-0,4%). Також  не виявлено впливу (табл. 1) цього фактору на ефективність регенерації експлантантів  із меристем.  Так, вихід регенерантів з меристем по сорту Світанок київський лежить в межах 50 відсотків, по сорту Кобза 44 – 48 відсотків, незалежно від фракції бульби з якої відбиралися паростки для виділення меристем.

---

Конфідор, 20% в.р.к. (імідаклоприд) фірма “Байер АГ, Німечина.

Актара WG 25% в.г. (тіаметоксам) фірма “Сингента”, Швейцарія.

Розділ виконано спільно А.М. Широконосом (частка здобувача становить 60%).