СУДОВО-МЕДИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ НАКЛАДЕНЬ КЛІТИН СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ПОРОЖНИНИ РОТА НА ПОВЕРХНЯХ ЖУВАЛЬНИХ ГУМОК

Короткий зміст

У першому розділі виконано огляд сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури, присвяченої питанням визначення статевої та групової належності ізольованих клітин, виявлених під час досліджень речових доказів.

Аналіз літератури свідчить, що питання визначення статевої та групової належності ізольованих клітин залежно від впливу чинників зовнішнього середовища є одним із важливих у судово-медичній експертизі. Визначено перспективні напрямки для вирішення поставлених завдань.

У другому розділі викладено відомості про використаний матеріал та застосовані методи дослідження.

На початковому етапі роботи було поставлене завдання розробити методику вилучення та виявлення клітин СОПР в плямах слини із поверхонь використаних ЖГ. Матеріалом дослідження служили плями слини на різних зразках використаних ЖГ (Orbit (wild strawberry) sugarfee; Orbit (winters) sugarfee; Dirol (sweet cherry) + vitamin C; Dirol (strong mint) + calcium).

До приготування препаратів зі слідів слини, перевіряли якість фарби і методику на зіскобах букального епітелію осіб, які брали участь в експериментах. Для фарбування мікропрепаратів використовували методику, запропоновану Х.-П. Кінцль, В. Гібе, Х. Цитцмані, У. Кінцль (1977) для визначення статевої належності слідів слини на недопалках сигарет з малою кількістю клітинного матеріалу, тобто, методику двохмоментного визначення чоловічої та жіночої статі шляхом фарбування того самого препарату різними методами на Y- і Х - хроматин. Для цього, попередньо послідовно (паралельно до фарбування ЖГ) фарбували по 2 мазки букального епітелію жінок і чоловіків (які приймали участь в експериментах) і, переконавшись в чіткому виявленні статевого хроматину, переходили до досліджень слідів слини на експериментальному матеріалі – ЖГ.

Перед готуванням препаратів-мазків букального епітелію, особі, яка брала участь у дослідах, необхідно було 2-3 рази ретельно прополоскати рот дистильованою водою, для часткового видалення мікроорганізмів, потім скляним шпателем, або зашліфованим краєм предметного скла брали зіскоби букального епітелію і переносили на спеціально підготовлені предметні стекла.

Плями слини, в яких знаходилися клітини епітелію СОПР, готувалися в такий спосіб: особи чоловічої і жіночої генетичної статі у віці від 5 до 64 років (учасники експериментів) після триразового полоскання ротової порожнини дистильованою водою жували ЖГ, процес жування продовжувався до зникнення солодкого смаку ЖГ, що в середньому складало 10-15 хвилин. Після припинення процесу жування ЖГ, поміщали в чашки Петрі, які зберігали в різних умовах: частина в лабораторній шафі при температурі +18-20°С протягом 1,7,14,30,45,60,75 діб; друга частина знаходилася в термостаті, протягом 1,7,14,30,45,60,75 діб і піддавалися дії температури +35°С; третя частина знаходилася в умовах побутового холодильника при температурі +4°С, протягом 1,7,14,30,45,60,75 діб; четверта частина знаходилася в морозильній камері при температурі -18°С протягом 1,7,14,30,45,60,75 діб.

У лабораторії, в ході виконання дослідів, після візуального огляду ЖГ робили змиви з їх поверхонь 5-10% розчином оцтової кислоти, або ізотонічним розчином хлориду натрію за допомогою шматочку стерильної марлі розміром не більш ніж 0,5х0,5 см. Змиви із зовнішньої і внутрішньої поверхонь (із середини) ЖГ робили роздільно. Основна задача під час проведення змивів із поверхонь ЖГ, полягала в тому, щоб дана методика сприяла максимально повному вилученню клітинних елементів СОПР. Крім того, вона повинна бути простою у виконанні, тобто легко відтворюватися в умовах лабораторії. Під час розробки методики проведення змивів враховували такі фізичні властивості ЖГ , як підвищення її еластичності при температурі, близької до температури тіла людини в порожнині рота (+35-36,6°С). З огляду на вищевикладене, використані ЖГ прогрівали у термостаті при температурі +35-36°С протягом 3-5 хвилин, що у подальшому надало можливість проводити більшу кількість змивів із багатьох знов утворених поверхонь ЖГ, а отже і витяг клітинних елементів СОПР був максимальним. Це сприяло одержанню найбільш повної й об'єктивної інформації щодо визначення статевої та групової належності клітин СОПР.

Змиви із внутрішніх поверхонь (із середини) ЖГ робили так: за допомогою двох пінцетів жувальну гумку багаторазово піддавали розтягуванню, після кожного розтягування ЖГ зі знову утворених поверхонь робили змиви час обробки одного об'єкта 5-10 хвилин. Слід зазначити той факт, що під час розтягування ЖГ на їхніх внутрішніх поверхнях проглядалися крапельки вологи, тобто в середині (на внутрішній поверхні) ЖГ знаходилося рідка частина слини. Усе це дозволило зробити висновок про те, що клітини СОПР в середині ЖГ знаходяться у вологому середовищі. Після проведення змивів шматочки марлі поміщали в пробірки, отвір пробірки закривали пробкою із вати; витримували шматочки марлі із змивами в оцтовій кислоті або ізотонічному розчині хлориду натрію не менше 4-х годин (максимальний термін не регламентується) при кімнатній температурі (+18-20°С).

Вміст пробірки центрифугували 5 хв. при 1500 об/хв. Оцтову кислоту (або ізотонічний розчин хлориду натрію) відсмоктували під контролем ока пастерівською піпеткою, залишаючи незначну кількість надосадової рідини. Осад у вигляді краплі переносили на предметне скло. З кожного об'єкта готували по три мікропрепарати. Змиви із зовнішньої поверхні ЖГ позначали як об'єкт №1, а змиви з внутрішніх поверхонь – об'єкт №2.

Подальше приготування мікропрепаратів та облік результатів виконували відповідно до методичних вказівок «О судебно-цитологической диагностике половой принадлежности крови, слюны и волос по Y-хроматину» (1977) та «Судебно-цитологическая диагностика половой принадлежности слюны и волос по Х-хроматину»

(1975).

Групу рідкої крові за ізосерологічною системою АВО 152-х осіб, які приймали участь у дослідах, визначали за аглютинінами і аглютиногенами реакцією гемаглютинації в пробірках.

З огляду на дані про те, що категорія видільництва не впливає на факт виявлення антигенів ізосерологічної системи АВО в ізольованих клітинах реакцією «змішаної аглютинації» (Н.В. Еранов, 1970; М.Ш. Колыш, 1977), категорію видільництва осіб, які жували гумки, не визначали.

Визначення антигенів А, В і Н у пофарбованих гістологічних і цитологічних препаратах реакцією «змішаної аглютинації» проводили за методикою, опрацьованою А. П. Загрядською, С. В. Гуртовою і М. Ш. Колиш (1982). Для реакції «змішаної аглютинації» використовували ізогемаглютинуючі сироватки а-А та а-В різних серій у титрах 1:256 і 1:512. Для виявлення антигену Н застосовували екстракт бузини трав'янистої Sambucus ebulus L. двох серій у титрах 1:64 і 1:128.

Усі отримані результати статистично оброблялися на персональному комп'ютері з використанням ліцензованого пакета прикладної статистики StatSoft Inc. (1999) "Statistica for Windows". Для обробки статистичних даних застосовували класичні методи варіаційної статистики (розрахунок середніх величин, оцінка їхньої вірогідності), метод кореляційного аналізу (розрахунок коефіцієнта кореляції Спірмена). Для оцінки вірогідності розходження середніх величин використовували критерій Ст’юдента.

У третьому розділі наведені результати власних досліджень. У ньому послідовно викладено всі етапи виконання дослідів з визначення статевої належності клітин СОПР вилучених з використаних ЖГ.

Виконано 2091 експеримент різних серій, у процесі яких розроблена найбільш раціональна і ефективна методика вилучення клітин СОПР з поверхонь використаних ЖГ; з’ясована можливість визначення статевої належності клітин СОПР залежно від тривалості їх знаходження на предметі-носії і впливу деяких зовнішніх чинників (підвищеної вологості, температурних режимів, тривалості збереження). ЖГ із плямами слини на їхніх поверхнях зберігалися протягом 1,7,14,30,45,60,75 діб в умовах температури -18°С, +4°С, +18-20°С, +35°С. Щодня проводили визначення вмісту Y- і Х - хроматину в ядрах клітин СОПР в змивах із зовнішній і внутрішніх поверхонь ЖГ.

Виконано 209 експериментів для вивчення впливу матеріалу предмета-носія (ЖГ) на виявлення в клітинах епітелію СОПР статевого хроматину і антигенів ізосерологічної системи АВО.

Усього досліджено 4182 об'єкти, які готували зі змивів з поверхонь використаних ЖГ і 424 мікропрепарати зскрібків букального епітелію від 152 осіб (77 –осіб жіночої генетичної статі, 75 – осіб чоловічої генетичної статі), котрі в експериментах жували ЖГ.

Матеріалом дослідження служили плями слини на різних зразках використаних ЖГ: (Orbit (wild strawberry) sugarfee; Orbit (winters) sugarfee; Dirol (sweet cherry) + vitamin C; Dirol (strong mint) + calcium).

У результаті експериментів встановлено, що ці предмети-носії (ЖГ) не впливають на вилучення та виявлення клітин СОПР і не перешкоджають встановленню їх статевої та групової належності, тобто статева належність і антигени чітко визначалися незалежно від виду ЖГ.

Всі одержувані результати експериментів реєстрували в спеціальних протоколах і таблицях, які потім були піддані статистичній обробці.

У мікропрепаратах зі свіжоутворенних (від 1-2-х годин і до 3-х діб) плям слини (фарбування азур-еозином) в об'єктах №1 – змиви з зовнішньої поверхні ЖГ, виявлялося у середньому до 30-ти, а в окремих випадках - до 153-170-ти клітин, розташованих окремо, а також групами і шарами.

У мікропрепаратах з об'єктів №2 – змиви з внутрішніх поверхонь ЖГ у середньому виявлялося до 100 клітин, в окремих випадках - до 230-251-ї, розташованих окремо, або групами і шарами, це були клітини поверхневого та проміжного шарів епітелію. Також у препаратах зустрічалися без'ядерні клітини, «голі» ядра, присутність невеликої кількості змішаної (кокової і паличкової) мікрофлори. Дані про кількісні співвідношення клітин з ядрами в змивах з зовнішніх та внутрішніх поверхонь використаних ЖГ наведені в таблиці 1.