ФАРМАКОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ НОВИХ ПОХІДНИХ ГЕРМАНІЄВИХ СОЛЕЙ ДИФОСФОНОВИХ КИСЛОТ З БІОЛІГАНДАМИ

Короткий зміст

Матеріали та методи дослідження. Спрямований синтез нових БАР класу оксіетилідендифосфонатогерманатів здійснювали за методиками, розробленими на кафедрі загальної хімії і полімерів ОНУ ім. І. І. Мечникова під керівництвом з. д. н. т., проф. І. Й. Сейфуліної.

Фармакологічну активність трьох БАР вивчено на 185 білих нелінійних та лінії ICR мишах масою 18–20 г, 1310 щурах-самцях лінії Вістар молодого та статевозрілого віку масою 180–220 г, 15 безпородних кішках, 12 кролях породи шиншила, 19 морських свинках гладкошерстої породи масою 200–250 г віком 22–24 тижні. Досліди проводилися відповідно до вимог GLP, методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України [Стефанов О. В., 2001] та комісії з біоетики ОДМУ (протокол № 52В від 04.01.2008 р.).

Гостра токсичність БАР вивчалася при внутрішньоочеревинному (в/о) та пероральному введенні, підгостра — протягом 28 діб при в/о їх введенні; субхронічна та хронічна — відповідно 3 і 6 міс при пероральному шляху їх застосування за загальноприйнятими методами [Стефанов О. В., 2001]. Дослідження кумулятивних властивостей проводили за методом Ю. С. Кагана і В. В. Станкевича (1964), а також вивчали місцевоподразнювальну [Hayes A. W., 1989] та антигенну [Алексеева О. Г., 1988] дію.

Дослідження аналгезуючої активності проводилося на моделі «оцтових
кор­чів» за методом R. L. Wood et al. (1941). Протизапальну активність вивчали на моделі карагенінового і зимозанового набряків, які викликали субплантарним введенням 1 % розчину карагеніну і 2 % суспензії зимозану відповідно [Стефанов О. В., 2001]. Вводили БАР тваринам внутрішньошлунково (в/ш) за
1 год до застосування флогогенів дозою 25 мг/кг маси (ЛД₁₀ при в/ш прийомі).

Дослідження кардіовазотропної дії БАР in vitro виконано на ізольованих препаратах смужок папілярних м’язів міокарда морських свинок, а також груд­ного відділу аорти та ворітної вени щурів [Pegram B. L., 1980; Блаттнер Р. и соавт., 1989; Soloviev Ŕ. et al., 2003]. Вплив БАР на судинний тонус у гострому експерименті при їх одноразовому в/в уведенні дозами 1/10 ЛД₅₀ вивчався протягом 4 год класичним кров’яним методом у кішок на тлі барбітуратового наркозу (етамінал-натрію, 30 мг/кг, в/о) [Хилкин А. М. и соавт., 1979]. Визначався діастолічний (ДАТ) і систолічний (САТ) артеріальний кров’яний тиск (АКТ). Вплив синтезованих сполук на АКТ також вивчали на моделі артеріальної гіпертензії (АГ), яку спричиняли застосуванням протягом 4 тижнів дієти з високим вмістом натрію хлориду [Соколова Р. И. и соавт., 1977]. Вимірювали АКТ сфігмографічним методом на хвостовій артерії. Вводили БАР в/о дозою 1/20 ЛД₅₀. Оцінку протиаритмічної дії in vivo проведено на тлі аконітинової аритмії [Серединская Н. Н., 1989]. Реєстрували ЕКГ у II стандартному відведенні на
4-канальному електрокардіографі фірми "Simens". Уводили БАР в/о дозою 1/20 ЛД₅₀ у двох режимах: за 30 хв до введення аконітину (профілактично) і через 30 хв після його застосування (лікувально).

На тлі моделі міокардіодистрофії, яку спричиняли підшкірним введенням протягом 7 діб ізадрину з розрахунку 100 мг/кг маси з наступним 7-денним фізичним навантаженням [Стефанов О. В., 2001], вивчали вплив профілактичного та лікувального введення гермакорду дозами 1/10 і 1/20 ЛД₅₀ на метаболізм міокарда. У мітохондріях визначали вміст аденілових нуклеотидів (АН) [Jaworek D. et al., 1974]; аденілатний заряд виражали у вигляді коефіцієнта Аткінсона [Кресюн В. И., 1983]. Інтенсивність поглинання кисню (DО) мітохондріями серця щурів визначали манометричним методом з використанням апарата Варбурга [Umbreit W. W. et al., 1972; Кресюн В. И., 1983]. Убування неорганічного фосфору (Р_н) у пробах визначали за методом E. L. Lowry, J. A. Lopez (1946) у модифікації В. Н. Скулачева (1962). За одержаними величинами розраховували ступінь спряження окиснення та фосфорилювання (коефіцієнт співвідношення Р:О). Про АТФ-азну активність мітохондрій серцевого м’яза судили за зростанням у середовищі інкубації Р_н [Lowry E. L., Lopez J. A., 1946]. Для визначення активності Mg²⁺-АТФ-ази додавали 1 мМ уабаїну фірми "Sigma". Активність Na⁺, K⁺-АТФ-ази розраховували як різницю між активностями сумарної (Mg²⁺, Na⁺, K⁺-АТФ-ази) і Mg²⁺-АТФ-ази. Виділення мітохондрій та їх очищення проводили за методами [Прохорова М. И., 1982].

Для вивчення гепатопротекторної дії БАР здійснено адекватний вибір моделі токсичного гепатиту. Гепатити відтворювались одноразовим в/ш уведенням ССl₄ дозою 5 мл/кг маси тварин у вигляді 50 % масляного розчину [Watanabe A. et al., 1976] і в/о застосуванням галактозаміну дозою 400 мг/кг у вигляді 20 % водного розчину [Венгеровский А. И., Саратиков А. С., 1988]. Вибір моделі був здійснений на підставі дослідження морфофункціонального стану біомембран еритроцитів за показниками їх флуоресцентного зондування (ФЗ) за допомогою універсального — 1-анілінонафталін-8-сульфонат (1,8-АНС) і гідрофобного — N-феніл-1-нафтиламін (1-ФНА) зондів, а також показниками їх фосфоліпідної компоненти, морфологічними дослідженнями печінки і виживаністю щурів. Вивчення впливу БАР на виживаність проведено при кількох режимах в/о введення нікогерму і гермаміду у трьох дозах (1/10, 1/20, 1/40 ЛД₅₀): профілактичному (за 7 діб до введення ССl₄ та галактозаміну), лікувальному (протягом 7 діб після введення токсикантів) і профілактично-лікувальному (за 7 днів до і протягом 7 днів після введення гепатотоксинів). У подальшому всі дослідження гепатопротекторної актив­ності БАР проведені на тлі галактозамінового гепатиту при їх профілак­тично-лікувальному в/о введенні дозами 1/20 ЛД₅₀. Як референс-препарат викори­с­товувався гептрал виробництва "Abbott SpA" (Італія), який вводили в/о дозою 10 мг/кг маси.

З метою порівняльного вивчення ефективності компоненти синтезу нових БАР уводили в еквімолярній кількості відповідно до молекулярної ваги сполуки: нікотинову кислоту (1 % розчин для ін’єкцій в ампулах по 1 мл, ЗАТ «Фармацевтична фірма “Дарниця”», Україна) дозою 7 мг/кг; нікотинамід (1 % розчин для ін’єкцій в ампулах по 1 мл, ЗАТ «Биохимик», Росія) дозою 11 мг/кг; маг­ній (20 % розчин для ін’єкцій магнію сульфату в ампулах по 5 мл, ЗАТ «Фар­ма­цевтична фірма “Дарниця”», Україна) дозою 6 мг/кг; германій (1-гідро­гер­ман­тран, синтезований на кафедрі загальної хімії і полімерів ОНУ
ім. І. І. Меч­никова) дозою 9 мг/кг, ОЕДФ (2 % розчин етидронової кислоти,
фл. по 50 мл виробника «Мосхимфармпрепараты», Росія) дозою 9 мг/кг.

У сироватці крові та печінці визначалась активність маркерних ферментів: аланінамінотрансферази (АЛТ), аспартатамінотрансферази (АСТ), лужної фос­фатази (ЛФ), гамма-глутамілтрансферази (ГГТ) за допомогою наборів «Био-Ла-Тест» (PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехія). Паралельно в еритроцитах і гомогенаті печінки визначали вміст продуктів ПОЛ — дієнових кон’югатів (ДК) за методом В. А. Костюка і співавт. (1984), малонового діальдегіду (МДА) за методом И. Д. Стальной, Т. Г. Гаришвили (1977); одночасно вивчалась активність ключових ферментів антирадикального зихисту (АРЗ) клітини — супероксиддисмутази (СОД) за методом О. П. Макаревича, П. П. Голикова (1983) і каталази [Королюк М. А. и соавт., 1988], перекисна резистентність еритроцитів (ПРЕ) [Бенисович В. И., Идельсон Л. И., 1973], сумарна пероксидазна активність плазми крові (СПА) [Микаэлян Э. М. и соавт., 1984], вміст альфа-токоферолу за методом Р. Ш. Киселевича, С. И. Скварко (1972) у модифікації Н. К. Рудакової-Шиліної, Н. П. Матюхової (1982). Вміст загальних фос­фоліпідів (ФЛ) у ліпідних екстрактах, виділених з еритроцитів і тканини печінки, визначався методом Folch J. et al. (1957). Фракціонування ФЛ проводили методом одномірної висхідної тонкошарової хроматографії на пластинах [Крылов В. И. и соавт., 1975]. Вміст індивідуальних ФЛ — лізофосфатидилхоліну (ЛФХ), сфінгомієліну (СФМ), фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилета­нол­аміну (ФЕА) і фосфатидилсерину (ФС) — оцінювали шляхом «згорання» вмісту окремих фосфоліпідних плям з наступним визначенням ліпідного фосфору [Зубер В. Л., 1982]. Також визначали вміст загального холестерину (ХС) методом В. В. Меньшикова (1987) і розраховували коефіцієнт співвідношення ХС/ФЛ.

Вміст БАР в органах і тканинах щурів був визначений раніше за описаною у нашій лабораторії методикою при їх одноразовому в/о введенні з розрахунку 37,5 мг германію на 1 кг маси [Кресюн В. Й. і співавт., 2000; Відавська Г. Г., 2001]. Розрахунок параметрів розподілу БАР проводили з використанням методів позамодельного аналізу [Smith D. A. et al., 2000; Gueorguieva I. et al., 2004]. Площі під фармакокінетичними концентраційними кривими розраховували за методами трапецій і статистичних моментів [Соловьев В. Н. и соавт., 1980; Boroujerdi M., 2002]. Для розрахунків констант елімінації термінальної ділянки концентраційної кривої і констант рівноваги використовували лінійний регресійний аналіз зважених величин [Co ish-Bowden A., 2004]. Вивчення особливостей процесів розподілу та виведення БАР проводилося з використанням розроблених нами методів позамодельного аналізу.

Морфологічні дослідження тканин виконували з використанням стандартних методів контролю [Луппа Х., 1980]. Для визначення ліпідів зрізи забарвлювали суданом III і нільським блакитним; гістохімічне виявлення PAS-позитивних речовин проводили за допомогою методу А. Л. Шабадаша (1949). Гістологічні препарати досліджували методом світлової мікроскопії на мікроскопі "Carl Zeiss Axiostar plus" (Німеччина). Отримані зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення «ВидеоТесТ-Мастер Морфология» виробництва ООО «ВидеоТесТ» (Росія).

Усі отримані результати обробляли загальноприйнятими в медико-біологічних дослідженнях методами статистичного аналізу з використанням стандартних пакетів комп’ютерних програм [Лапач С. Н. и соавт., 2002].

Результати дослідження. Вивчені фізико-хімічні властивості синтезованих БАР їх позитивно характеризують: усі сполуки без специфічного запаху, є негігроскопічними, стійкими до температури, добре розчинними у воді.

Дослідження гострої токсичності показало, що синтезовані БАР належать до класу малотоксичних речовин: при в/о введенні ЛД₅₀ нікогерму становила 339,0 мг/кг, гермаміду — 560,5 мг/кг, гермакорду — 373,0 мг/кг. Результати вивчення токсичності при повторних введеннях, а також кумулятивних, місцевоподразнювальних й антигенних властивостей свідчать про нешкідливість син­тезованих похідних оксіетилідендифосфонатогерманатів.

Вивчення вазотропної активності синтезованих БАР. У дослідах in vitro на ізольованих препаратах грудного відділу аорти, які перебували у фазі скорочення в результаті аплікації розчину Кребса з підвищеним до 60 мМ/л вмістом іонів калію, встановлено, що вірогідний вазодилататорний ефект мав тільки гермакорд концентрацією 10^-4 М/л (у середньому на 38,3±5,2 % від максимальної амплітуди гіперкалієвої контрактури). На препаратах з інтактним ендотелієм додавання до буферного розчину гермакорду концентрацією 10^-5 М/л приводило до вірогідного зниження амплітуди скорочення — у середньому на 21,2±3,7 % від максимальної амплітуди скорочення, — спричиненого норадре­на­ліном. На тлі деендотелізації препаратів судин щурів вазодилататорний ефект гермакорду не реєструвався, що свідчить про його ендотелій-залежну при­роду. Важливо відзначити, що амплітуда спричиненого гермакордом розслаблення гладких м’язів була помітно більш виразною у м’язів, активованих хлористим калієм, ніж у судинних препаратів, активованих норадреналіном. Згідно зі ствердженням групи авторів [Lehen’ky V. et al., 2002], цей факт свідчить про те, що потенціал-керовані кальцієві канали у плазматичній мембрані гладком’язових клітин судин більш чутливі до вазодилататорних сполук, які синтезуються ендотелієм, ніж рецептор-керовані кальцієві канали, пов’язані зі звільненням внутрішньоклітинного депонованого кальцію.