МОРФОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВПЛИВУ МАГНІТНОГО ПОЛЯ ТА ЛАЗЕРНОГО ОПРОМІНЕННЯ НА РЕГЕНЕРАЦІЮ ПЕРИФЕРІЙНОГО НЕРВА

Короткий зміст

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні спостереження були проведені на 87 білих щурах вагою 150 – 200 г. віком 4 – 5 місяців. Згідно поставлених завдань, тварини були розподілені на 5 груп.

         Перша група – тварини, яким було проведено операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва (15 щурів);

         Друга група – 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію у червоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц.

Третя група включала 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію у червоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц.

Четверта група – 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц.

П’ята група включала 18 щурів, яким виконували операцію з моделювання стандартної травми периферійного нерва та проводили частотно модульовану магнітолазеротерапію у інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц.

Операція з моделювання стандартної травми периферійного нерва полягала у наступному: втручання проводили під тіопенталовим наркозом, який вводили інтраперитонеально в дозі 5 мг сухої речовини на 100г маси тварини (препарат розводили в ізотонічному розчині хлориду натрію). Оперативне втручання проводили в асептичних умовах за допомогою мікрохірургічного інструментарію під оптичним збільшенням 8^Х. Доступ до сідничого нерва виконувався на межі середньої та верхньої третини стегна за його проекційною лінією. Після обробки операційного поля розтинались м’які тканини, а потім тупо за допомогою затискача виділяли сідничий нерв. Останній пересікався лезом безпечної бритви у вищезгаданій ділянці на межі верхньої та середньої третини стегна.  Відрізки нерва співставляли на відстані 2-3 мм, а потім накладали епіневральні шви у кількості 2-3 атравматичною голкою з монофіламентною поліамідною ниткою 10/0 фірми Ethicon. Після проведення гемостазу рану ретельно зашивали, і дослідні тварини отримували однакове харчування згідно норм віварію і знаходились в однакових умовах.

Друга, третя, четверта і п’ята групи тварин підлягали аналогічній операції, після чого на наступний день їм проводилась черезшкірна частотно модульована магнітолазеротерапія на ділянку пошкодженого нерва в різних світлових спектрах та з різною частотою модуляції протягом 10 діб. З цією метою використовувався серійний прилад „МІТ-11” вітчизняного виробництва фірми НМЦ „Медінтех”. Цей апарат має свідотство про державну реєстрацію Державного департамента з контролю за якістю, безпекою та виробництвом лікарських засобів і виробів медичного призначення МОЗ України за № UA 1.003.0098031-05, виданий Державним комітетом України з питань технічного регулювання та споживчої політики. Особливістю цього приладу є те, що його магнітні індуктори поєднані з  лазерним випромінювачем в одному терміналі. Це дозволяє одночасно впливати магнітним полем (МП) і лазерним випроміненням (ЛВ) на необхідну ділянку.

Параметри, що передбачені в конструкції приладу:

-                                 напруга МП- до 100 мТл

-                                 потужність ЛВ- до 100 мВт

-                                 довжина хвилі ЛВ :

       - 0,67 мкм (червоний діапазон)

       - 0,78 мкм (інфрачервоний діапазон)

-    частота модуляції МП і ЛВ – від 1 до 100 Гц

Необхідна доза для проведення 1 сеансу МЛТ розраховувалась з відомою формулою :                                   t = (ES / P) K,

де t- час впливу, с; E- необхідна енергія для опромінення зони, Дж/см²; S- площа зони впливу, см²; Р- потужність лазерного випромінення, Вт; К- коефіцієнт віддзеркалення. Відповідно для ЛВ у червоному діапазоні спектра вона становила  4 хв., у інфрачервоному- 2хв. МЛТ проводилась на ділянку пошкодження нерва та проксимальний і дистальний його відрізки. Тваринам контрольної групи після пересічення і зшивання нерва МЛТ не проводилось.

Післяопераційні рани усіх тварин загоїлись первинним натягом. Летальних випадків тварин не було.

Тварин виводили з експерименту через 3, 6 та 12 тижнів за допомогою передозування препарату Тіопентал (25мг/100г) при інтраперитонеальному введенні та давали летальну дозу ефіру. Евтаназію експериментальних та контрольних тварин виконували згідно міжнародних нормативів гуманного ставлення до тварин [Добровольский Г.А.1984, Западнюк И.П., 1983, Методические рекомендации по представлению документации на лекарственные средства ФК Минздрава Украины, 1993].

         Розроблена методика ЧМ МЛТ передбачала:

-                     черезшкірний вплив на відрізки пошкодженого нерва та на місце їх зшивання МП та ЛВ у червоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц та 37,5 Гц (МП до 30 мТЛ, ЛВ – до 50 мВт, λ=0,67 мкм, частота блокування кальцієвих каналів, Ca²⁺) 

-        черезшкірний вплив на відрізки пошкодженого нерва та на місце їх зшиванням МП та ЛВ в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 9,4 Гц та 37,5 Гц (МП – до 30 мТл, ЛВ – до 50 мВт, λ – 0,78 мкм).

Матеріалом для дослідження були невроми, центральні (проксимальні) та периферійні (дистальні) відрізки пошкодженого нерва. Для світлової мікроскопії матеріал фіксували у 10% розчині формаліну, промивали та отримували зрізи на заморожувальному мікротомі, які імпрегнували азотнокислим сріблом за Рассказовою. Для вивчення сполучної тканини препарати забарвлювали азур II - еозином. Для морфометричного аналізу використовували напівтонкі поперечні зрізи нервів, виготовлені на ультратомі LKB  і забарвлені толуїдиновим синім.

У даному дослідженні визначали такі величини: об’єм волокон в об’ємі нерва (%), кількість нервових волокон в одиниці об’єму нерва, (мкм³), площу поперечного зрізу нервового волокна (мкм²), площу поперечного зрізу осьового циліндру (мкм²), товщину мієлінової оболонки (мкм²).

При статистичному аналізі морфометричних даних обчислювали середні значення величин, середнє квадратичне відхилення, похибку середньої, коефіцієнт варіації, коефіцієнт точності визначення середньої і відповідності до рекомендацій, які містяться у підручниках з математичної статистики [Лакин Г.Ф., 1973, Урбах В.Ю., 1964]. З метою оцінки співвідношення трьох типів мієлінових нервових волокон (за розміром), використовували непараметричний критерій Колмогорова-Смірнова. Для виявлення зв’язків у змінах площ поперечних зрізів мієлінового нервового волокна, осьового циліндру та мієлінової оболонки використовували кореляційний аналіз.  Препарати тонких і напівтонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери “Олімпус”.

Для електронномікроскопічного дослідження невеликі фрагменти дистальних відрізків нерва фіксували в 1%-му розчині чотирьохокису осмію за Колфілдом протягом 2-х годин при температурі +4°С. Об’єкти зневоднювали в етанолі зростаючих концентрацій, в ацетоні і заливали в суміш епону з аралдитом за загальноприйнятою методикою [Бирюзова В.И.,1963, Карупу В.Я., 1984]. Ультратонкі зрізи одержували на ультратомі LKB-8800 (Швеція) у поздовжній та поперечній проекціях нерва. Контрастували їх у 2%-му розчині уранілацетату в 70%-му етанолі протягом 15 хвилин і азотнокислим свинцем стільки ж часу, а потім зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ЭМВ 125К.

Результати досліджень та їх обговорення. Передумовою цього дисертаційного дослідження були пошуки нових засобів та методів лікувального впливу на процеси, які відбуваються у пошкоджених нервах, з метою стимуляції їх відновлення, що і наразі є однією з актуальних задач неврології та нейрохірургії. Інше, що спонукало нас на проведення даного дослідження, була відсутність інформації про вплив МЛТ на регенерацію пошкоджених нервів та наявність нових теоретичних розробок щодо дії МП і НІЛВ  на біологічні об’єкти.

З’явились фундаментальні наукові праці, які пояснюють взаємодію слабких МП з біологічними системами і доводять можливість впливу МП на структурні елементи атому (електрони, нуклони), мембрани живих клітин зі зміною їх проникності для найважливіших іонів (Na⁺, Ca²⁺, K⁺). В основі цієї взаємодії лежить принцип резонансу, тобто, при відповідній частоті зовнішнього МП можливий активний вплив на атоми, іони, тощо. Прикладом “резонансної взаємодії” фізичних факторів і деяких структур біологічного об’єкту є магніторезонансна томографія (МРТ) – одна з найбільш інформативних діагностичних систем.

Таким чином, вище наведені дані стали підставою для проведення експериментальних досліджень застосування ЧМ МЛТ при пошкодженні периферійних нервів з метою визначення параметрів МЛТ, які б давали найкращі результати.

         Використовуючи МЛТ з метою стимуляції регенерації пошкодженого нерва, ми звертали увагу на  процеси, які відбуваються у центральному відрізку, регенераційній невромі та дистальному відрізку. Особливо цікавим було те, як впливає МЛТ на процеси дегенерації, оскільки вчення про дегенерацію нервового волокна, відокремленого від свого трофічного центру – тіла нейрона, сформувалось ще у 1850р. завдяки класичним роботам A. Waller, який описав патологоморфологічну картину дегенерації периферійного відрізка нерва.

         Через 3 тижні після операції та проведення МЛТ у проксимальних відділах пошкоджених нервів в усіх експериментальних групах спостерігаються ретроградні дегенеративні зміни та помірні прояви подразнення нервових волокон. Епіневрій потовщений, щільність капілярів у ньому збільшена, венули дещо розширені та переповнені кров’ю. Нервові волокна мають деякі нерівності контурів, зустрічаються місця, де вони гіпо- чи гіперімпрегновані. Ступінь вираженості  цих змін у 5 групі тварин значно менший, ніж у тварин інших експериментальних груп. Крім того, звертає на себе увагу поява у проксимальному  відрізку нерва тварин 5 групи більшої кількості тоненьких регенеруючих волокон і зменшення загальної інфільтрації.

Регенераційна неврома у цей термін дослідження містить малодиференційовану сполучну тканину з великою кількістю фібробластів, макрофагів та тучних клітин. Колагенові волокна сполучної тканини помірно потовщені, а сама сполучна тканина виглядає більш однорідною. Рідше зустрічаються мало- та безсудинні зони. Звертає на себе увагу збільшення кількості регенеруючих нервових волокон. Затримані колби росту та спіралі Перрончіто спостерігаються відносно рідко. Визначається рівномірність кровопостачання невроми і більш упорядковане розташування нервових волокон, переважна більшість яких розміщується вздовж осі нерва.

У периферійному відрізку нерва через 3 тижні відмічається наявність овоїдів менших розмірів, що, на нашу думку, свідчить про більш швидкий перебіг процесів дегенерації. Виявляється проліферація нейрофіламентів і формування бюнгнерівських стрічок. Дані процеси співпадають з описаними в літературі. Нечисленні регенеруючі нервові волокна, кількість яких у тварин 5 групи є значно більшою, ідуть з центрального відрізку нерва у периферійний переважно прямолінійно. За рахунок збільшення кількості та гіпертрофії нейролемоцитів збільшується діаметр бюнгнерівських стрічок.

Через 6 тижнів після операції та проведення МЛТ  у проксимальному відрізку нерва відмічається більше клітинних елементів у сполучнотканинних структурах, що, як ми думаємо, пов’язане зі стимуляцією їх проліферації МЛТ. Значно менша кількість аргірофільних включень  у цитоплазмі нейролемоцитів свідчить про зменшення кількості продуктів деструкції передіснуючих нервових волокон. Безпосередньо біля місця травми можна спостерігати слабко виражені явища подразнення нервових волокон та поодинокі розширені інтраневральні судини.

         У ділянці регенераційної невроми, у цей час, сполучна тканина більш зріла, і в ній міститься велика кількість колагенових волокон і небагато фібробластів макрофагів та тучних клітин. Через ділянку рубця проходять численні новоутворені нервові волокна, кількість яких у 5 експериментальній групі найбільша. Переважна більшість волокон направлена вздовж осі нерва і тільки деякі з них втрачають поздовжню орієнтацію  і прямують до периферійних відділів невроми. Кількість спіралей Перрончіто тут значно зменшується, але збільшується кількість аксонів з колбами росту. Відмічається збільшення діаметру регенеруючих нервових волокон.

У периферійному відрізку нерва виявляється збільшення діаметру бюнгнерівських стрічок. Продуктів деструкції передіснуючих нервових волокон практично не відмічається. Регенеруючі нервові волокна, кількість яких значно збільшується, особливо у тварин 5 групи, розміщується за ходом тяжів нейролемоцитів, які сформувались у периферійному відрізку нерва.

Через 12 тижнів після початку експерименту у проксимальному відрізку нерва тварин 2, 3, 4 та 5 груп спостерігаються морфологічні особливості будови, близькі до таких, які описані іншими дослідниками у сідничому нерві інтактних тварин. Звертає на себе увагу дещо більша кількість фібробластів та тканинних базофілів у ендоневрії та деяке потовщення останнього. За рахунок збільшення діаметру осьових циліндрів нервові волокна потовщуються, а кількість нейролемоцитів у них збільшується.

При аналізі даних, отриманих при дослідженні експериментального матеріалу у 2, 3, 4 та 5 групах тварин, з’ясувалось, що під впливом МЛТ у різних діапазонах та з різною частотою модуляції у процесах відновлення пошкодженого нерва відбуваються майже однакові позитивні зрушення, у порівнянні з 1 групою тварин. Але, слід зазначити, що дія МЛТ в інфрачервоному спектрі з частотою модуляції 37,5 Гц є найкращою.

Таким чином, у тварин усіх експериментальних груп темпи дегенерації передіснуючих нервових волокон на ранніх стадіях відновлення пошкодженого нерва практично однакові. Але на більш пізніх термінах вони значно прискорюються, і особливо це проявляється у тварин 5 групи.

Кількісний аналіз структурної перебудови тканинних елементів, їх композиції та зв’язків, що відображено на рисунках 1, 2, 3, 4, 5, дає переконливий матеріал для побудови системи доказів характеру морфологічних змін і пов’язаних з ними характеру функціональних процесів.

Морфометричні підходи обумовлюють стандартизацію методів відбору  типів їх обробки, математичного аналізу вимірювань. Крім того, отримані кількісні показники дають змогу порівнювати їх з даними літератури та екстраполювати результати на інші моделі дослідів та на людину, а також суттєво доповнюють морфологічну та електронномікроскопічну картини.