ГЕМОСТАТИЧНА АКТИВНІСТЬ СУХОГО ЕКСТРАКТУ З ПАГОНІВ ОЖИНИ СИЗОЇ

Короткий зміст

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні досліди виконані на 36 білих нелінійних статевозрілих мишах масою 18-20 г, 1366 білих нелінійних статевозрілих щурах масою 180-220 г, 66 мурчаках масою 500-550 г, 18 кроликах масою 2,5-3,0 кг. Тварини вирощені у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ згідно з санітарно-гігієнічними нормами та вимогами GLP. Робота з тваринами проводилась згідно з міжнародними вимогами про гуманне ставлення до тварин та з дотриманням вимог директиви 86/609/ЕЕС з питань захисту тварин «Европейская конвенция защиты позвоночных животных, которые используются с экспериментальными и другими целями» (Страсбург, 1986), комісії з біоетики НфаУ (протокол № 2 від 15.04.2004 р.), а також згідно з методичними рекомендаціями „Доклінічні дослідження лікарських засобів” (О.В. Стефанов, 2001). Всі експериментальні дослідження були проведені на базі ЦНДЛ НФаУ.

Предмет дослідження – сухий екстракт (субстанція) з пагонів ожини сизої – це  гігроскопічний порошок ясно-брунатного кольору, розчинний у воді і нижчих спиртах. Сухий екстракт з пагонів ожини сизої має такий кількісний вміст БАР: білково-полісахаридного комплексу (БПСК) – 2,52%, поліфенолів – 5,39%, флавоноїдів – 0,8% (О.А. Гісцева, В.М. Ковальов,     Т.О. Краснікова, 2005).

Аналіз хімічного складу підтвердив дані літератури про те, що сухий екстракт з пагонів ожини сизої є сумою дубильних речовин, флавоноїдів, гідроксикоричних і гідроксибензойних кислот, вітамінів С, Р, Е і F, що дозволило передбачити наявність у сухого екстракту з пагонів ожини сизої гемостатичної активності.

На першому етапі досліджували здатність сухого екстракту з пагонів ожини сизої прискорювати згортання крові тварин. Для цього визначали час появи перших ниток фібрину в краплі крові (метод Альтгаузена, 1988) від тварин, яким однократно внутрішньошлунково вводили засіб в дозах 7 мг/кг, 12 мг/кг і 17 мг/кг.

У цьому досліді та в тих, що описані далі, дію досліджуваного засобу порівнювали з препаратами порівняння – ε-амінокапроновою кислотою та рідким екстрактом грициків звичайних  в умовноефективних дозах, які були перераховані з добової дози для людини з використанням коефіцієнту видової стійкості по Ю.Р. Риболовлєву (Ю.Р. Риболовлев, 1979). Були використані такі препарати: “Кислота амінокапронова” (порошок per os, 1г, ФФ “Здоровье” (Харків)) та «Грициків екстракт рідкий» (екстракт рідкий для перорального застосування, спиртовий по 25 мл у флаконах, ВАТ "Фітофарм", м. Артемівськ, Донецька обл.).

Гемостатичну дію сухого екстракту з пагонів ожини сизої в інтервалі доз 3-17 мг/кг вивчали на експериментальній моделі паренхіматозної кровотечі з різаної рани печінки у щурів (Thienes et al., 1957). За результатами цього експерименту  розрахували ефективну дозу сухого екстракту з пагонів ожини сизої за методом Б.М.Штабського і співавт. (1980).

Дослідження механізмів гемостатичної активності сухого екстракту з пагонів ожини сизої включало визначення впливу досліджуваного засобу на активність судинно-тромбоцитарного та коагуляційного гемостазу, стан внутрішнього та зовнішнього механізмів згортання крові, а також здатності гальмувати активність протизгортаючих факторів.

Вплив сухого екстракту з пагонів ожини сизої на судинно-тромбоцитарний гемостаз визначали за тривалістю кровотечі з поверхневих мікросудин шкіри, після порушення їхньої цілісності (модифікований метод Д’юка). Для визначення кількості тромбоцитів у периферичній крові щурів використовували спосіб Джавадяна (1980). Спонтанну агрегацію тромбоцитів вивчали  якісним макроскопічним методом (В.В. Меньшиков, 1987;          Л.А. Данилова, 2003). Ретракцію кров'яного згустку оцінювали за методом Макферлейна (1939).

При дослідженні коагуляційного гемостазу визначали тромбіновий час за методом В.П. Балуди і співав. (1980). Визначення концентрації фібриногену в коагуляційних пробах плазми проводили за методом            Р.А. Рутберг (1961). Фібринстабілізуючий фактор (XIII) визначали уніфікованим прискореним методом В.П. Балуди (1980).

Здатність сухого екстракту з пагонів ожини сизої впливати на внутрішній механізм згортання крові оцінювали за часом появи перших ниток фібрину (метод Альтгаузена, 1988) та в мікрокоагуляційному тесті, який відображає динаміку утворення та інактивацію тромбіну (метод           З.С. Баркагана, 1980).

Показником впливу сухого екстракту з пагонів ожини сизої на зовнішній механізм згортання крові був протромбіновий індекс, який визначали уніфікованим методом Т.І. Герасименко зі співавт. (2002).

Стан протизгортаючих механізмів на тлі введення сухого екстракту з пагонів ожини сизої оцінювали на підставі вимірювання толерантності плазми до гепарину методом Т.І. Герасименко зі співавт. (2002).

Фібринолітичну активність крові досліджували за методом Е. Бідвел (1953). Концентрацію фібриногену визначали фотометрично. Продукти деградації фібрину у крові – неімунологічним методом по С.З. Габітову зі співавт. (1982) у пробі з протаміном сульфатом. Час лізису еуглобулінових згустків визначали уніфікованим методом Коваржика-Булука (1980).

Для вивчення ефективності сухого екстракту з пагонів ожини сизої при різних кровотечах досліджували його здатність зменшувати тривалість кровотечі на моделях різаних ран печінки за методом Thienes et al. (1957), нирок та матки, що одночасно дозволило підтвердити механізм дії засобу.

Гостру токсичність сухого екстракту з пагонів ожини сизої вивчали на двох видах тварин: нелінійних білих мишах масою 18-20 г і білих щурах масою 180-200 г обох статей при одноразовому внутрішньошлунковому та внутрішньоочеревинному шляхах введення (Л.Н. Сернов, В.В. Гацура, 2000; Т.А. Гуськова, 2003). Розрахунок середньої смертельної дози (LD₅₀) проводили за методом С.М. Штабського зі співавт. (1980). Клас токсичності визначали за загальноприйнятою класифікацією К.К. Сидорова (1973).

Можливу загальнотоксичну дію сухого екстракту з пагонів ожини сизої на органи і системи експериментальних тварин при тривалому використанні вивчали згідно з Методичними рекомендаціями ДФК МОЗ України          (О.В. Стефанов, 2001). При цьому оцінювали загальний стан тварин за динамікою їхньої маси і температури тіла та функціональний стан  органів і систем: центральної нервової системи (ЦНС), серцево-судинної системи (ССС), печінки та нирок. Функціональний  стан ЦНС досліджували за методом “відкритого поля” (Е.Н. Буркацкая, В.Ф. Бейер и др., 1980;           Т.А. Гуськова, 2003); функціональний стан ССС – за показниками електрокардіограми (И.А. Западнюк, В.И. Западнюк и др., 1983;                 Т.А. Гуськова, 2003). Склад периферичної крові визначали за кількістю еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, лейкоцитарною формулою; також визначали  вміст гемоглобіну, швидкість згортання еритроцитів (ШЗЕ) та швидкість згортання крові по Альтгаузену (В.В. Меньшиков, 1987). Функціональний стан печінки оцінювали за вмістом загального білка, та його фракційним складом, активністю цитолітичних ферментів АлАТ, АсАТ    (В.В. Меньшиков, 1987). Функціональний стан нирок – за наявністю білка в сечі, величиною рН та питомої ваги; вмістом залишкового азоту сечовини сироватки крові, що визначали уніфікованим діацетиламонієвокислим методом (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982; В.В. Меньшиков, 1987). Результати біохімічних досліджень були доповнені даними гістоморфологічного вивчення внутрішніх органів тварин (О.В. Стефанов, 2001).

Отримані результати досліджень оброблені статистично з використанням пакету прикладних програм “STATISTICA” на комп’ютері з програмним забезпеченням “Excel”, методів варіаційної статистики          (С.М. Лапач, 2001; Г. Стентон, 2001). Вірогідність даних оцінювали, використовуючи критерій Ст’юдента t (В.І. Сергієнко, І.Б. Бондаренко, 2000; О.В. Стефанов, 2001). Аналіз результатів і оцінку їх вірогідності здійснювали шляхом порівняння з вихідними та контрольними даними. Вірогідними вважали відмінності при р<0,05.