РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ДОВГОТРИВАЛОГО ЗБЕРІГАННЯ БАКТЕРІЙ З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ СОРБЦІЙНО-КОНТАКТНОГО ЗНЕВОДНЕННЯ

Короткий зміст

Роботу виконано у відділі біотехнології і контролю якості бактеріальних препаратів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів упродовж 2002–2006 років.

У дослідах були використані паспортизовані штами бактерій різних таксономічних видів, отримані із Національного центру штамів мікроорганізмів ДНКІБШМ: 1) виробничий штам кишкової палички – Escherichia coli № 1084;         2) виробничий штам сальмонели – Salmonella cholerae suis № 9; 3) виробничий штам стрептокока – Streptococcus faecalis "Костянтинівський"; 4) тест-штам стафілокока – Staphylococcus aureus АТСС № 25923; 5) контрольно-виробничий штам збудника бешихи свиней – Erysipelothrix rhusiopathiae № 149; 6) тест-штам клостридії – Clostridium oedematiens 198 та 7) тест-штам Bacillus cereus АТСС 11778.

При проведенні досліджень з підбору складових для сорбційно-контактного зневоднення бактерій в експериментах були використані: 1) органічні (іонообмінні смоли марки КБ-4П-2 та КУ-2-8, які за своїми фізико-хімічними показниками відповідали вимогам і нормам ГОСТ 20298–74) та неорганічний (технічний силікагель марки МСКГ, фізико-хімічні показники якого відповідали                           вимогам і нормам ГОСТ 3956–76) адсорбенти; 2) дезагрегант-диспергатор біомаси (гідрофобний аеросил марки АМ 1-300); 3) посередники-зневоднювачі біомаси (лактоза та крохмаль).

Визначення залишкової вологості проводили згідно з ГОСТ 24061–80.

Підготовку культур до висушування здійснювали, використовуючи загальновідомі методики (Никитин Е. Е., Звягин И. В., 1971); підготовку спорової тест-культури Clostridium oedematiens 198 до висушування проводили згідно з ГОСТ 4483–2005.

У дослідах з підбору оптимальних захисних стабілізувальних середовищ для сорбційно-контактного зневоднення використовували комбіновані стабілізатори, до складу яких входили компоненти вуглеводного (сахароза, лактоза) і білкового (пептон із ступенем розщеплення 0,3, желатин, збиране молоко) походження, а також проводили дослідження щодо вивчення ефективності загальновідомих середовищ (Файбіча та "Mist Dessicans").

При вивченні ефективності сорбційно-контактного зневоднення бактерій як контрольний метод використовували ліофільне висушування. Ліофілізацію бактеріальних культур здійснювали на ліофільній установці LP 3 фірми Jouan (виробництво Франція) відповідно до "Методических рекомендаций по разра­ботке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов", 1981.

Ступінь збереження поверхневих структур і розмірів бактерій, висушених різними методами, через 24 місяці зберігання вивчали за допомогою електронної мікроскопії на електронному мікроскопі ПЕМ–125 К (виробництво м. Суми) при електронно-мікроскопічному збільшенні в 20 500 крат. Отримані негативи збіль­шували додатково фотографічно в 2 рази. Ультраструктуру бактерій досліджували методом негативного контрастування в секторі молекулярної біології та електронної мікроскопії ДНКІБШМ. Препарати фотографували на особливо контрастні діапозитивні фотопластинки (ГОСТ 10691-1–84).

Кількісний облік життєздатних клітин після висушування проводили методом граничних розведень одержаної суспензії в рідкому живильному середовищі з наступним висівом культур бактерій по 0,1 см³ з розведень 10^-6, 10^-7, 10^-8  на тверді агаризовані середовища.

Культурально-біохімічні та патогенні властивості мікроорганізмів вивчали відповідно до загальноприйнятих методик, що представлені в довіднику під редакцією В. Я. Антонова (1971).

Стабільність антигенних властивостей Escherichia coli № 1084 визначали в динаміці, через 24 години, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 місяців, після сорбційно-контактного зневоднення та ліофільного висушування в реакції аглютинації з аглютинувальною моновалентною О-колі сироваткою 0138 згідно з "Наставлением по применению агглютинирующих О-коли сывороток", 1980; Salmonella cholerae suis № 9 – у реакції аглютинації на предметному склі згідно з "Наставлением по применению наборов сывороток сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторных О- и Н-агглютинирующих для экспресс-идентификации сальмонелл в РА на стекле", 1984; Streptococcus faecalis "Костянтинівський" – у реакції аглютинації з діагностичною сироваткою серогрупи Д згідно з "Методическими указаниями по лабораторной диагностике стрептококкоза

животных", 1983; Erysipelothrix rhusiopathiae № 149 – у реакції аглютинації зі специфічною моносироваткою згідно з "Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на рожу свиней", 1984.

Досліди з визначення стійкості контактно зневоднених бактерій під час їх десорбції з твердого носія здійснювали з використанням таких розчинів елюатів: дистильованої води, фізіологічного розчину, буферного фізіологічного розчину з додаванням 0,5 % розчину пептону, буферного фізіологічного розчину з додаванням 2 % інактивованої сироватки крові ВРХ, білково-цитратної води та середовища культивування.

Експериментальні дані статистично та математично обробляли методами варіацій­ної статистики за допомогою персонального комп’ютера з використанням програми “Microsoft Excel – 7,0” із обчисленням середнього арифметичного (M), стандартної помилки (m) і рівня вірогідності (р) за таблицею Стьюдента (Сюрин В. Н., 1966).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Підбір компонентів і оптимальних режимів для контактного зневоднення бактеріальних клітин. Результати досліджень засвідчили, що гранульована іонообмінна смола марки КБ-4П-2 забезпечувала зневоднення біоматеріалу до стану сухого сипкого порошку в 2 рази швидше порівняно із технічним силікагелем, тоді як у порівнянні зі швидкістю зневоднення адсорбентом КУ-2-8 – майже в 4 рази.

Під час вивчення показників життєздатності бактерій, зневоднених органічними адсорбентами КБ-4П-2 та КУ-2-8, а також неорганічним – технічним силікагелем марки МСКГ нами було встановлено, що найвищий відсоток життєздатних бактерій у процесі зневоднення та впродовж 9 місяців зберігання відзначався при використанні як наповнювача-зневоднювача біомаси органічного адсорбенту марки КБ-4П-2.

Аналіз отриманих результатів засвідчив, що втрата життєздатних бактерій кишкової палички на етапах процесу зневоднення катіонітом КБ-4П-2 становила 31,6 %, сальмонел – 35,0 %, стрептококів – 25,8 %, у той час як при застосуванні як наповнювача-зневоднювача біомаси адсорбенту КУ-2-8 досліджувані показники були вірогідно вищими і відповідно становили 44,0; 46,2 та 28,0 %. При використанні ж неорганічного адсорбенту відсоток загиблих бактерій порівняно із показниками, отриманими при застосуванні катіоніту  КУ-2-8, був вірогідно нижчим, однак порівняно вищим за показники, отримані при зневодненні біоматеріалу катіонітом КБ-4П-2 (Escherichia coli № 1084 – 34,4 %, Salmonella cholerae suis № 9 – 38,0 %). Винятками були висушені зразки Streptococcus faecalis "Костянтинівський" – 23,2 %. Аналогічну картину відмічали і через 9 місяців зберігання досліджуваних зразків. Однак титр життєздатних клітин контактно зневоднених стрептококів технічним силікагелем на кінець терміну спостереження знизився і був вірогідно нижчим за показники, отримані при використанні як адсорбенту іонообмінної смоли  КБ-4П-2, відповідно (50,4±2,5) та (63,8±2,7) %.

Незважаючи на достатньо високі показники життєздатності контактно зневоднених бактерій, технологія довготривалого зберігання мікроорганізмів з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення потребувала подальшого вдосконалення.

З цією метою в технологію висушування бактеріальної суспензії було додатково введено такі складові, як дезагрегант-диспергатор біомаси (гідрофобний аеросил марки АМ-1-300) та посередник-зневоднювач (лактоза), що дозволило суттєво підвищити кількість життєздатних мікробних клітин в 1 г сухого препарату в процесі зневоднення та при наступному тривалому зберіганні препаратів. Власне в контрольних зразках відсоток життєздатних бактерій кишкової палички в готовому препараті становив (68,4±5,8) %; сальмонел – (65,0±4,1) % та стрептококів – (74,2±3,9) %, тоді як уведення етапів обробки гранул смоли гідрофобним аеросилом та додавання як посередника-зневоднювача лактози дозволило суттєво підвищити кількість життєздатних мікробних клітин відповідно до (91,6±2,1); (90,5±3,8) та (95,0±3,1) %. Порівняльний аналіз результатів досліджень через 9 місяців зберігання засвідчив аналогічне збереження характеру динаміки змін. У контрольних зразках титр життєздатних клітин до кінця терміну спостереження в середньому знизився на 45 %, у той час як у дослідних – лише на 16 %.