МІКРОМІЦЕТИ ЗЕРНА ВІВСА, ЇХ ТОКСИГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ТА ВПЛИВ ФУМОНІЗИНУ В1 НА КУРЧАТ. Автореферат

Дисертаційна робота виконувалась у науково-дослідній лабораторії кафедри мікробіології та вірусології Білоцерківського національного аграрного університету протягом 2004–2007 рр. Консультативну допомогу у проведенні видової ідентифікації деяких ізольованих мікроскопічних грибів отримували у відділі фізіології і систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України у кандидата біологічних наук О.В. Соколової.

Для дослідження були відібрані 100 зразків зерна вівса урожаю 2004 та 2005 років (по 50 проб щорічно) у сільськогосподарських та зернопереробних підприємствах згідно з діючим ГОСТ'ом 13586.3–83 та ДСТУ 3570–97 у трьох фізико-географічних регіонах країни в період його зберігання. Зона Полісся була представлена зразками зерна Чернігівської, Сумської, Київської та Івано-Франківської обл.; зона Лісостепу – Черкаської, Вінницької, Хмельницької обл.; зона Степу – Дніпропетровської, Донецької, Запорізької областей та АР Крим.

Епіфітну мікобіоту виявляли методом прямої інокуляції, для чого по 6–7 зерен розкладали по поверхні середовища Чапека у чашках Петрі. Для виділення ендофітної мікобіоти зерно перед посівом обробляли 3 %-ним розчином формаліну протягом трьох хвилин, а потім промивали стерильною водою, посіви культивували за температури 24 і 37 °С протягом тижня.

З метою визначення кількісного складу мікобіоти використовували метод серійних розведень. Для цього наважку зерна масою 10,0 г подрібнювали та готували серійні розведення 1:100, 1:1000 та 1:10000, які в об’ємі 1 мл вносили на середовище Чапека у дві чашки Петрі і розподіляли по поверхні. Інкубацію посівів проводили за температури 24 та 37 °С і кількість колоній підраховували на 3–5-й день, а вміст колонієутворювальних одиниць (КУО) розраховували за І.П. Ашмаріним, А.А. Воробйовим (1962). Ідентифікацію виділених культур проводили на підставі культурально-морфологічних показників з використанням визначників грибів (Підоплічко Н.М., 1972; Domsch K.H. et al., 1980; Білай В.И., Коваль Э. З., 1988; Саттон Д. та ін., 2001). У випадку, коли у культур фузаріїв не спостерігалося конідієутворення, використовували метод мікрокультури (Білай В.И., Элланска И.А., 1975).

Визначення токсичності у грибів роду Fusarium проводили мікробіологічним методом, з використанням агарових блоків та паперових дисків, зволожених екстрактами із культур грибів, на підставі пригнічення росту тест-культури мікроорганізму Candida pseudotropicalis шт. 44 ПК (Рухляда В.В., Башмакова Е.В., 1988). Здатність продукувати Т-2 токсин встановлювали методом ТШХ з біоавтографією (Рухляда В.В. та ін., 2003).

З метою встановлення здатності фузаріїв продукувати зеараленон використовували метод Mirocha C.J., et al. (1971). Пластини обприскували 20%-ним розчином сірчаної кислоти в метанолі з наступним прогріванням протягом 5 хв за температури 110–120 °С, після чого він набував вигляд плям жовто-цегляного кольору. Окрім того, використовували розроблену за нашою участю методику експресного визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати зеараленон.

Для встановлення здатності продукувати моніліформін фузарії культивували на зерні рису та вівса, і токсин визначали методом ТШХ за Rabie J.C. et al. (1978). Моніліформін проявляли обприскуванням хроматограм розчином 2,4-динітрофенілгідразину в соляній кислоті з наступним прогріванням протягом 10 хв за температури 110 °С. Після чого токсин проявлявся у видимому світлі плямами червоно–коричневого кольору з Rf 0,25–0,3.

Здатністність фузаріїв синтезувати фузарин С встановлювали методом ТШХ за C.W. Bacon et al., (1989). Гриби культивували на зерні рису, екстракцію проводили етилацетатом, а прояв токсину на хроматограмах – розчином сірчаної кислоти. Токсин проявлявся плямами яскраво-жовтого кольору з Rf 0,85–0,9.

Присутність фумонізину В₁ визначали ТШХ за J. Dupuy, P. Le Bars, (1993). Культури грибів на рисі екстрагували сумішшю ацетонітрил–вода (1:1), розподіл екстракту проводили у системі розчинників бутанол–оцтова кислота–вода (2:1:1), а хімічний прояв здійснювали 0,5%-ним розчином анісового альдегіду. Токсин проявлявся плямами яскраво жовтого кольору з Rf 0,6–0,65.

20 культур Aspergillus flavus досліджували на здатність продукувати афлатоксини і коєву кислоту. Для цього гриби вирощували на цукрово-дріжджовому середовищі протягом 10 діб за температури 25 °С. Токсин екстрагували гарячим хлороформом і екстракт досліджували ТШХ. Коєва кислота після обробки розчином хлориду заліза проявлялася у вигляді плям коричнево-вишневого кольору з Rf 0–0,1, а афлатоксин В₁ в УФ-променях виявлявся плямами блакитного кольору з Rf 0,35–0,37 (Львова Л.С. и др., 1978).

У дослідах з вивчення біосинтезу моніліформіну і фумонізину В на зернових субстратах використовували ізольовані із зерна кукурудзи та вівса штами 608/2 та 1170/5 F. moniliforme, які культивували на стерильних зволожених зернах пшениці, рису, проса, ячменю, кукурудзи, сої, вівса, гречки, гороху та насінні соняшнику масою 10,0 г у колбах ємністю 50 мл протягом 21-ї доби за 24 ºС. Вплив вологості на продукцію токсинів вивчали, культивуючи гриби на зерні рису з вологістю 20, 30, 40, 50, 60, 70 та 80 %. Для визначення оптимальної температури та режиму культивування гриби вирощували на зерновому субстраті 50 %-ної вологісті за температури 4, 10, 24 і 37 ºС та протягом 7, 14, 21 та 28 діб. В культурах провели напівкількісне визначення вмісту токсинів.

Біологічну дію культуральної рідини гриба F. moniliforme на білих мишей вивчали шляхом одноразового внутрішньочеревного її введення в дозі 0,5 мл, а контрольним – по 0,5 мл стерильного середовища Чапека-Докса. У загиблих відмічали патзміни і гістологічно досліджували серце та печінку.

Для вивчення впливу фумонізину В₁ на курчат штам 1170/5 F. moniliforme культивували на стерильному, зволоженому зерні пшениці за температури 24 °С протягом 21 доби. Токсин екстрагували сумішшю ацетонітрил – вода (1:1) та переекстраговували у 5 %-ний водний етанол і вміст токсину визначали методом ТШХ та ІФА у хіміко-токсикологічному відділі державного науково-дослідного інституту діагностики і ветсанекспертизи м. Київ.

У досліді були використані 30 курчат 5-тижневого віку м´ясо-яєчної породи "Адлер сріблястий" середньою масою 208 г, з яких було сформовано 3 групи по 10 голів у кожній. Курчатам першої групи один раз на добу вводили перорально по 8 мг фумонізину В у 5 %-ному водному етанолі, курчата другої групи отримували таку ж дозу токсину і комбікорм з мікосорбом у кількості 2 % на кілограм корму. Третя група слугувала контролем і не отримувала ні токсин, ні мікосорб. За курчатами вели постійне клінічне спостереження, враховували їх загальний стан та один раз на тиждень визначали масу тіла. В кінці кожного тижня по троє курчат з кожної групи забивали методом декапітації й відбирали проби крові для біохімічного дослідження, а шматочки печінки – для гістологічного.

У сироватці крові курчат визначали вміст загального, ультрафільтрованого, іонізованого, нейтрального та білокзв’язаного кальцію – в реакції з гліоксаль-біс-2-оксаліном; неорганічного фосфору – реакцією з аскорбіновою кислотою; активність загальної лужної фосфатази (ЛФ) та її кісткового й кишкового ізоферментів – за методом Вагнера, Путиліна і Харабури; кислої фосфатази (КФ) – реакцією з 4-нітрофенілфосфатом. Рівень сечовини досліджували за діацетилмонооксимним методом; активність загальної лактатдегідрогенази (ЛДГ_заг), її кардіоспецифічного ізоферменту (ЛДГ₁) – за методом Севела-Товарека, аланінової трансферази (АлАТ) і аспарагінової трансферази (АсАТ) – уніфікованим методом Райтмана – Френкеля. Біохімічні дослідження сироватки крові проводились спільно зі співробітниками кафедри терапії та клінічної діагностики Білоцерківського НАУ асистентом І.А. Жилою та аспірантами П.В. Шарандаком і А.Ю. Мельником, а інтерпретація результатів – за консультативної допомоги академіка УААН, доктора ветеринарних наук, професора В.І. Левченка. Гістологічні зміни та їх інтерпритацію здійснювали за консультативної допомоги доцентів кафедри ветсанекспертизи та патанатомії М.В. Утеченка та І.В. Папченка. Для розробки експресного способу визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати зеараленон використовували шість культур фузаріїв різної токсинопродукуючої активності, здатність яких продукувати зеараленон була встановлена раніше, а також 14 культур гриба F.moniliforme.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Мікроміцети зерна вівса

Мікологічними дослідженнями встановлено, що в одному грамі зерна урожаїв двох років кількість колонієутворювальних одиниць (КУО) коливалась в межах від 1,8•10³ до 8,7•10⁴ і в середньому становила 1,78•10⁴±4,55•10³. При цьому у 2004 році кількість КУО становила 2,16•10⁴±8,1•10³, а у 2005 році – 1,5•10⁴±2,6•10³, що свідчить про відсутність суттєвої різниці в показниках. У зоні Полісся кількість КУО була 1,88•10⁴±4,29•10³, Лісостепу – 1,86•10⁴±2,75•10³ та Степу – 1,65•10⁴±4,55•10³ і найбільше КУО було в зоні Полісся у 2004 році – 2,8•10⁴±8,1•10³, а у 2005 році в цій зоні було навпаки найменше КУО – 8,3•10³±4,8•10³.

Зі 100 зразків зерна було виділено 562 культури грибів, віднесених до 2-х класів 9 родів, 418 з яких були ідентифіковані і представлені 16-ма видами і 4-ма різновидами. Найчастіше на зерні вівса зустрічалися представники родів Alte aria (92%), Mucor і Aspergillus (по 81%), Fusarium (77%) та Penicilium (39%).

Щодо зонального розповсюдження, то в зоні Полісся Alte aria alte ate виділялася з усіх проб та з 82 і 91 % проб відповідно зон Лісостепу та Степу. Другими за частотою розповсюдження були мукоральні гриби, представлені двома родами Mucor та Absidia, вони найчастіше зустрічалися в зерні із зони Степу та Лісостепу і рідше – із зони Полісся.