Анаболічна дія гідрофільного екстракту з трАВИ сої

Короткий зміст

Матеріали та методи досліджень. Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені експериментальні дослідження на 386-ти лабораторних тваринах обох статей, у тому числі на 342-х білих нелінійних щурах, 28-ми нелінійних статевозрілих мишах, 16-ти мурчаках. Тварини утримувались в умовах акредитованого віварію центральної науково-дослідної лабораторії НФаУ на типовому раціоні годування, відповідно до встановлених норм (Стефанов О.В., 2001). Евтаназію щурів здійснювали під тіопенталовим наркозом (50 мг/кг маси тіла, внутрішньочеревинно). Дослідження проведені з дотриманням вимог комісії з біоетики НФаУ (протокол № 4 від 20.06.2007 р).

При проведенні скринінгового дослідження за анаболічною активністю серед  деяких рослин родини бобових використовували гідрофільні екстракти з надземної частини вовчуга (Ononis arvensis L.), чечевиці (Lens culinaris Medic), люцерни (Medicago sativa L.) та сої (Glycine max). Досліджувані екстракти вводили внутрішньошлунково інтактним щурам в емпірично обраній дозі 150 мг/кг.

У основній частині власних досліджень використовували гідрофільний екстракт з трави сої, отриманий на кафедрі хімії природних сполук НФаУ під керівництвом проф. Кисліченко В.С. ГЕТС у своєму складі містить діючі речовини: флавоноїди (3,4%), ізофлавоноїди (0,73%) та дубільні речовини (5,73%), органічні кислоти (8,07%), оксикоричні кислоті (3,56 %), полісахариди (49,16 %), пектини (5,73%), вільні та зв’язані амінокислоти (20,4%)         (Карпюк У.В. із співавт., 2008).

Препаратами порівняння були обрані нестероїдні засоби з анаболічною дією: калію оротат у дозі 100 мг/кг виробництва «Лубни-фарм» (Україна), елькар (20 % розчин левокарнітину гідрохлориду) у дозі 120 мг/кг виробництва «Пик-фарма» (Москва) та рибоксин у дозі 110 мг/кг виробництва ВАТ «Бєлмедпрепарати» (Мінск). Як референс-препарат при визначенні гіпоглікемічної дії використовували глібенкламід виробництва «Берлін-Хемі» (Німеччина) у дозі 25 мг/кг. Дози розраховані з урахуванням коефіцієнту видової чутливості (Рыболовлев Ю.Р. и соавт., 1979). Досліджувані засоби вводились внутрішньошлунково, одноразово. Контрольній групі тварин вводили дистильовану воду.

Протягом досліджень для оцінки анаболічної дії в експериментальних тварин визначали наступні показники: масу тіла, внутрішніх органів (печінки, серця, нирок, селезінки), їх ваговий коефіцієнт, добовий спонтанний діурез, вміст загального білка у внутрішніх органах і рівень сечовини в сироватці крові та сечі (Меньшиков В.В. и соавт., 1987). Основні біохімічні показники білкового обміну визначали за допомогою діагностичних наборів виробництва «Біофарма» (Україна) та «Lachema» (Чехія): загальний білок крові – біуретовим методом, сечовину крові та сечі – діацетилмоноксидним методом, загальний білок у тканинах - методом Лоурі в модифікації Міллера (G.L. Miller , 1959).

На моделі ініційованого примусового плавання в щурів визначали ерготропну активність та умовнотерапевтичну дозу ГЕТС за анаболічною активністю (Бобков Ю.Г. с соавт., 1984). Дана модель дозволяє встановити здатність засобу впливати як на білоксинтетичні процеси в організмі, що прискорюються внаслідок фізичних навантажень, зокрема в мґязах, так і на загальну витривалість, як інтегральний показник анаболічної дії                    (Турханова Л.В., 1998; Байкова С.К., 2000).

Вивчення гіпоглікемічної активності проводили на щурах глюкозооксидантним методом (Камышников В.С., 2004.).

Антиоксидантну, гепатопротекторну та мембраностабілізуючу дії ГЕТС вивчали на моделі гострого тетрахлорметанового ураження печінки     (Стефанов О.В., 2001). Для оцінки впливу ГЕТС на вміст реактантів 2-тіобарбітурової кислоти (ТБК-реактантів) та дієнових кон’югатів (ДК) у крові та тканині печінки використовували реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977). Активність аланінамінотрансферази (АлАТ) в сироватці крові, як показник цитолізу гепатоцитів, визначали методом Райтмана за допомогою тест-наборів фірми «Lachema» (Чехія).

Ефективність анаболічної дії ГЕТС вивчали на моделях підвищеного катаболізму: харчовій депривації, гідрокортизоніндукованому катаболізму та доксорубіциніндукованому катаболізму. Харчову депривацію викликали протягом 5 діб, утримуючи щурів в умовах повного харчового голодування при достатньому доступі до води (Яковлева Л.В. із співавт., 2007). Доксорубіциніндукований катаболізм викликали шляхом однократного введення у хвостову вену щурів доксорубіцину виробництва «Київмедпрепарат» у дозі 20 мг/кг (Капелько В.И. и соавт., 1990). Виявлення метаболічних та дистрофічних порушень у тканині міокарда здійснювали після евтаназії за активністю аспартатамінотрансферази (АсАТ) та креатинфосфокінази (КФК) з використанням діагностичних тест-наборів «Lachema». Вивчення білкового спектру сироватки крові щурів на моделі доксорубіциніндукованого катаболізму проводили методом гель-хроматографії з використанням хроматографічної колонки з сефадексом G-200           (Остерман Л.А., 1985). Гідрокортизоніндукований катаболізм відтворювали введенням 2,5 % суспензії гідрокортизону ацетату (виробництва «Фармак», Україна) внутрішньом’язово в дозі  50 мг/ кг протягом 3 діб (Хромова Т.О., 1992; Карилхан И. Н. и соавт., 2005). Вміст нуклеїнових кислот (РНК та ДНК) у серцевому м’язі статевонезрілих нелінійних щурів визначали спектрофотометричним методом (Спирин А.С., 1958).

Вивчення андрогенної дії ГЕТС проводили за загальноприйнятою методикою (Herschberger L., 1953; Стефанов О.В., 2001), визначаючи масу  специфічних органів-мішеней: musculus levator ani та вентральної частини передміхурової залози.

З метою встановлення показника ЛД₅₀ оцінювали гостру токсичність за експрес-методом (Пастушенко Т.В. и соавт., 1985). Клас токсичності визначали за таблицями Сидорова К.К. (1973).

Цитотоксичний вплив різних концентрацій ГЕТС визначали на моделі клітин червоного кісткового мозку щурів за методом Шрека в модифікації (Маркова В.М. с соавт., 1989) та на моделі еритроцитів у щурів за методом Яновського (Кост Е.А., 1975).

Оцінку генотоксичності ГЕТС проводили з використанням мікроядерного тесту в модифікації (Burchiel S., 2001).

Вивчення можливого алергічного впливу ГЕТС на організм тварин проводили за допомогою реакції активної шкіряної анафілаксії в мурчаків, у тесті дегрануляції гладких клітин щурів та в реакції гіперчутливості уповільненого типу на мишах (Ишимова Л.М., 1971; Фримель Х., 1987).

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою комп’ютерних програм методами варіаційної статистики з використанням критеріїв Фішера-Ст’юдента та непараметричних методів аналізу (Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2006).

Результати досліджень та їх обговорення. Завданням першого етапу досліджень було встановити, який із досліджуваних гідрофільних екстрактів виявляє анаболічну активність.

Аналіз результатів дослідження показав, що максимальний анаболічний ефект спостерігався при введенні гідрофільного екстракту з трави сої. ГЕТС за впливом на масу тіла та масу внутрішніх органів вірогідно (р<0,05) переважав активність інших екстрактів, а також дію референс-препарату елькару (р<0,01). Так, протягом 28 діб, маса тіла збільшувалась під впливом досліджуємих екстрактів: ГЕТС - на 75 %, вовчуга на – 42 %, люцерни - на 61 %, чечевиці - на 49 %. Використання препарату порівняння елькару сприяло збільшенню маси тіла на 66%. ГЕТС єдиний з досліджуваних екстрактів, який вірогідно знижував рівень сечовини: у крові - на 25 %, у сечі - на 28 % у порівнянні з даними контрольної групи тварин. Ці результати свідчать про ретенцію азоту в тканинах і підтверджують анаболічну дію ГЕТС. На відміну від ГЕТС, референс-препарат практично не впливав на вміст сечовини в біологічних рідинах.

На моделі примусового плавання в щурів була експериментально визначена умовнотерапевтична доза ГЕТС з діапазону доз екстракту 50-200 мг/кг. Враховуючи, що в молодому віці анаболічні процеси переважають над катаболічними і показники анаболічної дії є більш вираженими, в експерименті використовували молодих щурів.

Результати експерименту показали, що ГЕТС проявляв найвищу анаболічну активність у дозі 100 мг/кг. За впливом на масу тіла та вміст загального білка в тканинах у цій дозі ГЕТС вірогідно перевищував дію препаратів порівняння (р<0,05). Протягом експерименту приріст маси тіла на фоні внутрішньошлункового введення ГЕТС складав 68,5 г, при використанні калію оротату та елькару – 42,1 г та 46,8 г, відповідно. За дією ГЕТС на фоні примушеного плавання в щурів також встановлено збагачення білком тканин внутрішніх органів і м’язів. Вміст загального білка в тканинах (на 100  мг тканини) у контрольних тварин у середньому складав 17,4 мг, під впливом ГЕТС – 24,1 мг, калію оротату – 18,9 мг, елькару – 20,9 мг.

Введення ГЕТС протягом 28-ми діб в умовнотерапевтичній дозі на моделі ініційованого примусового плавання сприяло підвищенню фізичної витривалості щурів на 22,1 с у порівнянні з даними контрольної групи. В той час, введення елькару підвищувало цей показник на 17,2 с. Ці дані свідчать про виражену ерготропну активність ГЕТС у дозі 100 мг/кг. Наведені зміни є віддзеркаленням збільшення інтенсивності білоксинтетичних процесів, у наслідок яких можливе підвищення адаптивно-компенсаторних можливостей організму.

В межах вивчення фармакодинаміки ГЕТС в умовнотерапевтичній дозі 100 мг/кг вивчалась гіпоглікемічна та антиоксидантна активність.

ГЕТС у дозі 100 мг/кг у здорових щурів проявив помірну гіпоглікемічну активність, яка по виразності значно поступалася препарату порівняння – глібенкламіду. Так, на 5-ту год експерименту рівень глюкози у щурів, які отримували ГЕТС, складав 4,5 ммоль/л, яким вводили препарат порівняння глібенкламід – 3,7 ммоль/л, у той час цей показник у тварин контрольної групи дорівнював 5,2 ммоль/л. Гіпоглікемічні властивості ГЕТС ми пов’язуємо з наявністю у його складі сполук флавоноїдної природи.

Враховуючи, що процеси вільнорадикального окиснення ліпідів є універсальним механізмом ушкодження клітинних мембран (Гончарук Є.Г. із співавт., 2004), інтерес представляло дослідити антиоксидантні властивості ГЕТС на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту в щурів.

Результати досліджень свідчать, що у тварин групи контрольної патології визначається високий вміст ТБК-реактантів і ДК, як в гомогенаті печінки, так і в сироватці крові. На фоні застосування ГЕТС була виявлена виразна антиоксидантна та гепатопротекторна активність, на що вказують зниження рівня ТБК-реактантів і ДК у печінці та сироватці крові до значень інтактного контролю в середньому в 1,75 разу.

Слід зазначити, що препарат порівняння - силібор поступався ГЕТС за впливом на зазначені показники перекисного окиснення ліпідів, а також не виявляв здатності впливати на синдром цитолізу, у той час як ГЕТС знижував концентрацію АлАТ в 1,7 разу.

Антиоксидантні, гепатопротекторні та антицитолітичні властивості ГЕТС пояснюються дією таких його складових як флавоноїди, дубильні речовини, оксикоричні кислоти.

Основним завданням роботи стало поглиблене дослідження власне анаболічної дії ГЕТС у дозі 100 мг/кг в умовах різної патології.

Дані, отримані на моделі харчової депривації, вказують, що щури групи контрольної патології протягом 5-ти діб за умов повного голодування втратили в середньому 45,6 г. У тварин цієї групи спостерігалось різке зменшення як абсолютної, так і відносної маси печінки та селезінки. Відсутність змін маси серця та нирок можна пояснити наявністю ефекту перерозподілу ресурсів в організмі за умов стресу з метою збереження найбільш життєвоважливих органів за рахунок менш важливих. У щурів контрольної патології також зафіксовано зменшення вмісту загального білка в тканинах у середньому на 12,6 % та достовірне збільшення рівня сечовини в крові та сечі (у 2,9 та 3,4 разу, відповідно), що свідчить про підвищення білкової дисиміляції в період харчової депривації.

ГЕТС на моделі харчової депривації проявляв виражену анаболічну дію, що засвідчила позитивна динаміка показників, які вивчали. Так, у тварин, які отримували ГЕТС у дозі 100 мг/кг на тлі повного голодування, дефіцит маси тіла був у 1,6 разу нижчим, ніж у щурів контрольної групи. Масові коефіцієнти внутрішніх органів на 5-ту добу в дослідній групі  на тлі використання ГЕТС вірогідно (р<0,05) не відрізнялись від аналогічних показників у інтактних тварин та збільшувались у порівнянні з тваринами групи контрольної патології. Введення ГЕТС викликало підвищення вмісту загального білка в порівнянні з даними контрольної патології: у тканині печінки складало 42,0 %, у серцевому м’язі - 10,5 %, у скелетному м’язі - 43,7 % (рис. 1). Ці дані імовірно пов’язані з гальмуванням ГЕТС розпаду білків, викликаного харчовою депривацією.

В той же час, за дією калію оротату дослідні щури втратили лише в 1,3 разу менше маси тіла, ніж тварини групи контрольної патології. Рівень загального білку в тканинах внутрішніх органів щурів під впливом референс-препарату залишався зниженим і вірогідно не відрізнявся від даних контрольної патології. Введення препарату порівняння на фоні харчової депривації практично не впливало на функціональні показники нирок: (добовий діурез та вміст сечовини в сечі).