ДИСФУНКЦИЯ ТИМУСА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И В УСЛОВИЯХ НАРУШЕННОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ К ГЛЮКОЗЕ

Короткий зміст

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 243 самцях щурів лінії Wistar і SHR. Експериментальну частину роботи виконано відповідно до національних “Загальних етичних принципів досліджень на тваринах” (Україна, 2001) і положень “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних і інших наукових цілей” (Страсбург, 1985).

Досліджувані тварини були розділені на сімнадцять експериментальних груп: контрольні щури лінії Wistar, яким одноразово в/очеревинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5) (група 1); щури лінії Wistar з експериментальним стрептозотоциновим діабетом (ЕЦД) тривалістю перебігу 3 тижні (група 2); щури лінії Wistar з ЕЦД, яким починаючи з 2-го тижня розвитку діабету протягом 14 днів вводили в/очеревинно L-аргінін (Lа) в дозі 300 мг/кг (група 3), N-нітро-L-aргінін (NnLa) в дозі 10 мг/кг (група 4) або в дозі 50 мг/кг (група 5); контрольні щури лінії SHR, яким однократно в/очеревинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5) (група 6); щури лінії SHR з ЕЦД тривалістю перебігу 3 тижні (група 7); щури лінії SHR з ЕЦД, яким починаючи з 2-го тижня розвитку діабету протягом 14 днів вводили в/очеревинно NnLa у дозі 10 мг/кг (група 8) або в дозі 50 мг/кг (група 9); нащадки щурів лінії Wistar (самці) віком 1 місяць (група 10), 2 місяці (група 11), 3 місяці (група 12), 6 місяців (група 13), народжені від контрольних щурів лінії Wistar, яким на 15-у добу датованої вагітності однократно в/очеревинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5); нащадки щурів лінії Wistar (самці) з експериментальним гестаційним діабетом (ЕГД) віком 1 місяць (група 14), 2 місяці (група 15), 3 місяці (група 16), 6 місяців (група 17). У кожній експериментальній групі тварин крім вивчення тимуса проводили визначення концентрації глюкози в периферичній крові.

Для ініціації цукрового діабету у щурів застосовували стрептозотоцинову модель захворювання, що є однією з найпоширеніших експериментальних моделей ЦД І типу (Rees D.et al., 2005; Herrath M. еt al., 2009). За гормонально-метаболічними змінами стрептозотоциновий діабет у щурів багато в чому подібний до ЦД І типу у людини (Полторак В. В. та ін., 1999). При цьому ступінь важкості перебігу патологічного процесу характеризується чіткою залежністю від застосовуваної дози препарату. Стрептозотоцин (SIGMA Chemical, США) вводили щурам в/очеревинно в дозі 50 мг/кг, розчиненій у 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5) перед самим моментом введення. Час, що пройшов від дня введення препарату, надалі вважали як тривалість перебігу діабету. Визначення концентрації глюкози в крові, що брали із хвостової вени, проводили глюкозооксидазним методом із застосуванням приладу Glucocard II Super через 12 годин і 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 і 20 діб після ін'єкції стрептозотоцину. Вимір рівня глікемії здійснювали через 6 годин з моменту останнього прийому їжі. На 3 день після введення стрептозотоцину для подальших досліджень відбирали тварин з рівнем глікемії натще > 8,0 ммоль/л. На 5 добу у всіх тварин проводився внутрішньоочеревинний тест толерантності до глюкози відповідно до протоколу, рекомендованого Фармакологічним центром України.

Для фармакологічної модуляції продукції оксиду азоту нами були використано курсові в/очеревинні введення: 1) субстрату для синтезу NO – амінокислоти L-аргініну (La) (Sigma-Aldrich, США); 2) неселективного блокатора NOS – N-нітро-L-аргініну (N_ω- Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, NnLa, L-NAME hydrochloride) (Sigma-Aldrich, США). Введення здійснювали один раз на добу (9:00) протягом 14 днів починаючи із другого тижня розвитку ЕЦД - у період автоімунної деструкції β-клітин панкреатичних острівців, що здійснюється при активній участі оксиду азоту. Дозування La для одноразового введення становило 300 мг/кг; NnLa - 10 мг/кг і 50 мг/кг, що відповідає літературним даним по вивченню їх в/очеревинного введения експериментальним тваринам (Nishikawa T. еt al., 1993; Сагач В.Ф. та ін., 2005).

Одним з недоліків стрептозотоцинової моделі ЦД І типу є вторинність змін в органах імунної системи, що виникають після розвитку гіперглікемії. Тому перспективне використання і таких моделей, при яких ще відсутня виражена гіперглікемія, але вже спостерігаються явища порушення толерантності до глюкози. Такий підхід має більше важливе практичне значення для діабетології та ендокринології, оскільки ПТГ є, фактично, переддіабетом, цей стан у більшості випадків не діагностується й протікає безсимптомно, а виявлення змін функціонального стану тимуса на цій стадії є більше доказовим щодо його участі в патогенезі розвитку ЦД у порівнянні зі стрептозотоциновою моделлю.

Однією з таких моделей ПТГ є щури лінії SHR (spontaneously hypertensive rats – SHR), що вважаються визнаною експериментальною моделлю есенціальної гіпертензії у людини (Dzielak D., 1991). За основними проявами патогенезу модель збігається з патологією людини, але відрізняється від клінічного прототипу тим, що передається нащадкам із 100% частотою. Останнім часом зростає кількість доказів того, що гіпертензія у щурів лінії SHR може бути викликана дисфункцією тимуса (Zhao X. et al.,1998; Marcil J., 2001). Ця гіпотеза базується на тому, що імуносупресивна терапія, імплантація тканин тимуса від нормотензивних щурів, лікування антитимоцитарною сироваткою або тимічними гормонами знижує артеріальний тиск у щурів SHR (Khraibi A. et al., 1984; Purcell E. et al., 1993; Hidekazu S. et al., 1999). У той же час механізми, через які імунологічна дисфункція приводить до гіпертензії, невідомі.

У якості ще однієї моделі ПТГ нами була розроблена модель експериментального гестаційного діабету (ЕГД) у самок щурів лінії Wistar (Колесник Ю. М. та ін., 2006). Характерно, що механізми виникнення ПТГ у цих експериментальних моделей різні – у щурів лінії SHR це генетично-обумовлений дефект, а у нащадків щурів з ЕГД – модельований штучно і викликаний впливом внутрішньоутробної гіперглікемії на плід, що порушує морфогенез лімфоїдного та епітеліального компартментів тимуса. ЕГД моделювали однократним введенням стрептозотоцину в дозі 45 мг/кг ваги тварини на 15 добу датованої вагітності, що відповідає останньому триместру вагітності. Після індукції діабету самок поїли в перший день 20% р-ром глюкози, на другий день - 10% р-ром глюкози для зниження ризику розвитку гострої гіпоглікемії, що розвивається внаслідок значної одночасної деструкції β-клітин і підвищення концентрації інсуліну в крові. На 2-3 добу після введення стрептозотоцину у всіх самок після 10-годинного голодування визначали рівень глюкози венозної крові із хвостової вени глюкозооксидазним методом. Для експерименту відбирали тварин з рівнем глікемії більше ніж 8 ммоль/л. Нащадки щурів з ЕГД перебували на висококалорійному раціоні з вільним доступом до води та їжі. Дослідження проведені на 1-місячних, 2-місячних, 3-місячних і 6-місячних самцях - нащадках щурів з ЕГД, яких декапітували під етаміналовим наркозом і виділяли тимус. В експериментальних групах ураховували вагу тварини й вагу внутрішніх органів (тимуса, селезінки), визначали концентрацію глюкози глюкозооксидазним методом, концентрацію інсуліну в плазмі визначали імуноферментним методом з використанням наборів фірми Peninsula Laboratories Inc. (США), вміст ліпідів, тригліцеридів і холестерину у плазмі крові визначали за допомогою стандартних наборів, проводили глюкозо-толерантний тест (ГТТ).

Структуру клітинних субпопуляцій тимуса вивчали на підставі аналізу серійних гістологічних зрізів з різних відділів органа й даних морфометричних і денсітометричних характеристик із наступним математичним класифікаційним аналізом при фарбуванні гематоксиліном-еозином або моноклональними антитілами (МКАТ) до різних антигенних детермінант тимуса. Для проведення даного дослідження на ротаційному мікротомі робили 5-мікронні серійні зрізи з різних ділянок тимуса, фіксованого по Буену, які потім депарафинували в ксилолі, проводили регідратацію в нисхідних концентраціях етанолу (100%, 96%, 70%), відмивали у фізіологічному розчині або 0,1 М фосфатному буфері (pН =7,4) і фарбували. При фарбуванні гематоксилін-еозином досліджували 4 морфофункційні зони тимуса: субкапсулярну зону, глибоку кору, медулярну зону й внутрішньодолькові периваскулярні простори (ВПП) кори й мозкової речовини. При імуногістохімічних методах фарбування досліджували 2 морфологічні зони тимуса - коркову й мозкову.

Вивчення морфометричних і денсітометричних характеристик клітин тимуса проводили на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Зображення, отримане на мікроскопі Axioskop за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4722 (COHU Inc., США), вводилося в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386. У скануючому режимі вводили всі поля зору в кожній із зон тимуса. Ідентифікація клітин в отриманому зображенні проводилося в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Основними морфометричними характеристиками клітин були їхня площа, периметр, максимальний й мінімальний еліптичні діаметри. Додатковими морфометричними характеристиками клітин були коефіцієнти форми, елонгації й еквівалентний діаметр. Денситометричними характеристиками клітин, які визначалися також в автоматичному режимі, були їх абсолютна GreyCONT і питома GreyLOG оптичні щільності, які обчислювалися за формулами: GreyLOG_i = |lg(D_i /D₀)| (одиниць оптичної щільності О_Ощ), де D_i  і D₀  - показники оптичної щільності клітин та міжклітинної речовини (“фону” препарату) відповідно. GreyCONT_i = S_i * GreyLOG_i (одиниць оптичної щільності О_Ощ), де S_i -площа клітини (мкм²), а GreyLOG_i - питома оптична щільність клітини. Крім зазначених характеристик клітин тимуса ми обчислювали абсолютну кількість клітин (на 1 мм² площі залози) і відносну (%) щільність розподілу кожного класу клітин в окремих зонах тимуса.

Характеристику процесів антигенного диференціювання лімфоцитів оцінювали імуноцитофлюоресцентним методом ідентифікації поверхневих антигенних детермінант CD4 і CD8 у серійних гістологічних зрізах тимуса за допомогою МКАТ до CD4- і CD8-антигенів щура, кон'югованих з FITC (Beckman Coulters, США) із наступним морфометричним аналізом і кількісною оцінкою імуноцитофлюоресцентної реакції. При цьому досліджуваними параметрами були: щільність CD-імунопозитивних лімфоцитів на 1 мм² тканини тимуса і їх частка в структурі лімфоїдної популяції, щільність відповідних CD-рецепторів на клітинній мембрані лімфоцитів, відповідність визначеному морфофункційному класу. Стан проліферативної активності лімфоцитів тимуса оцінювали на основі методики імунофлюоресцентного виявлення ядерного антигену проліферуючих клітин PCNA за допомогою первинних МКАТ до PCNA щура та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США).

Інсулін-експресуючі клітини (Ins⁺) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом непрямої імунофлюоресценції (НІФ) з використанням МКАТ до інсуліну фірми Peninsula Laboratories Inc. (США) та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Експресію антиапоптотичного білка Bcl-2 та індуцибельної NO-синтази (iNOS) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом НІФ за допомогою МКАТ до Bcl-2 та iNOS щура та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Для ідентифікації натуральних імунорегуляторних Т-клітин тимуса (Т_reg) у гістологічних зрізах тимуса застосовували метод прямої імунофлюоресценції (ПІФ) з використанням МКАТ до одного з основних маркерів Т_reg - CD25 (Caltag Laboratories, США) з наступним визначенням щільності CD25-рецепторів. Антиген-презентуючі клітини (АПК) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом ПІФ з використанням МКАТ до MHC-II-антигену щура, кон'югованих з FITC (Beckman Coulter, США). Епітеліоретікулоцити (ЕРЦ) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом ПІФ з використанням МКАТ до цитокератинів щура (monoclonal Anti-Pan Cytoceratin – MAPC), кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Експресію автоімунного регулятора AIRE у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом подвійної імунофлюоресценції з використанням МКАТ до AIRE та вторинних антитіл, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, США), а також МКАТ до цитокератинів (Sigma Chemical, США) і CD4-антигену щура (Beckman Coulter, США), кон'югованих з FITC. Експресію білка р53 у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом подвійної імунофлюоресценції з використанням МКАТ до р53 та вторинних антитіл, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, США), а також МКАТ до CD4-антигену щура (Beckman Coulter, США), кон'югованих з FITC. Експресію білка ранньої відповіді c-Fos у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом НІФ за допомогою МКАТ до c-Fos щура та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Експресію імунної субодиниці протеасоми LMP-2 у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом подвійної імунофлюоресценції з використанням МКАТ до LMP-2 та вторинних антитіл, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, США), а також МКАТ до цитокератинів (Sigma Chemical, США) і CD4-антигену щура (Beckman Coulter, США), кон'югованих з FITC. Додатково для візуалізації LMP-2⁺-клітин у тимусі ставили імуногістохімічну реакцію з первинними МКАТ до LMP-2 щура й вторинними антитілами rabbit ImmunoCruz^TM Staining system (Santa Cruz Biotechnology, США), кон'югованих з пероксидазою хріну.

Для виявлення експресії iNOS і білків теплового шоку Hsp 70 у тимусі використовували метод електрофорезу на поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) з наступним імуноблотингом (Weste -blotting) на PVDF-мембрану. Для цього експериментальних тварин в останній день досліджень позбавляли їжі й наступного дня (після 16 годин голодування) декапітували під наркозом (етамінал натрію 40 мг/кг в/очеревинно). Тимус швидко витягали й заморожували в рідкому азоті. Для визначення експресії білків тимус спочатку механічно подрібнювали в рідкому азоті, а потім піддавали ультразвуковій гомогенізації в 2 частинах лізис-буфера (Тріс-HCl - 5 ммоль/л, рН=7,5, гліцерол – 10%, ЕДТА й ЕГТА – по 0,5 ммоль/л, дитіотреітол – 2 ммоль/л, PMSF - 0,2 ммоль/л, коктейль інгібіторів протеаз – 1%, Тритон Х-100 – 0,1%), центрифугували 20 хв. (10000 g, 4^оС). Відбирали супернатант, визначали в ньому вміст білка біцинхоніновим методом (Pierce) за допомогою набору реактивів ВСА-1 (Bicinchoninic acid protein assay kit, Sigma procedure № TPRO-562). Розраховували обсяг проби, у якій міститься 100 мкг білка. У зразки супернатантів (розчинені екстракти білків) додавали 20 мкл 4-кратного Sample buffer (Тріс-HCl 0,5 М, рн=6,8, гліцерол - 10%, SDS -10%, бромфеноловий синій -0,5%, β-меркаптоетанол) і піддавали денатурації на водяній лазні (7 хвилин) або в стерилізаторі та використовували надалі для дослідження методом імуноблотингу.

Імуноблотинг проводили за допомогою обладнання і протоколів BioRad Labs (USA), з використанням антитіл і реактивів фірми Sigma. Супернатанти (по 50-100 мкг білка) розділяли на 7,5% SDS-PAGE (n=3 у кожній пробі) за методом Леммлі (Laemmli U., 1970) та переносили на PVDF-мембрани. Для визначення експресії iNOS застосовували як первинні антитіла моноклональні мишачі анті-iNOS антитіла (BD Transduction Laboratories^TM) і кролячі антитіла до Ig-HRP миші (Sigma Chemical, США), мічені пероксидазою – як вторинні антитіла. Для визначення експресії білків теплового шоку Hsp70 застосовували як первинні антитіла моноклональні мишачі анті-HSP 70 антитіла (Sigma Chemical, США) і кролячі антитіла до Ig-HRP миші (Sigma Chemical, США), мічені пероксидазою – як вторинні антитіла. Для візуалізації реакції використовували набір реактивів ProteoQwest^TM Colorimetric Weste Blotting Kit, TMB Substrate (Sigma Chemical, США), детекцію проводили шляхом реакції з тетраметілбензидіном (Sigma Chemical, США). Інтенсивність фарбування визначали за допомогою комп'ютерної денситометрії (програма TotalLab TL100, www.nonlinear.com) і представляли в у.о.

Усі отримані експериментальні дані обробляли на персональному комп'ютері пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина), EXCEL з пакета Microsoft Office 2003 (Microsoft Corp., США), пакета STATISTICA 6.0 (Stat-Soft, 2001). Для всіх показників розраховували значення середньої арифметичної вибірки (М), її дисперсії та помилки середньої (m). Для виявлення вірогідності розходжень результатів досліджень в експериментальних і контрольних групах тварин визначали коефіцієнт Стьюдента (t), після чого визначали ймовірність розходження вибірок (р) і ймовірний інтервал середньої. Критичний рівень значимості при перевірці статистичних гіпотез приймали рівним 0,05. Коефіцієнт вікової кореляції досліджуваних показників розраховували за допомогою пакета статистичних програм JMP 7 (SAS STATISTICS, США).

Результати досліджень та їх обговорення. Проведені дослідження показали, що у щурів лінії SHR і у нащадків щурів з ЕГД до 6-місячного віку розвиваються метаболічні порушення, що проявляються у змінах жирового (гіперліпідемія, гіпертригліцеридемія, гіперхолестеринемія) і вуглеводного (порушення толерантності до глюкози, гіперінсулінемія) обмінів, а рівень глюкози в крові знаходиться на рівні верхніх меж норми. Так, у щурів лінії SHR на тлі гіперінсулінемії при проведенні глюкозотолерантного тесту відзначене його порушення, що характеризується відсутністю ранньої (першої) фази секреції інсуліну й збереженням постпрандіальної гіперглікемії на 90 хвилині тесту. Обчислення індексу HOMA у щурів лінії SHR показало двократне (р<0,05) його збільшення в порівнянні з контролем (0,49 проти 0,23 відповідно). Результати дослідження нащадків, отриманих від самок з ЕГД, виявили у них збільшення маси тіла, макросомію органів. Так, на 1-му і 2-му місяці життя маса самців перевищувала значення групи порівняння практично в 2 рази (р<0,05) і дана тенденція зберігалася до 6 місяця постнатального періоду. У 1-місячних самців маса тимуса перевищувала значення групи порівняння в 2,2 раза (р<0,05), у 2-місячних – в 4 рази (р<0,05) і тільки з 6-го місяця відбувалося відносне вирівнювання маси цих органів у контрольних і експериментальних тварин. У нащадків самок з ЕГД вже з 4-х місячного віку були відзначені зміни ГТТ - запізнення появи піку гіперглікемії в крові - не з 15-ї, а з 30-ї хвилини тесту (при цьому пік концентрації глюкози в крові був вірогідно нижчим (p<0,05) ніж у контрольній групі), еуглікемічний рівень досягався не з 30-ї, а тільки з 90-ї хвилини тесту. У 6-місячних нащадків самок з ЕГД при проведенні ГТТ спостерігався діабетичний тип глікемічної кривої, для якого характерне порушення ранньої і пізньої фаз секреції інсуліну з розвитком інсулінорезістентності, про що свідчить високий рівень глікемії в постабсорбційний період тесту (після 90-ї хвилини). Концентрація інсуліну в плазмі крові у нащадків самок з ЕГД вже у 2-місячному віці вірогідно перевищувала значення групи контролю, досягнувши максимальних значень в 4 місяці, а обчислення індексу HOMA свідчило про формування інсулінорезистентності - у контрольних самців він складав у середньому 0,25-0,4, а у нащадків самок з ЕГД - 0,4-1,7.

Вивчення цитоархітектоніки тимуса у тварин з ПТГ показало достовірне зменшення сумарної щільності лімфоїдних клітин у всіх морфофункційних зонах тимуса у щурів лінії SHR на 22-35% (р<0,05), тоді як у нащадків щурів з ЕГД кількість тимоцитів вірогідно збільшувалася у ВПП і медулярній зоні тимуса в усі досліджені строки постнатального онтогенезу в порівнянні з контролем, а в субкапсулярній зоні й глибокій корі змінювалася різноспрямовано. Вивчення процесів диференціювання тимоцитів у тварин із ПТГ показало достовірне збільшення кількості цитотоксичних CD8⁺ лімфоцитів у порівнянні з контролем - у щурів SHR на 43-66% (р<0,05) і у нащадків щурів з ЕГД в 2-3 рази (р<0,05), тоді як кількість CD4⁺ лімфоцитів не змінювалась в тимусі у щурів SHR і вірогідно знижувалась у нащадків щурів з ЕГД.

Вивчення процесів диференціювання тимоцитів у щурів лінії Wistar і SHR з ЕЦД показало односпрямовані тенденції по зниженню кількості CD4⁺ лімфоцитів і щільності CD4‑рецепторів у експериментальних тварин обох ліній і збільшенню кількості CD8⁺ лімфоцитів. Так, щільність популяції CD4⁺ лімфоцитів у корковій речовині тимуса діабетичних тварин лінії Wistar і SHR складала відповідно 574±32 та 386±17 клітин/мм² проти 769±38 та 810±32 у контролі, тоді як кількість CD8⁺ лімфоцитів у цій же зоні тимуса зростала від 328±18 клітин/мм² у контрольних щурів Wistar і 470±25 у щурів SHR до 576±24 та 779±39 клітин/мм² у діабетичних тварин. Введення La щурам з ЕЦД практично не впливало на чисельність CD4⁺ і CD8⁺ лімфоцитів у тимусі. Разом з тим, введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії Wistar і SHR призводило до достовірного збільшення загальної кількості CD4⁺ лімфоцитів у тимусі і знижувало рівень CD8⁺ лімфоцитів у порівнянні з діабетичними тваринами.

Довгий час вважалося, що β-клітини панкреатичних острівців є єдиним місцем продукції інсуліну в організмі. Однак в останнє десятиліття була виявлена екстрапанкреатична експресія інсуліну в тимусі, головному мозку, печінці, жировій тканині, кістковому мозку, селезінці у людини і експериментальних тварин (мишей, щурів) у нормі та при цукровому діабеті І і ІІ типів, а також при штучно підтримуваній гіперглікемії (Throsby M. et al., 1998; Kojima H. et al., 2004; Derbinski J. et al., 2005; Palumbo M. et al., 2006). Дослідження особливостей експресії інсуліну в тимусі в експериментальних тварин із ПТГ показали нижчу кількість Ins⁺-клітин порівняно з контролем: у щурів лінії SHR у корковій речовині їх менше в 2 рази (р<0,05), а в мозковій речовині - на 36% (р<0,05). Вивчення щільності популяції Ins⁺ -клітин в тимусі у нащадків щурів з ЕГД показало достовірне зниження їх кількості в корі тимуса на 23-53% (р<0,05) і в мозковій речовині на 46-58% (р<0,05) в усі досліджені вікові періоди постнатального онтогенезу в порівнянні з контрольними тваринами. Характерно, що популяція інсулін-експресуючих клітин тимуса, що сформована у контрольних тварин вже до 1 місяця постнатального періоду, з віком не тільки не зменшується, а навпаки, зокрема в корі, збільшується й зберігається до зрілого віку. Це дозволяє вважати, що формування імунних механізмів толерантності до інсуліну вимагає постійного синтезу інсуліну тимічного походження й відповідає літературним даним про виявлення в тимусі експресуючих інсулін АПК і ЕРЦ в зрілому віці (Pugliese A., 2004).

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості Ins⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії Wistar на 55% (р<0,05) і в мозковій речовині на 36% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, при цьому концентрація інсуліну в Ins⁺-клітинах вірогідно зростала. Введення La щурам лінії Wistar з ЕЦД не супроводжувалося змінами сумарної щільності популяції Ins⁺-клітин в обох зонах тимуса. Разом з тим, введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до достовірного збільшення кількості Ins⁺-клітин у корі тимуса на 68% і 58% (р<0,05) відповідно у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як у медулярній зоні не впливало на щільність популяції Ins⁺-клітин. Введення NnLa призводило до зниження концентрації інсуліну в Ins⁺-клітинах на 31-39% (р<0,05) в корі і на 34-47% у мозковій речовині тимуса в порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням щільності попупуляції Ins⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 23% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх кількість у мозковій речовині. При цьому концентрація інсуліну в Ins⁺-клітинах коркової речовини тимуса при розвитку ЕЦД збільшувалася, а в мозковій речовині не змінювалася порівняно з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД не супроводжувалося змінами щільності популяції Ins⁺-клітин у тимусі, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до збільшення кількості Ins⁺-клітин у корі на 34% (р<0,05) і в медулярній зоні тимуса на 25% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. При цьому введення NnLa у дозах як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД робило односпрямовану дію й призводило до збільшення концентрації інсуліну в Ins⁺-клітинах коркової речовини тимуса на 30-38% (р<0,05) і мозкової речовини на 14-16% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Отримані нами дані збігаються з рядом інших досліджень. Так, перші повідомлення про клітинну локалізацію синтезу інсуліну в тимусі з'явилися в 1997 році (Smith K. et al., 1997). Тоді в тимусі мишей - головним чином, у мозковій речовині - були знайдені спеціалізовані клітини, експресуючі гени інсуліну й соматостатину. У 1998 році були здійснені перші спроби для встановлення клітинної приналежності АПК тимуса, експресуючих інсулін (Throsby M. et al., 1998). Отримані результати свідчили про те, що такими клітинами є дендритні клітини й макрофаги, був виявлений клітинний розподіл синтезу попередників панкреатичних гормонів: у дендритних клітинах виявлялася експресія тільки лише препроінсуліну, тоді як у макрофагах визначали експресію проглюкагону, просоматостатину й пропанкреатичного поліпептиду. Строгою виявилася послідовність і клітинна топографія експресії генів сімейства інсуліну в стромі тимуса: IGF-2 (епітеліальні клітини тимуса) - IGF-1 (тимічні макрофаги) - інсулін (епітеліальні клітини й/або дендритні клітини) (Geenen V. et al., 2003-2005). Разом з тим, за даними Derbinski J. et al. (2005) і Chentoufi A. et al. (2004) значимі кількості інсуліну, як і інших тканиноспецифічних молекул, у нормальних і NOD-мишей експресуються лише медулярнимі ЕРЦ тимуса, але не дендритними клітинами і не макрофагами. У дослідженнях Garcia et al. (2005) були виявлені проінсулін-експресуючі клітини не тільки в тимусі, але й у селезінці та циркулюючій крові, де не можуть існувати медулярні ЕРЦ тимуса. Знайдені клітини було запропоновано вважати спеціалізованими дендритними клітинами, відповідальними за формування аутотолерантності не тільки в тимусі, але й у периферичних лімфоїдних органах. Існуючі літературні дані збігаються з нашими дослідженнями, згідно яким розвиток ЕЦД супроводжується зниженням щільності популяції АПК і ЕРЦ у тимусі.

У наш час ЦД І типу розглядається як багатофакторне, полігенне захворювання, у патогенезі якого важливу роль можуть відігравати порушення функціонування цілої низки генів. До них відносять гени, що кодують молекули головного комплексу гістосумісності І і ІІ класів, інсулін, транскрипційний фактор Foxp3, цитотоксичний лейкоцитарний антиген CTLA-4, гени, що регулюють протеасомну деградацію білків і процесинг антигенів та ін. (Chentoufi A. et al., 2008). Особливе місце серед генів, критичних для розвитку автоімунної патології, займає ген автоімунного регулятора (AIRE) (Holmdahl R., 2007). Відкриття останніх років показали, що AIRE є регулятором ектопічної транскрипції в тимусі цілого ряду периферичних тканиноспецифічних антигенів (peripheral tissue-specific antigens, PTSAs) (Mathis D. et al., 2007; Kont V. et al., 2008), зокрема панкреатичних. Зміни рівня експресії AIRE у тимусі можуть істотно впливати на представництво β-клітинних антигенів і в такий спосіб порушувати процес формування центральної толерантності до них, створюючи загрозу для розвитку ЦД.

Вивчення серійних зрізів тимуса контрольних щурів, попередньо інкубованих з МКАТ до AIRE, показало, що сумарна щільність AIRE⁺-клітин у корковій речовині тимуса в 2 рази нижча (р<0,05) ніж у мозковій речовині, це відповідає даним Anderson M. et al. (2002) про переважну локалізацію AIRE⁺-клітин у медулярній зоні й на кортико-медулярній межі тимуса. При цьому метод подвійної імунофлюоресценції показав, що серед AIRE⁺-клітин ідентифікуються не лише ЕРЦ тимуса (AIRE⁺MAPC⁺), але й значна кількість тимоцитів (AIRE⁺CD4⁺). Отримані дані підтверджуються дослідженнями Suzuki E. et al. (2008), який методом проточної цитофлуоріметрії та RealTime-PCR продемонстрував, що в тимусі AIRE може бути виражений у дубль-позитивних CD4⁺CD8⁺ тимоцитах і B-лімфоцитах.

Дослідження з вивчення особливостей експресії автоімунного регулятора AIRE в тимусі експериментальних тварин з ПТГ показали вищу кількість AIRE⁺-клітин порівняно з контролем у щурів SHR при відсутності достовірних змін у нащадків щурів з ЕГД, що свідчить про можливість існування й AIRE-незалежних механізмів регуляції тимічної експресії панкреатичних антигенів. Розвиток ЕЦД не супроводжувався змінами кількості AIRE⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії Wistar, тоді як у мозковій речовині їх щільність популяції знижувалася на 35% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. При цьому концентрація білка AIRE у щурів лінії Wistar з ЕЦД вірогідно знижувалася в порівнянні з контролем в AIRE⁺-клітинах обох досліджених зон тимуса. Введення як La, так і NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД не впливало на чисельність популяції AIRE⁺-клітин тимуса. Введення La і NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД також не впливало й на показники концентрації AIRE у клітинах кори тимуса, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до достовірного зниження концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах у порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині тимуса введення La щурам лінії Wistar з ЕЦД призводило до достовірного зменшення концентрації AIRE у порівнянні з діабетичними тваринами. Схожі, однак більше виражені ефекти робило й введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг, що супроводжувалося зниженням концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах на 12-21% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості AIRE⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 33% (р<0,05) і в мозковій речовині тимуса на 50% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД не супроводжувалося змінами сумарної щільності популяції AIRE⁺-клітин у корі тимуса в порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині тимуса введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД також не впливало на щільність популяції AIRE⁺-клітин, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до збільшення їх кількості на 73% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Вивчення концентрації білка AIRE в AIRE⁺-клітинах тимуса щурів лінії SHR показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався зменшенням даного показника на 12% (р<0,05) у корі й збільшенням на 18% в (р<0,05) у мозковій речовині в порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД не впливало на концентрацію білка AIRE у корі тимуса, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до збільшення концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах на 10% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до зниження концентрації AIRE на 16% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг робило протилежний ефект і супроводжувалося збільшенням концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах на 19% (р<0,05).

Виявлена нами експресія AIRE тимоцитами (AIRE⁺CD4⁺) дозволяє припустити можливість їх участі у генерації ендогенних пептидів для негативної селекції. Крім цього, експресія AIRE була виявлена в тимоцитах і периферичних лімфоцитах і іншими дослідниками (Suzuki E.et al., 2008). У периферичній крові білок AIRE був виражений тільки в B-лімфоцитах, дендритних клітинах і макрофагах, але не в T-лімфоцитах, а мРНК AIRE була більш інтенсивно виражена в B-лімфоцитах у порівнянні з T-лімфоцитами. Nagafuchi S. et al. (2006) показали, що AIRE експресується також у людських периферичних CD4⁺ T-лімфоцитах. Дефіцит AIRE, як нещодавно продемонстрували Li J. et al. (2007), порушує пізні етапи диференціювання CD4⁺-однопозитивних тимоцитів, призводячи до скупчення незрілих клітин цього фенотипу в тимусі. Цей результат вказує, що на додаток до індукції вираження PTSAs, AIRE може також впливати на заключні етапи дозрівання тимоцитів. Оскільки AIRE-регульовані гени мають тенденцію локалізуватися в певних групах (кластерах), Kaufmann B. et al. (2007) було запропоновано, що AIRE функціонує як регулятор геномних кластерів і активізує гени в стохастичній манері. Hаssler S. et al. (2008) виявили, що дефіцит Aire викликає збільшену сприйнятливість до стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету. Крім того, макрофаги Aire^-/- мишей продукують вищі рівні продіабетогенного цитокіна TNFά і нижчі рівні супресорного цитокіну IL-10 після індукції стрептозотоцинового діабету, у Aire^-/- мишей також спостерігається більш висока частота виявлення автоантитіл до клітин панкреатичних острівців (Hаssler S. et al., 2008).

Основна частина панкреатичних антигенів і AIRE презентується ЕРЦ коркової й мозкової речовини тимуса й класичними “професійними” АПК - В-лімфоцитами, макрофагами й дендритними клітинами (Pugliese A. et al., 2001; Garcia C. et al., 2005). Тому на наступному етапі роботи ми вивчили морфофункційний стан цих компартментів тимуса в експериментальних тварин. Дослідження епітеліального компартменту і АПК тимуса в експериментальних тварин із ПТГ показали нижчий рівень кількості MHC-II⁺-клітин і збільшення числа ЕРЦ у щурів SHR, тоді як у нащадків щурів з ЕГД спостерігалася односпрямована тенденція до зниження кількості ЕРЦ і MHC-II⁺-клітин у тимусі протягом усього вивченого періоду постнатального онтогенезу.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості ЕРЦ у щурів лінії Wistar у корковій речовині тимуса на 22% (р<0,05) і в мозковій речовині на 24% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і супроводжувався змінами співвідношення окремих типів ЕРЦ. Характерно, що введення як La, так і NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД робило односпрямовані ефекти й призводило до достовірного збільшення загальної кількості ЕРЦ у корі на 38-47% (р<0,05) і в медулярній зоні тимуса на 22-44% у порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості ЕРЦ у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 23% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх кількість у мозковій речовині. Введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до збільшення кількості ЕРЦ у корковій речовині тимуса на 23-35% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як у мозковій речовині їх щільність популяції вірогідно не змінювалася.

Вивчення MHC-II⁺ АПК тимуса у щурів лінії Wistar показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості MHC-II⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 44% (р<0,05) і в мозковій речовині на 25% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. При цьому спостерігалось зниження щільності популяції MHC-II⁺-макрофагів (на 46-72%, р<0,05) і MHC-II⁺-В-лімфоцитів (на 29-37%, р<0,05) в обох зонах тимуса і зростання кількості MHC-II⁺-дендритних клітин (на 55%, р<0,05) у порівнянні з контролем. Введення La супроводжувалося збільшенням сумарної щільності популяції MHC-II⁺ клітин в обох вивчених зонах тимуса. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД також супроводжувалося збільшенням у корі тимуса кількості MHC-II⁺ клітин на 36-60% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як у медулярній зоні відзначалися дозозалежні ефекти: введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД не впливало на кількість MHC-II⁺ клітин, а збільшення дози NnLa до 50 мг/кг супроводжувалося зростанням кількості MHC-II⁺ клітин на 79% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД характеризувався збільшенням кількості MHC-II⁺ клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 45% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і зменшенням на 24% (р<0,05) у мозковій речовині. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД викликало односпрямовані ефекти й супроводжувалося збільшенням щільності популяції MHC-II⁺ клітин у корковій речовині тимуса 2,8-2,9 раза (р<0,05) і в мозковій речовині в 2,2-3,3 раза (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Отримані дані дозволяють припускати про важливу роль зниження кількості АПК і ЕРЦ у тимусі як про один із важливих імунних механізмів розвитку ЕЦД, тому що саме ці клітини є основними інсулін- і AIRE-експресуючими клітинами, а зміна їх кількості впливає на інтенсивність презентації β-клітинних антигенів і формування центральної толерантності до них. Крім того, ЕРЦ здатні впливати на перебіг процесів селекції тимоцитів за допомогою синтезу цілого ряду цитокінів, факторів росту, нейропептидів і власних тимічних гормонів (Savino W. et al., 2000; Anderson G. et al., 2001).

Проблема дослідження молекулярних механізмів апоптозу та його ролі в розвитку автоімунних захворювань, у тому числі і ЦД, в останні роки є однією із найважчих і актуальних проблем медико-біологічних наук (Ярилин А.А. и др., 2001; Барышников А. Ю. и др., 2002; Langenau D. et al., 2005). Одними з основних регуляторів апоптозу в тимусі є білки Bcl-2 і р53. Продукт гена bcl-2 - білок Bcl-2 є найважливішим репресором апоптозу, що має подвійну дію: може функціонувати і як іонний канал, і як адапторний білок (Marsden V. et al., 2003). Він експресується на мембрані мітохондрій, меншою мірою - на ядерній мембрані і на поверхні клітин (Zhang N. et al., 2005; Hemann M. et al., 2006).

Нами встановлено, що у експериментальних тварин із ПТГ спостерігався вищий рівень експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 порівняно з контролем. Так, у щурів лінії SHR у корковій речовині тимуса кількість Bcl-2⁺-клітин була більшою на 44% (р<0,05), а в мозковій речовині на 18% (р<0,05). Вивчення щільності популяції Bcl-2⁺-клітин в тимусі у нащадків щурів з ЕГД показало збільшення їхньої кількості в корковій речовині в 2,4-4,5 раза (р<0,05) і в мозковій в 1,5-2,7 раза (р<0,05) в усі вивчені вікові періоди постнатального онтогенезу в порівнянні з контрольними тваринами відповідного віку.

Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався збільшенням кількості Bcl-2⁺-клітин у корковій речовині тимуса в 2 рази (р<0,05) і в мозковій речовині на 64% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин та призводив до підвищення концентрації білка Bcl-2 в усіх класах Bcl-2⁺-клітин у корі (на 18-39%, р<0,05) та у Bcl-2⁺-середніх лімфоцитах у медулярній зоні. Введення La щурам лінії Wistar з ЕЦД не впливало на чисельність популяції Bcl-2⁺-клітин у тимусі, тоді як введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг призводило до зниження кількості Bcl-2⁺-клітин у корі тимуса на 52-53% (р<0,05) і в медулярній зоні на 43-56% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR супроводжувався збільшенням кількості Bcl-2⁺-клітин у корковій речовині тимуса на 63% (р<0,05) і в мозковій речовині на 41% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і призводив до зростання концентрації білка Bcl-2 в Bcl-2⁺-клітинах кори на 13-17% (р<0,05) і мозкової речовини на 9-15% (р<0,05). При цьому спостерігались порушення співвідношення окремих класів Bcl-2⁺-клітин у щурів обох ліній. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до зменшення кількості Bcl-2⁺-клітин у корі тимуса на 64-65% (р<0,05) і в мозковій речовині на 62-64% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Особливе місце в регуляції апоптозу тимоцитів займає проапоптотичний білок р53 (Royds J. et al., 2006; Levine A. et al., 2006; Чумаков П. М., 2007). Відомо, що ушкодження ДНК сприяє накопиченню р53, що, у свою чергу, блокує прогресію клітинного циклу у фазі G1, перешкоджаючи, таким чином, реплікації ДНК до репарації ушкодження (Adimoolam S. et al., 2002). Якщо репарація ушкодження неможлива, то білок р53 запускає механізм апоптозу. При цьому білок р53 здатний не тільки активувати гени, що беруть участь в індукції клітинної смерті за рахунок своєї транскрипційної функції, але й бере безпосередню участь в індукції мітохондріального шляху апоптозу (Braithwaite A. et al., 2005; Chipuk J. et al., 2006; Deppert W., 2007). Р53 вступає у взаємодію з BH4-доменом антиапоптотичних білків BclXL і Bcl2 (Hemann M. et al., 2006), зв'язування з якими вивільняє й активує проапоптотичні білки Bax і Bid.

У експериментальних тварин із ПТГ спостерігалися зміни рівня експресії білка р53: щільність популяції р53⁺-клітин була на 18-24% (р<0,05) вища, ніж у контролі, в обох вивчених зонах тимуса щурів SHR, вірогідно знижувалася в корковій речовині тимуса у нащадків щурів з ЕГД у дво- і шестимісячному віці та змінювалася різноспрямовано в мозковій речовині: знижувалася в 1-місячних нащадків, збільшувалася у 2-місячних у порівнянні з контрольними тваринами відповідного віку, і не змінювалася в більш пізні терміни постнатального онтогенезу.

Вивчення експресії білка р53 у щурів лінії Wistar показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався збільшенням кількості p53⁺-клітин у корковій речовині тимуса на 36% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і зростанням концентрації білка р53 в усіх класах p53⁺-клітин кори на 7-21% (р<0,05), і не впливав на ці показники у медулярній зоні. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД не впливало на кількість p53⁺-клітин у корі тимуса, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до зниження їх щільності популяції на 19% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині тимуса введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам з ЕЦД не супроводжувалося змінами кількості p53⁺-клітин. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR супроводжувався зниженням кількості p53⁺-клітин у корковій речовині тимуса на 45% (р<0,05) і в мозковій речовині на 30% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, а також призводив до зниження концентрації білка р53. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД викликало односпрямовані ефекти в корі тимуса й призводило до збільшення кількості p53⁺-клітин на 38% (р<0,05) і 53% (р<0,05) відповідно в порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД також призводило до збільшення щільності популяції p53⁺-клітин на 62% (р<0,05), тоді як збільшення дози NnLa до 50 мг/кг викликало протилежні ефекти і призводило до зниження кількості p53⁺-клітин на 33% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами й в 2,1 раза (р<0,05) у порівнянні з контролем.

Серед факторів, що роблять важливий вплив на функціональний стан лімфоїдного і епітеліального компартментів тимуса в нормі і при експериментальній патології, є оксид азоту (NO), що може дозозалежно впливати на апоптоз і диференціювання тимоцитів (Fehsel K. et al., 1995; Zhou X. et al., 2000; Hildeman D. et al., 2003). Так, W. Niedbala et al. (2006) встановили, що високі дози NO роблять цитотоксичну дію, у той час як низькі – підсилюють виживаність Т-лімфоцитів і вибірково збільшують диференціювання мишачих Th 1 типу, не впливаючи на Th 2-клітини. Основним продуцентом NO у тимусі є індуцибельна NO-cинтаза. Дослідження з вивчення особливостей тимічної експресії iNOS у експериментальних тварин із ПТГ показали достовірне зниження кількості iNOS⁺-клітин в тимусі у щурів лінії SHR і збільшення їх щільності популяції порівняно з контролем у нащадків щурів з ЕГД. Так, у корковій речовині тимуса у нащадків щурів з ЕГД кількість iNOS⁺-клітин протягом 1-6 місяців постнатального онтогенезу зростала на 23-78% (р<0,05), у мозковій – на 19-75% (р<0,05) порівняно з контрольними тваринами відповідного віку.

Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався збільшенням кількості iNOS⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 62% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх щільність у мозковій речовині. Введення La щурам з ЕЦД призводило до збільшення щільності популяції iNOS⁺ клітин у корі тимуса на 21% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами і не спричиняло до змін щільності популяції в медулярній зоні. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД викликало односпрямовані ефекти й супроводжувалося зниженням щільності популяції iNOS⁺ клітин у корі на 72-75% (р<0,05) і в мозковій речовині на 56-62% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Визначення кількості білка iNOS у гомогенатах тимуса методом SDS-PAGE-електрофорезу з наступним імуноблотингом показало, що розвиток ЕЦД супроводжується збільшенням експресії iNOS у тимусі щурів лінії Wistar в 4 рази (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД призводить до зниження кількості iNOS в 2,3 раза (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, залишаючись проте на 79% (р<0,05) вище рівня контрольних значень. Підвищення дози NnLa до 50 мг/кг робить більш вираженим ефект і супроводжується зменшенням кількості iNOS в 7,4 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами й у 1,8 раза (р<0,05) у порівнянні з контролем. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR супроводжувався збільшенням кількості iNOS⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 31% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх кількість у мозковій речовині.

Отримані результати дають можливість припустити наявність тісного зв'язку між змінами експресії Bcl-2, р53, iNOS і рівнем апоптотичних процесів у тимусі. Можливо, що гіперекспресія Bcl-2, з одного боку, захищає від NO-опосередкованого апоптозу, а з іншого сприяє виживанню аутореактивних клонів лімфоцитів. Крім того, можна припустити односпрямованість ефектів NO і Bcl-2 відносно блокування апоптозу - антиапоптотична дія NO може бути опосередкована через синтез цГМФ із наступним інгібуванням каспаз або підвищенням експресії Bcl-2 (Bogdan C., 2000). Проте є й протилежні дані, згідно з якими при дії NO на клітину знижується рівень білка Bcl-2 через каспаз-індуковане розщеплення (Tejedo J. et al., 1999) або р53-залежне придушення його експресії (Mebmer U. et al., 1996). З іншого боку, Сагач В.Ф і співавт. (2004) продемонстрували, що преінкубація мітохондрій з інгібітором NO-синтаз L-NAME вірогідно збільшувала величину Са²⁺-індукованого набрякання мітохондрій серця й стимулювала відкриття мітохондріальної пори (МП), тоді як введення в інкубаційне середовище донора NO нітропрусиду натрію після додавання L-NAME відновлювало типове Са²⁺-індуковане набрякання. Ці результати суголосні нашим даним про зниження експресії Bcl-2 у тимусі після введень блокаторов NOS, оскільки відомо, що білок Bcl-2 перешкоджає відкриттю МП.

Не менш важливим регулятором процесів апоптозу й диференціювання тимоцитів є білок c-Fos. Відомо, що стимуляція спочиваючих клітин призводить до проліферації, що супроводжується експресією генів «негайної ранньої відповіді», серед яких особливий інтерес представляє протоонкоген c-fos (Mikula M. et al., 2003). Короткочасна активація експресії c-fos має важливе значення для переходу клітин з фази G0 у фазу G1 клітинного циклу. Продукт гена c-fos (білок c-Fos) утворює гетеродимер з білками сімейства c-jun, формуючи транскрипційний комплекс АР-1 (Wagner E., 2001; Shaulian E. et al., 2001; Raivich G. et al., 2006), який бере участь у підтримці базального рівня експресії багатьох генів. АР-1 є однією з головних мішеней для сполук, що викликають клітинну проліферацію або диференціювання (Ameyar M.etal., 2003). Останнім часом встановлений тісний зв'язок між інтенсивністю експресії c-Fos і рівнем апоптотичних процесів у тимусі. Зокрема, Okada S. (2003) показав можливість впливу с-Fos на NO-залежний апоптоз, що обумовлено його можливістю виступати в ролі негативного регулятора транскрипції iNOS. Крім того, була виявлена можливість впливу с-Fos на апоптоз через систему рецепторів до фактору некрозу пухлини альфа (TNFα) (Koichi M. et al., 2004), а дослідження молекулярних механізмів функціонального дозрівання тимоцитів показало зростання трансляції c-fos при проходженні позитивної селекції (Nunomura S. et al., 2000).

Дослідження з вивчення особливостей тимічної експресії білків ранньої відповіді c-Fos у експериментальних тварин з ПТГ показали збільшення кількості c-Fos⁺ клітин на 52% (р<0,05) у мозковій речовині тимуса у щурів лінії SHR і достовірне зменшення їхньої щільності популяції в порівнянні з контролем у нащадків щурів з ЕГД. Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався зменшенням кількості c-Fos⁺ клітин у корі тимуса на 27% (р<0,05) і в мозковій речовині на 23% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, а також призводив до зниження концентрації білків ранньої відповіді на 11-24% (р<0,05) у корковій речовині і на 14-26% (р<0,05) у мозковій в усіх класах c-Fos⁺ клітин. Введення La щурам з ЕЦД не впливало на щільність популяції c-Fos⁺ клітин у корі і супроводжувалося зниженням на 18% (р<0,05) їх кількості в медулярній зоні тимуса. У той же час, введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг призводило до достовірного збільшення кількості c-Fos⁺ клітин у корі тимуса на 47-73% (р<0,05) і в мозковій речовині на 26-31% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR також супроводжувався зменшенням кількості c-Fos⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 34% (р<0,05) і в мозковій речовині на 61% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, але призводив до достовірного зростання концентрації білків ранньої відповіді. При цьому у щурів обох ліній при діабеті спостерігались порушення співвідношення окремих класів c-Fos⁺-лімфоцитів. Характерно, що введення NnLa щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до зниження кількості c-Fos⁺ клітин у тимусі в порівнянні з діабетичними тваринами.

Важливими регуляторами процесинга антигенів у тимусі є білки теплового шоку. Велика кількість функцій Hsp пов'язана з їх здатністю зв'язуватися практично з усіма пептидами, що синтезуються в клітці - як з нормальними, так і з патологічно зміненими й у вигляді таких комплексів брати участь у різноманітних клітинних процесах (фолдінг, транспортування білків, захист клітин від стресів різного генезу та ін.) (Schmitt E. et al., 2007; Asea A., 2007; Whitham M. et al., 2008; Saibil H., 2008). Зміни рівня експресії Hsp у тимусі можуть впливати на диференціювання тимоцитів через виражені антиапоптотичні ефекти стрес-білків (Gabai V. et al., 2002; Garrido C. et al., 2003; Aria R. et al., 2007; Daugaard M. et al., 2007). Можливість активної участі Hsp у патогенезі автоімунних захворювань обумовлена їх здатністю зв'язувати в клітині фрагменти практично будь-яких білків, що підтверджується структурними дослідженнями Zhu X. et al., 1996, Linderoth N. et al., 2000, Vogen S.et al., 2002, у яких була показана наявність пептид-єднальних кишень у молекулах Hsp70 і gp96. На поверхні АПК були виявлені рецептори до Hsp-пептидних комплексів (Hsp-pc), у ролі яких можуть виступати CD91, CD14, молекули TLR2 і TLR4 (Binder R. et al., 2000; Asea A. et al., 2002). АПК, активовані Hsp-pc, викликають активацію клітинної і гуморальної імунних відповідей проти антигенів тканин, з яких ці Hsp-рс виділені, що створює передумови для розвитку автоімунної реакції (Raska M. et al., 2005).

Аналіз інтенсивності специфічного фарбування PVDF-мембран показав, що розвиток ЕЦД супроводжується збільшенням кількості Hsp70 у тимусі щурів лінії Wistar в 2,6 раза (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД призводить до зниження кількості Hsp70 на 47% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг робить більш виражений ефект і супроводжується зменшенням кількості Hsp70 в 2,9 раза (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, сприяючи поверненню показників до рівня контрольних значень. Виявлене нами збільшення експресії Hsp70 у тимусі при ЕЦД може сприяти виробленню центральної толерантності до панкреатичних антигенів через їх додаткову “незаплановану репрезентацію” у комплексі зі стрес-білками в ході негативної селекції тимоцитів. Цей процес “репрезентації” (тобто виділення антигенних детермінант із комплексів з одними молекулами й презентація в комплексах з іншими) містить у собі переміщення антигенних пептидів певними внутрішньоклітинними структурами і супроводжується також синтезом широкого спектру прозапальних цитокінів і костимулюючих молекул (Basu S. et al., 1998; Doody A. et al., 2004; Multhoff G., 2007).

Важливими регуляторами апоптозу й процесингу антигенів у тимусі є імунні протеасоми, що генерують пептиди для селекції тимоцитів (Wojcik C., 2002; Konstantinova I. et al., 2008; Murata S. et al., 2008). Заміна конститутивних субодиниць протеасом на імунні відбувається за певних умов, наприклад, під впливом IFNg (Goldberg A., 2007; DeMartino G. et al., 2007). При цьому конститутивні каталітичні субодиниці X(b5), Y (b1) та Z(b2) заміщуються на імунні субодиниці LMP7 (b5i), LMP2 (b1i) і LMP10 (b2i) (Borissenko L. et al., 2007). При гідролізі білків імунними протеасомами в кілька разів зростає вихід олігопептидів довжиною 8-11 амінокислотних залишків. Олігопептиди такої довжини відповідають розмірам антигенних епітопів. У комплексі з молекулами MHC I класу вони виносяться на поверхню клітини та більш ефективно презентуються тимоцитам у ході їх селекції (Абрамова Е. Б и др., 2005; Шарова Н. П. и др., 2006). Протеасоми є важливими регуляторами селекції тимоцитів. Причому, якщо імунні субодиниці контролюють головним чином негативну селекцію (Sharova N., 2006), тo нещодавно відкрита субодиниця β5t, виражена винятково в коркових ЕРЦ і названа “тимопротеасомою”, як припускають, є відповідальною за позитивну селекцію тимоцитів (Murata S. et al., 2007). Субодиниця β5t включається в 20S протеасому замість субодиниці b5i (LMP-7). Характерно, що інші дві каталітичні субодиниці, що входять у тимопротеасому - це LMP-2 і MECL1, однак вони представлені в коркових ЕРЦ слабкіше, ніж b5t.

          Нами встановлено, що у експериментальних тварин із ПТГ спостерігалися зміни експресії імунної субодиниці протеасоми LMP-2: щільність популяції LMP-2⁺-клітин достовірно знижувалася у щурів лінії SHR і в корі тимуса у нащадків щурів з ЕГД, і змінювалася фазно в медулярній зоні - знижувалася у 1-місячних нащадків, збільшувалася у дво- і тримісячних нащадків, а з 6-місячного віку відзначалася друга хвиля зниження їх кількості порівняно з контрольними тваринами відповідного віку.

Розвиток ЕЦД супроводжується зниженням кількості LMP-2⁺-клітин на 35-44% (р<0,05) в обох вивчених зонах тимуса у щурів лінії Wistar і в мозковій речовині у щурів SHR, що, можливо, спричиняє дефект генерації ендогенних пептидів для негативної селекції тимоцитів. Кількість LMP-2⁺-клітин після введень NnLa діабетичим тваринам достовірно збільшується в тимусі у щурів лінії SHR, тоді як у щурів лінії Wistar знижується в корі й збільшується в медулярній зоні тимуса. Характерно, що серед LMP-2⁺-клітин методом подвійної імунофлюоресценції ідентифікувалися як ЕРЦ (LMP-2⁺MAPC⁺), так і тимоцити (LMP-2⁺CD4⁺). Виявлена експресія імунних протеасом тимоцитами, а також виявлені дані про експресію AIRE цими ж клітинами, дозволяє нам припустити, що не тільки ЕРЦ тимуса, а й тимоцити беруть активну участь у генерації ендогенних пептидів для негативної селекції. Отримані нами дані збігаються з рядом інших досліджень. Так, вивчення імунних протеасом у тимусі щурів методом Weste blotting та імуногістохімії (Melnikova V. et al., 2008) показало, що LMP2 і LMP7 субодиниці виявляються в ЕРЦ як кори, так і мозкової речовини тимуса. Крім того, експресія LMP2 і LMP7 була виявлена й у тимоцитах також. Однак кількість імунопозитивного матеріалу в тимоцитах була нижче, ніж в ЕРЦ. Вивчення внутрішньоклітинної локалізації LMP2 і LMP7 субодиниць показало їхнє розташування в цитоплазмі клітин. Імунні субодиниці LMP7 і LMP2 виявляються в достатній кількості й у пулах протеасом селезінки щурів та інших лімфоїдних органах (Sharova N., 2006).

          Численні дослідження останніх років свідчать, що важливу роль у забезпеченні імунологічної аутотолерантності і негативному контролі як патологічних, так і фізіологічних імунних реакцій відіграє популяція натуральних CD4⁺CD25⁺регуляторних Т-клітин (Т_reg) (Фрейдлин И. С., 2005; Piccirillo C. et al., 2004; Annunziato F. et al., 2002; Paust S. et al., 2004; Randolph D. et al., 2006). Елімінація або інактивація цих клітин викликає розвиток важких автоімунних захворювань, а також призводить до посилення імунної відповіді на алоантигени і пухлинні клітини (Sakaguchi S., 2004; Ярилин А. А. и др., 2005).

У експериментальних тварин із ПТГ спостерігалося зниження кількості Т_reg-клітин у тимусі за винятком 3-місячних нащадків щурів з ЕГД, у яких їх щільність популяції в корі тимуса зростала порівняно з контролем. Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався зниженням кількості Т_reg-клітин у корковій речовині тимуса на 45% (р<0,05) і в мозковій речовині на 61% (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин. Введення La щурам щурів лінії Wistar з ЕЦД не впливало на щільність популяції CD25⁺ лімфоцитів, тоді як введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до зростання кількості Т_reg-клітин у корі тимуса відповідно на 46% і в 2,4 раза (р<0,05) та у медулярній зоні в 3-3,1 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR викликав ідентичні ефекти та супроводжувався зниженням кількості Т_reg-клітин в обох вивчених зонах тимуса на 31-32% (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до збільшення кількості Т_reg-клітин у корі тимуса відповідно на 77% і в 2,3 раза (р<0,05) і у мозковій речовині на 35% і в 2 рази (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами.

Отримані результати збігаються з численними даними про функціональну дефектність Т_reg –клітин, що була виявлена при багатьох автоімунних захворюваннях людини і моделюючій їх експериментальній патології, насамперед при ЦД І типу (Sakaguchi S., 1995-2004). Так, у мишей-самок лінії NOD, у яких спонтанно розвивається захворювання, що моделює ЦД типу І, Т_reg - клітини-продуценти TGFβ визначаються в острівцевій тканині, але їхній зміст і функціональна активність знижуються з віком (Pop S. et al., 2005). Введення СD4⁺СD25⁺ Т-клітин дозозалежно знижує частоту спонтанного розвитку діабету у мишей лінії NOD. Ці клітини скасовують індукцію діабету при адоптивному переносі СD4⁺СD25⁺-клітин від мишей NOD (Piccirillo C. et al., 2005). Дефект супресорних функцій Т_reg -клітин був виявлений і у пацієнтів з ЦД І типу, що проявлялося зниженням продукції IL-10 і зміною змісту внутрішньоклітинного CTLA 4 (Lindley S. et al., 2005). Цікаво, що дослідження Aschenbrenner та ін. (2007) показали залежність диференціювання T_reg у тимусі від рівня експресії Aire, а Chen Z. et al. (2005) продемонстрували спільні дії в ефектах мутацій у генах Foxp3 і Aire: хвороба в мишей, мутантних за двома генами протікала значно важче, ніж при дефіциті хоча б одного фактору.

У експериментальних тварин із ПТГ спостерігалася більш низька кількість проліферуючих лімфоцитів: так, у корі тимуса у щурів SHR їхня щільність популяції була нижчою в 4,3 раза (р<0,05) і в медулярній зоні в 2 рази (р<0,05) порівняно з контролем, у нащадків щурів з ЕГД протягом 1-6 місяців постнатального життя відповідно на 68-75% (р<0,05) нижче в корі і на 44-65% (р<0,05) у мозковій речовині тимуса. Вивчення проліферативної активності лімфоцитів тимуса у щурів лінії Wistar показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості PCNA⁺ лімфоцитів у корковій речовині тимуса на 76% (р<0,05) і в мозковій речовині тимуса на 61% (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин. Введення La щурам з ЕЦД не супроводжувалося змінами сумарної щільності популяції PCNA⁺ лімфоцитів, тоді як введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до збільшення кількості проліферуючих клітин в обох досліджених зонах тимуса в 2,1-3,7 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами, при цьому більше виражений ефект спостерігався при дозуванні NnLa 10 мг/кг. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR не впливав на кількість PCNA⁺ лімфоцитів у тимусі. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг призводило до збільшення сумарної щільності популяції проліферуючих клітин у корі тимуса відповідно в 2,4 раза і 2,8 раза (р<0,05) та у мозковій речовині в 2 рази й 2,4 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами.

У цілому аналіз впливів курсових введень блокатора NOS NnLa на функціональний стан тимуса, незважаючи на існуючі лінійні відмінності й дозозалежні особливості, дозволяє виділити ряд загальних закономірностей (мал.1). По-перше, варто виокремити той факт, що введення NnLa як у щурів лінії Wistar, так і у щурів лінії SHR кардинально змінюють цитоархітектоніку тимуса, що, насамперед, обумовлено його здатністю підсилювати проліферативну активність. По-друге, звертає на себе увагу загальна тенденція по впливу введень блокаторів NOS на диференціювання тимоцитів – у тварин обох ліній спостерігається достовірне зменшення числа цитотоксичних CD8⁺ лімфоцитів і збільшення кількості CD4⁺ лімфоцитів порівняно з діабетичними тваринами (див. мал.1). При цьому введення NnLa призводять і до збільшення кількості натуральних імунорегуляторних Т-клітин. По-третє, посилення проліферативної активності клітин тимуса після введень NnLa, вочевидь, є однією із причин виявленого нами збільшення кількості ЕРЦ і MHCII⁺ клітин. Зі зміною морфофункційного стану АПК тимуса після введень NnLa, безумовно, пов'язані й виявлені нами зміни кількості тимічного інсуліну й автоімунного регулятора, тому що саме ЕРЦ і MHC-II⁺ клітини є основними інсулін- і AIRE-експресуючими клітинами тимуса.