дослідження нейронів та астроцитів гіпокампа в ранній період розвитку експериментального цукрового діабету

Короткий зміст

Матеріали та методи досліджень. Дослідження виконані на 165 статевозрілих самцях щурів лінії Вістар масою 200-250 г., які були отримані з віварію Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця. Тварини знаходилися в умовах природного світлового режиму та у вільному доступу до води та їжі. Усі експерименти були виконані на тваринах з дотриманням норм та принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин (European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes, 1986). Для дослідження змін стану нервової системи була використана стрептозотоцинова модель індукції цукрового діабету. Цей спосіб моделювання діабету є визнаним в світі, оскільки стрептозотоцин вибірково пошкоджує β-клітини острівців Лангерганса та дуже швидко метаболізується в організмі без утворення токсичних речовин (Полторак В.В., и соавт., 1989). Одноразове внутрішньочеревне введення стрептозотоцину (Sigma-Aldrich, США), розчиненого в  0,1 М цитратному буфері (45 мг/кг), призводило до виникнення симптомів цукрового діабету вже після третьої доби.

В роботі було здійснено дослідження стану нейронів та астроцитів гіпокампа у контрольних тварин та у щурів з експериментальним цукровим діабетом на 3, 7 та 14 добу від початку патологічного процесу. Ці проміжки часу були обрані з урахуванням динаміки глікемії у тварин із стрептозотоциновим цукровим діабетом (Орловский М.А., 2004).

На першому етапі роботи з метою виключення прямого токсичного впливу стрептозотоцину на клітини гіпокампа було здійснено вивчення його прямої дії на клітини органотипової культури гіпокампа. Для проведення експерименту відбирали життєздатні культивовані слайси гіпокампа. Для визначення дії стрептозотоцину на нейрони гіпокампа здійснювали інкубацію зрізів в середовищі, що містила 0,2 мкМоль/л антибіотику протягом 30 хвилин. Наявність виникнення нейронів, що забарвлені пропідиумом йодидом, свідчить про пошкодження клітин. Стан слайсів оцінювали за допомогою інвертованого мікроскопу Zeiss Telaval 31.

На другому етапі дослідження було здійснено вивчення змін морфології нейронів та астроцитів в гіпокампі щурів на 3, 7 та 14 добу після введення стрептозотоцину.

З метою оцінки взаємного розташування нейронів, астроцитів та визначення стану хроматину в клітинах ми здійснювали потрійне забарвлення зрізів гіпокампа Hoechst-33342, антитілами проти GFAP та NeuN. Вторинні антитіла були підібрані таким чином, щоб спектри їх емісії мали мінімальне перекриття. Це дозволило здійснити потрійне забарвлення зрізів гіпокампа та вивчити флуоресценцію Hoechst-33342, Alexa-488 та Alexa-568 в окремих каналах чи поєднуючи зображення разом. Барвник Hoechst-33342 здатен зв’язуватись з ДНК, що дозволяє оцінити стан хроматину та ідентифікувати клітини з ознаками дегенерації. Кількість нейронів пірамідного шару СА1, СА2 та СА3 зон гіпокампа та їх розподіл визначали з використанням антитіл до специфічного нейронального протеїну NeuN. Оскільки цей протеїн локалізується переважно всередині ядра, досить зручним виявлялося підрахування кількості клітин, але визначення морфології відростків було неможливим. З метою дослідження стану дендритів ми здійснювали забарвлення тканини гіпокампа антитілами до білку мікротрубочок (MAP-2). Морфологію астроцитів, їх кількість та площу вивчали з застосуванням антитіл до специфічного астроцитарного білка GFAP. З метою вивчення внутрішньоклітинних змін здійснювали імуногістохімічне визначення маркерних білків в нейронах (caspase-3, Bcl-2) та астроцитах (S100B). Зрізи досліджували за допомогою конфокального мікроскопу FV1000-BX61WI (Olympus, Японія).

В препаратах, що були оброблені Hoechst-33342, ідентифікували нейрони з конденсованим та інтенсивно забарвленим хроматином та визначали їх кількість на 1 мм² площі тканини для кожної зони окремо. Кількість астроцитів, площу GFAP-позитивного матеріалу в клітинах та фактор форми визначали, користуючись програмою аналізу зображення Image Tool та Corel Photo Paint. Для зрізів, що були забарвлені антитілами проти caspase-3, вивчали кількість клітин на 1 мм², площу клітини та інтенсивність флуоресценції, визначали кількість S100B-позитивних клітин.

Також було проведено імуноферментне визначення вмісту розчинної та філаментної фракції GFAP, мембранної та розчинної форми NCAM та білку S100B в тканині гіпокампа. Окрім цього, за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції реального часу визначали рівень експресії антиапоптотичного фактору Bcl-2, субодиниць протеасом PSMB5 та PSMB9, фактора FRAP.  

На останньому етапі досліджень з метою визначення впливу глюкокортикоїдних гормонів на стан гіпокампа в перші два тижні розвитку цукрового діабету вводили блокатор синтезу глюкокортикоїдних гормонів — метирапон (Sigma-Aldrich, США). Розчин метирапону вводили щурам з експериментальним цукровим діабетом протягом 7 та 14 днів від введення стрептозотоцину. Двічі на день з інтервалом в 12 годин здійснювали підшкірні ін’єкції метирапону, який безпосередньо перед введенням розводили в стерильному фізіологічному розчині. Дворазове введення метирапону в дозі 100 мг/кг є достатнім для зниження концентрації кортикостероїдів в сироватці крові (Wright R.L. et al. 2006). Стан нейронів та астроцитів досліджували за допомогою імуногістохімічного визначення NeuN та GFAP в гіпокампі щурів, яким вводили метирапон протягом 7 та 14 діб від початку цукрового діабету.

Математична та статистична обробка результатів досліджень проводилася за допомогою персонального комп’ютера та програмних пакетів Excel XP (Microsoft Corp., США) и STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). Достовірність різниці між групами перевіряли за допомогою t-критерію Ст’юдента. Для визначення достовірності міжгрупових відмінностей також застосовували однофакторний дисперсійний аналіз ANOVA. Достовірними вважалися міжгрупові відмінності з рівнем значущості більше 95 % (p<0.05).

Результати досліджень та їх обговорення. Для перевірки адекватності застосування стрептозотоцину для індукування експериментального цукрового діабету було проведено дослідження прямої токсичної дії стрептозотоцину на нейрони в умовах культивування органотипової культури гіпокампа.