Еритроцитарна І лейкоцитарна ланки системи гемостазу в нормі та механізми їх порушень при гастральних виразках

Короткий зміст

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 760 нелінійних статевозрілих самцях білих щурів масою 180–200 г. Досліди здійснювали згідно з національними «Загальними етичними принципами дослідів на тваринах» (Україна, 2001), які узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 18.03.86), витяг з протоколу № 12 засідання Комітету з біоетики НФаУ від 10.12.08. Всі маніпуляції, які можуть спричинювати біль, проводили під етамінал-натрієвим (40 мг/кг внутрішньочеревно) або барбаміловим (60 мг/кг підшкірно) наркозом (Л.Н. Сернов, В.В. Гацура, 2000). Евтаназію проводили шляхом передозування ефірного наркозу (О.В. Стефанов зі співавт., 2001). Для виключення впливу сезонних та добових коливань (С.Е. Золотухин, 1991) на показники, які вивчали, основні дослідження були проведені в осінньо-зимовий період у ранкові години.

Вивчення функціонального стану еритроцитів як компонента гемостазу. Визначали агрегаційну активність еритроцитів, індуковану фібриногеном і аденозиндифосфорною кислотою (АДФ) (В.П. Балуда зі співавт., 1980), агрегаційний коефіцієнт еритроцитів за І.І. Міщуком (1994), адгезивну здатність еритроцитів, ступінь ушкодження мембран еритроцитів (А.И. Грицюк, Е.Н. Амосова, И.А. Грицюк, 1994).

Здатність еритроцитів активізувати коагуляційний гемостаз вивчали за показниками тромбоеластограм, які записували на чотирьохканальному тромбоеластографі «Тромб-2» (Росія), в звичайній плазмі і після внесення до неї гемолізованих та інтактних еритроцитів.

При вивченні впливу еритроцитів на систему гемостазу зіставляли результати дослідження показників згортання і фібринолізу в контролі (плазма, бідна на тромбоцити, при додаванні ізотонічного розчину хлориду натрію) та в досліді – плазма, бідна на тромбоцити, при додаванні суспензії еритроцитів (в нульовому розведенні – концентрація клітин становила приблизно 4 млн в мм³), у співвідношенні 1:1 (2 млн клітин в мм³), 1:3 (1 млн в мм³) і 1:9 (0,4 млн в мм³).

Тромбопластинову активність еритроцитів оцінювали за їх здатністю активізувати внутрішнє тромбопластиноутворення в плазмі, бідній на тромбоцити, з залученням таких методів: визначення часу рекальцифікації цитратної плазми за Howell (В.А. Макаров, 1997), каолінового часу згортання плазми за P.G. Hattersley у модифікації З.С. Баркагана (2001), силіконового часу плазми за F.K. Beller, H. Graff (В.П. Балуда зі співавт., 1980), індексу діапазону контактної активації плазми за З.С. Баркаганом (2001), активованого часткового тромбопластинового часу (каолін-кефалінового часу плазми) за J. Caen (В.А. Макаров, 1997), індексу звільнення тромбоцитарних активаторів за З.С. Баркаганом (2001), споживання протромбіну за М.А. Котовщиковою та З.Д. Федоровою, генерації тромбіну за методом W.R. Pіtney і J.V. Dacіe (В.П. Балуда зі співавт., 1980).

Вивчення тромбопластинової активності еритроцитів при їх підвищеній агрегації проводили методом визначення споживання протромбіну. Посилення агрегації еритроцитів in vitro досягали додаванням до плазми, бідної на тромбоцити, декстрану (середня молекулярна маса 80000) до кінцевої концентрації 1500 мг/дл. Тромбопластинову активність цілих і зруйнованих еритроцитів (після обробки цілих клітин трипсином) оцінювали за їх здатністю підвищувати тромбопластинову активність плазми, бідної на тромбоцити, у тестах: генерації тромбіну та часу рекальцифікації (В.П. Балуда зі співавт., 1980). Для одержання трипсинізованих еритроцитів відмиті еритроцити обробляли розчином кристалічного ферменту. У першій серії досліду брали 0,1%-вий розчин трипсину з використанням концентрованої суспензії еритроцитів (4–4,5 млн у 1 мм³) й інтактні еритроцити в такій самій концентрації; у другій серії досліду для більш глибокого ферментативного впливу на клітину використовували 0,4%-вий розчин трипсину, завись еритроцитів у більшому розведенні (800–900 тис. у 1 мм³) й інтактні еритроцити у відповідному розведенні.

Дослідження тромбін-акцелераторної здатності еритроцитів проводили за допомогою визначення тромбінового часу за Biggs, Macfarlane, протромбінового часу – за A.J. Quick; фібринстабілізувальної дії еритроцитів – за методом
Сигга, вмісту фібриногену – за методом Р.А. Рутберг, часу тромботесту – за М.А. Котовщиковою, етаноловий тест проводили за H. Godal (В.П. Балуда зі співавт., 1980); вміст продуктів деградації фібриногену і фібрину визначали за С.З. Габітовим (1982).

Антигепаринову активність еритроцитів вивчали за тромбіновим часом цитратної і рекальцифікованої депротромбінізованої плазми, за визначенням вільного гепарину в цитратній і рекальцифікованій депротромбінізованій плазмі до і після інкубації з еритроцитами (А.Б. Косырев, А.Б. Добровольский, 1998).

Фібринолітичні властивості еритроцитів вивчали за активністю фібринолізу на стандартних фібринових плівках для визначення в плазмі проактиваторів і активаторів плазміногену – за Аструпом, загальну фібринолітичну активність плазми – за Е. Бідвел, кількісне визначення плазміногену – за методом Брун, антитромбіну ІІІ – за Абільдгаардом (Г.В. Андреенко с соавт., 1981). Загальну фібринолітичну активність еритроцитів визначали за здатністю розчиняти кров’яний згусток за методом М.А. Котовщикової і Б.І. Кузника (В.В. Меньшиков, 1987).

Відокремлення ліпідної фракції еритроцитів для вивчення фосфоліпідного складу мембран проводили за методом Фолча (1957). Для розділення фосфоліпідів на окремі фракції використовували метод тонкошарової хроматографії. Ініціацію окислювальних процесів в еритроцитах здійснювали, використовуючи середовище Фентона (3 мМ перекису водню, 10 мМ сірчанокислого заліза), та інкубували еритроцити в цих умовах впродовж 1, 2 та 24 год.

Білковий спектр строми досліджували за допомогою гель-хроматографії на сефадексі (Г. Детерман, 1970). В кожній фракції визначали вміст білка за методом Lowry, сіалової кислоти – за методом Svennerholm, ліпідного фосфору –за методом Bloor (В.В. Меньшиков, 1987). Молекулярну масу білка розраховували за формулою Г. Детермана (1970).

Дослідження агрегації лейкоцитів проводили на зразках плазми, бідної на тромбоцити, з різним вмістом у ній автологічних лейкоцитів: від 0 до 13 тис. у 1 мкл. Використовували тест АДФ-агрегації і гемолізат-агрегаційний тест (З.С. Баркаган, 2001). Вплив лейкоцитів на коагуляційний гемостаз визначали за часом рекальцифікації цитратної плазми за Howell (В.А. Макаров, 1997), часом тромботесту за М.А. Котовщиковою, споживанням протромбіну за М.А. Котовщиковою та З.Д. Федоровою, тромбіновим часом звичайної і гепаринізованої плазми за Biggs, Macfarlane, активністю фібринстабілізувального фактора за Сиггом, фібринолітичною активністю крові за Е. Бідвел (В.П. Балуда зі співавт., 1980).

В роботі були використані такі експериментальні моделі гастральних виразок: іммобілізаційні виразки з подразненням віддалених від шлунка рефлексогенних зон; виразка, викликана спільним введенням преднізолону та етилового спирту; серотонінова, індометацинова, ацетилсаліцилова моделі виразок шлунка (Л.В. Яковлєва зі співавт., 2001); виразка шлунка за методом Окабе (1971).

Для оцінки системи ПОЛ і активності ферментів антиоксидантного захисту при виразці шлунка використовували метод спектрофотометрії на двопроменевому спектрофотометрі «Specord UV VIS» (Німеччина). У еритроцитах визначали вміст дієнових кон’югат (А.Н Леднев, Э.Е. Рууге, 1985), малонового діальдегіду (A. Patterson, A. Lazarov, 1955), гідроперекисів ліпідів (А.В. Арутюнян, 2000), активність супероксиддисмутази (СОД) (С. Чевари, И. Чаба, 1985), КА (M.R. L’able, P.W. Ficher, 1990), глутатіонпероксидази і вміст глутатіону (Г.Ю. Мальцев, Н.В. Тышко, 2002), активність глутатіонредуктази (Л.Б. Юсупова, 1989).

Оцінку структурно-функціональних властивостей мембран еритроцитів при виразці шлунка проводили шляхом визначення пероксидної резистентності еритроцитів за методом F. Iager, деформування еритроцитів за модифікованим методом C. Tannert і W. Lux, відносної в’язкості еритроцитів за методом А.Ф. Пирогової в модифікації М.А. Котовщикової і З.Д. Федорової (Л.В. Беркало зі співавт., 2003).

Вивчення мікроциркуляції у слизовій оболонці шлунка щурів проводили методом сканувальної електронної мікроскопії корозійних препаратів (Д.С. Саркисов, Ю.Л. Петрова, 1996).

Для вивчення ультраструктури клітин матеріал фіксували у 2,5%-вому розчині глютаральдегіду на фосфатному буфері з дозабарвленням 1%-вою осмієвою кислотою, потім зневоднювали і заливали епоксидною смолою (К.С. Волков, Н.В. Пасечко, 1997). Тканину шлунка фіксували в 10%-вому розчині нейтрального формаліну, проводили через спирти зростаючої концентрації, заливали у парафін (Л.И. Аруин, 2000). Мікротомні зрізи товщиною 5–6 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином. Світлову мікроскопію та фотографування мікропрепаратів здійснювали на мікроскопі «Olympus BX» (Японія).

Для дослідження впливу антиоксидантів на процес репарації тваринам з виразками шлунка перорально вводили мексидол («Мир-Фарм», Росія) в дозі 100 мг/кг, токоферолу ацетат («Словакофарма», Словаччина) в дозі 50 мг/кг і мелаксен («Юніфарм, Інк.», США) в дозі 30 мг/кг. Розраховували виразковий індекс в кожній групі та противиразкову активність препаратів.

Для вивчення ефективності включення антиоксидантів до комплексу традиційної антиульцерогенної терапії хворим з виразковою хворобою шлунка до стандартної терапії (опразол по 20 мг 2 рази на день, амоксицилін по 1000 мг 2 рази на день, клацид по 500 мг 2 рази на день) додавали мелаксен в дозі 6 мг раз на день ввечері. Фіброгастродуоденоскопію проводили за допомогою фіброгастродуоденоскопа «Фуджинон» (Японія), внутрішньошлункову рН-мет­рію – за методом В.М. Чернобрового (1990). Гістологічному дослідженню підлягали біоптати (не менше 3–4 біоптатів), взяті із країв виразки та тіла шлунка до, після та у віддалений термін (до 3 років) за допомогою світлового мікроскопа. Наявність та ступінь обсіменіння СОШ H. pylori визначали двома методами, матеріал для постановки яких брали під час проведення ендоскопії з середньої третини антрального відділу та середньої третини тіла шлунка: мікроскопією забарвлених барвником Романовського–Гімзи мазків-відбитків і за допомогою швидкого уреазного тесту, який являє собою біохімічний метод визначення уреази в біоптаті (А.О. Авраменко, 1998).

Статистичну обробку одержаних результатів проводили методам варіаційного аналізу (ANOVA) з використанням пакета прикладних програм Statistica for Windows ХР 5,1, t-критерію Стьюдента на ПЕОМ Pentium-5, а також за допомогою пакетів прикладних програм для ПЕОМ (S-Plus 2000), Excel (С.Н. Лапач, 2000).

Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом нашої роботи стало з’ясування ролі еритроцитів у первинному гемостазі. Вивчення показників агрегатограми показало, що агрегація, швидкість утворення агрегатів та агрегаційний коефіцієнт інтактних еритроцитів були виражені більшою мірою при дії АДФ, ніж при стимуляції фібриногеном. Гемолізовані еритроцити сильніше, ніж інтактні, чинили вплив на адгезивно-агрегаційну активність також при дії АДФ. Нами виявлена характерна друга хвиля на агрегатограмах гемолізованих еритроцитів, одержаних при стимуляції АДФ. Це є непрямим підтвердженням «реакції вивільнення» з еритроцитів внутрішньоклітинного агрегувального агента – АДФ.

Одержавши дані про те, що еритроцити беруть участь у первинному гемостазі, ми вивчили вплив інтактних еритроцитів на вторинний гемостаз. На першому етапі ми дослідили прямий вплив цілих еритроцитів на першу фазу згортання крові – фазу утворення протромбінази – за внутрішньою (кров’яною) системою. Одержані результати свідчили про те, що інтактні еритроцити вірогідно підвищують загальний коагулювальний потенціал плазми, бідної на тромбоцити. У нульовому розведенні вплив еритроцитів на прискорення часу рекальцифікації плазми в 4,4 раза перевищував такий безтромбоцитарної плазми. Завись еритроцитів у співвідношеннях 1:1; 3:1; 9:1 скорочувала час рекальцифікації в 4,1; 3,9; 3,2 раза відповідно в порівнянні з контрольною плазмою. Каоліновий час згортання вірогідно скорочувався: у нульовому розведенні – у 2,1 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 – у 1,6; 1,4 і 1,2 раза відповідно. Силіконовий час плазми зменшувався у нульовому розведенні в 3,1 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 – у 2,0; 1,7 і 1,3 раза відповідно. При вивченні індексу діапазону контактної активації (ІДКА) встановлено, що при використанні всіх концентрацій еритроцитів індекс вірогідно знижувався відносно даного показника плазми. Відомо, що цей тест характеризує початкову фазу згортання крові – внутрішній механізм формування протромбіназної (тромбопластинової) активності, для реалізації якої, крім плазмових факторів згортання, потрібен фактор 3 тромбоцитів. Зменшення ІДКА в наших дослідах у плазмі, бідній на тромбоцити (в умовах відсутності фактора 3 тромбоцитів), свідчило про те, що еритроцити перекривають його дефіцит шляхом виділення в плазму ТФЕ, аналогічного фактору 3 тромбоцитів.

Одержані дані свідчили про активізуючий вплив еритроцитів на процес внутрішнього тромбопластиноутворення. Паралельно ми визначали кефалін-каоліновий час (стандартизований за контактом парціальний тромбопластиновий час) згортання плазми, бідної на тромбоцити. В цьому контрольному тесті до плазми крім каоліну (активація контактного процесу згортання) ми додавали аналог фактора 3 тромбоцитів – кефалін. В умовах подвійної активації гемостазу – кефаліном та тромбопластиновим фактором еритроцитів – згортання плазми значно прискорювалося: в нульовому розведенні – в 3,1 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 – у 2,5; 1,9 і 1,7 раза відповідно порівняно з контролем. Про безпосередній активізуючий вплив еритроцитів на внутрішнє тромбопластиноутворення свідчило також відмічене нами підвищення споживання протромбіну: в нульовому розведенні – в 4,5 раза, у розведеннях 1:1; 3:1; 9:1 – у 4,2; 2,9 і 2,3 раза відповідно.

Слід зазначити, що значне розведення еритроцитів (9:1) знижувало їхню коагулювальну активність. Незначне розведення, що відповідає фізіологічним коливанням вмісту еритроцитів у крові тварин, не робило помітного впливу на їхній коагулювальний потенціал. Результати досліджень дозволили нам дійти висновку про здатність цілих еритроцитів активізувати внутрішнє тромбопластиноутворення.

Наступним етапом експерименту стало вивчення тромбопластинової активності еритроцитів (за споживанням протромбіну) в умовах достатньої (у скляній пробірці) та зниженої (у силіконованій пробірці) активації фактора Хагемана. Тест споживання протромбіну проводили в плазмі, бідній на тромбоцити; багатій на тромбоцити-І (230–480 тис. у 1 мм³); багатій на тромбоцити-ІІ (60–82 тис. у 1 мм³) при додаванні суспензії еритроцитів. Встановлено, що тромбопластинова активність еритроцитів виявлялася в плазмі, бідній на тромбоцити, почасти – у плазмі, багатій на тромбоцити-ІІ, і зовсім не виявлялася в плазмі, багатій на тромбоцити-І. При зниженій активації фактора Хагемана тромбопластинова активність еритроцитів виявлялася й у плазмі з високим вмістом тромбоцитів. Останнє пов’язано, на нашу думку, з тим, що в умовах зниженого утворення контактного фактора знижується і мобілізація тромбоцитарного фактора 3 (виникає його дефіцит), що створює умови для виявлення активності еритроцитів. Поряд з цим звертає на себе увагу однаковий ступінь підвищення споживання протромбіну під впливом еритроцитів у плазмі, бідній на тромбоцити, у скляній і силіконованій пробірках. Це дозволяє нам вважати, що активізуючий вплив еритроцитів на внутрішнє тромбопластиноутворення, на відміну від тромбоцитів, зберігається і при зниженій активації фактора Хаге­мана.

Далі ми вивчили тромбопластинову активність еритроцитів при їх підвищеній агрегації. Посилення агрегації еритроцитів поєднане з певними змінами фізико-хімічних властивостей поверхні мембрани (В.Б. Воробьев, 2004). У зв’язку з цим виникло питання: якою мірою підвищена агрегація клітин здатна впливати на активність ТФЕ. Нас цікавила також залежність ТФЕ від властивостей поверхні мембрани клітини. Тромбопластинову активність визначали методом споживання протромбіну в звичайній плазмі, в плазмі з декстраном і паралельно в аналогічних пробах після додавання суспензії автологічних еритроцитів. Встановлено, що під впливом декстрану в суспензії еритроцитів закономірно збільшувалась кількість агрегованих клітин з наростанням величини агрегатів. Індекс еритроцитарної активності збільшувався при концентрації декстрану 1000 та 1500 мг/дл, що відповідало подовженню часу споживання протромбіну в плазмовій суспензії еритроцитів у середньому на 26 %, тоді як споживання протромбіну в самій плазмі після додавання декстрану залишалось незмінним. Відмічені нами при впливі декстрану зміни споживання протромбіну в плазмі з еритроцитами, які не залежали від характеру змін споживання протромбіну в самій плазмі, свідчили на користь змін при цьому тромбопластинової активності еритроцитів.

За даними літератури відомо про вплив декстрану тільки на прокоагу­лянтну активність тромбоцитів (Д.М. Зубаиров, 2000). При цьому зниження активності тромбоцитарного фактора 3 спостерігалося тільки після тривалої попередньої інкубації тромбоцитів з декстраном, виявляючи більшу вираженість при збільшенні середньої молекулярної маси декстрану > 250000. Відомо, що тромбопластинова активність цільної крові під впливом декстрану збільшується, тоді як з плазмою подібний ефект не спостерігається (Г.Л. Волков с соавт., 2005). На наш погляд, це свідчило про роль еритроцитів у реалізації даного стимулюючого впливу декстрану на тромбопластиноутворення. Одержані нами дані підтвердили безсумнівне значення властивостей поверхні мембрани еритроцита для прояву активності ТФЕ і лабільність прокоагулянтної активності еритроцитів. Найбільш важливим є той факт, що підвищення тромбопластинової активності еритроцитів можуть супроводжувати такі зміни поверхні мембрани клітин, при яких спостерігається їх підвищена агрегація. Вивчення механізму включення ТФЕ у процес внутрішнього тромбопластиноутворення стало наступним етапом нашої роботи. Відомо, що під впливом ферментативної дії на білкову частину ліпопротеїду, який має певну біологічну активність, остання втрачається чи стає значно менш вираженою (Б.А. Шендеров, 2004). Тому якщо ТФЕ розташовується в мембрані поверхнево, ми передбачали ушкодження його під впливом трипсину і в результаті цього зниження тромбопластинової активності клітини, що зберігається і після її руйнування. Однак ми не виключали можливості посилення прокоагулянтної активності трипсинізованої клітини. Останнє свідчило б на користь глибокої локалізації ТФЕ і одночасно про «бар’єрну» роль сіалопротеїду зовнішнього шару мембрани, що перешкоджає взаємодії клітинного фактора з плазмовими.

Нами було поставлено завдання з’ясувати локалізацію ТФЕ в мембрані еритроцита і його вплив на тромбопластинову активність еритроцитів. У першій серії дослідів ми використовували відносно концентровану клітинну суспензію (4–4,5 млн у 1 мм³) трипсинізованих еритроцитів (0,1%-вий розчин трипсину) і таку ж кількість нормальних еритроцитів. Нами встановлено, що трипсинізовані еритроцити знижують тромбопластинову активність крові, що виявлялося у збільшенні часу рекальцифікації й уповільненні генерації тромбіну. Індекс порівняльної активності еритроцитів для даних показників, відповідно, збільшився (>1).

В другій серії дослідів при використанні суспензії еритроцитів у більшому розведенні (800–900 тис. у 1 мм³), оброблених більш концентрованим розчином ферменту (0,4%-вий розчин трипсину), одержані більш виражені зміни тромбопластинової активності еритроцитів. При цьому індекс порівняльної активності еритроцитів перевищив показник в дослідах попередньої серії. Необхідно підкреслити, що вплив гемолізату нормальних і трипсинізованих еритроцитів на генерацію тромбіну в плазмі вірогідно не розрізнявся (рис. 1). Після обробки еритроцитів 0,4%-вим розчином трипсину кількість неагрегованих клітин зменшилась в 4,2 раза, а швидкість осідання еритроцитів збільшилась в 3,8 раза. За даними літератури, відомо, що під впливом трипсину від мембрани еритроцита відщеплюється переважно глікопротеїновий комплекс – сіалопротеїд, який, за сучасними уявленнями, займає украй зовнішнє положення в мембрані еритроцита (Ф.Д. Шиффман, 2007). З відщепленням від клітинної мембрани сіалопротеїду змінюються поверхневі властивості мембрани і зокрема знижується її електронегативність, з чим, на нашу думку, пов’язані відмічені нами посилення агрегації і зниження суспензійної стабільності трипсинізованих еритроцитів. Зниження активності ТФЕ після трипсинізації обумовлено частковим випадінням впливу еритроцитарного фактора, але не пов’язано з набуттям певною частиною еритроцитів гальмувальних властивостей у відношенні власне процесу тромбопластиноутворення. Останнє можна було б пояснити збереженням на поверхні відмитих еритроцитів деякої кількості адсорбованих молекул трипсину. Проти подібного припущення свідчив, однак, той факт, що в малій концентрації трипсин активізує тромбопластиноутворення (А.А. Кушкун, 2007). Можливість набуття трипсинізованими еритроцитами гальмувальних властивостей не підтверджувалася і при аналізі впливу трипсинізованих еритроцитів на процес тромбопластиноутворення в плазмі, багатій на тромбоцити: зниження рівня тромбопластиноутворення при цьому не спостерігалося. Зниження активності ТФЕ, на нашу думку, не пов’язано з безпосереднім ушкодженням фактора протеолітичним ферментом. У випадку прямого впливу трипсину на білкову частину ліпопротеїду з прокоагулянтною активністю зниження прокоагулянтної активності клітини збереглося б і після її руйнування, як це, зокрема, спостерігалося при обробці трипсином гемолізованих еритроцитів.