ЕТІОЛОГІЯ ТА ПАТОГЕНЕЗ СТАРЕЧОЇ В’ЯЛОСТІ ШКІРИ ЛИЦЯ І МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ ЙОГО СТРУКТУРНИХ ЗМІН У СУЧАСНОЇ ЛЮДИНИ ЄВРОПЕОЇДНОГО ТИПУ

Короткий зміст

Матеріали та методи досліджень. У дерматокосметологічному відділенні спільного, ліцензованого МОЗ України, україно-угорського медичного підприємства (ліцензія АВ 300469, дерматовенерологія) обстежено 120 осіб обох статей, які зверталися з приводу профілактики вікових змін на шкірі лиця у вигляді витончення, локалізованих пігментних плям, незначної пористості шкіри лиця, поодиноких зморщок, кератом, телеангіектазій і ангіом. Відповідно до вікової періодизації [Автандилов Г. Г., 2002] пацієнти були розподілені на чотири групи, по 30 осіб у кожній. Перші 3 групи (І, ІІ, ІІІ) – практично здорові особи, які не мали ознак старечої в’ялості шкіри лиця. І група – обстежені зрілого віку (22 – 35 років; І період); ІІ група – особи зрілого віку (36 – 55 років; ІІ період); ІІІ група – люди похилого віку (61 – 74 роки) з віковими змінами шкіри лиця. До ІV групи ввійшли особи зрілого віку (36 – 55 років; ІІ період), які мали ознаки старечої в’ялості шкіри лиця.  У всіх пацієнтів шкіра була нормальної жирності.

Обстежені особи не мали змін маси тіла (надлишок маси тіла не перевищував 5% згідно з рекомендаціями ВООЗ). Особи І – ІІІ груп не відмічали в анамнезі надлишкове УФ- опромінення, дію шкідливих чинників навколишнього середовища. Пацієнти ІV групи зловживали солярієм (1 – 2 відвідування на тиждень протягом року), щорічно перебували під прямими сонячними променями у період літньої відпустки (20 – 30 діб). Слід зазначити, що закриті ділянки тіла не піддавались опроміненню.

Для виключення прихованої патології проводилося розширене обстеження, яке включало клінічне дослідження, ультразвукове обстеження органів черевної порожнини, офтальмоскопію, лабораторні методи: загальний аналіз крові, аналіз крові на цукор, визначення вмісту загального білка, активності аланін- та аспартатамінотрансферази сироватки крові, тимолову пробу, вміст холестерину, ліпопротеїдів різної щільності, білірубіну, С-реактивного білка, загальноклінічний аналіз сечі. Тривалість обстеження становила (91,5 ± 0,4) доби.

Морфологічним і біохімічним дослідженням підлягала шкіра 40 осіб обох статей, яким були проведені планові оперативні втручання з приводу усунення косметичних дефектів лиця у відділенні пластичної та реконструктивної хірургії Центральної міської клінічної лікарні Києва в 1998 – 2008 рр. Пацієнти були розподілені на чотири групи, по 10 осіб у кожній. Перші три групи – практично здорові особи, які не мали ознак старечої в’ялості шкіри лиця: І і ІІ групи – обстежені зрілого віку (22 – 35 років і 36 – 55 років відповідно); ІІІ група – люди похилого віку (61 – 74 роки) з віковими змінами шкіри лиця. До ІV групи ввійшли особи зрілого віку (36 – 55 років), які мали ознаки старечої в’ялості шкіри лиця.

Визначення швидкості відлущування рогового шару епідермісу проводили за методикою П. В. Кожевнікова і шкалою Л.І. Васильєвої [Калантаевская К. А., 1972], що дало змогу непрямим шляхом оцінити швидкість розмноження базальних кератиноцитів.

Нейтралізуючу здатність шкіри стосовно лугів вивчали колориметричним методом за Burckhat і Vermeer [Шишкина И. Г., 1980].

Вивчення тинкторіальних властивостей шкірного покриву виконано за допомогою сконструйованого нами пристрою [34], який працює за принципом аспірації з використанням прикладної кювети, що має круглий отвір із внутрішнім діаметром 20 мм, і негативному тиску 20 кПа, який подається на шкіру.

Біологічний вік визначали за методикою В.П. Войтенко та співавт., розробленою Інститутом геронтології АМН СРСР [Войтенко В. П. та співавт., 1984].

Дослідження кровоносних мікросудин БК здійснювали за допомогою щільової лампи Zeiss SL 160 (ФРН) зі збільшенням у 5,0–32,0 крат і стереоскопічного мікроскопа МССО (СРСР) зі збільшенням у 3,3–350,2 крат і оцінкою запропонованих нами критеріїв [1, 2, 13, 44].

Капіляроскопію НЛ проводили на верхніх кінцівках за запропонованою нами методикою [1, 2, 10, 36]. Біомікроскопічні дослідження проведені з використанням капіляроскопа М-70 А та стереоскопічного мікроскопа МССО (СРСР) зі збільшенням у 3,3–350,2 крат.

Капіляроскопія шкірного покриву проводилася на тильному боці дистальної фаланги безіменного пальця лівої руки та в зоні, розташованій на середені відстані між мочкою вуха і кутом рота за допомогою капіляроскопа М-70 А, стереоскопічного мікроскопа МССО (СРСР) [Зубанский Р. В., 1988].

Дослідження NO-залежного типу ендотеліальної дисфункції мікросудин НЛ (ішемічна проба) проводили  за запропонованою нами методикою [1, 2, 39].

У морфологічних дослідженнях використовували шкіру, яку брали з привушно-жувальної та пупкової зон. Шматочки шкіри отримували за допомогою біопсійних лез фірми “Miltex Instrument Co” (США). Біопсію шкіри проводили на першій стадії глибини загального знеболювання, вибір місця був зумовлений використанням стандартного операційного доступу при хірургічних втручаннях.

Отримані біоптати шкіри для досліджень на світлооптичному рівні фіксували в 10%-му розчині нейтрального формальдегіду та піддавали рутинній гістологічній обробці. Гістологічні зрізи фарбували гематоксиліном і еозином, пікрофуксином за методом ван Гізона після інкубації у розчині колагенази, а також без неї, пікро-індигокарміном, за методом Маллорі з використанням фосфорно-молібденової кислоти, за Касоном, резорцин-фуксином за Вейгертом, альдегідфуксином за Гоморі після обробки зрізів надоцтовою кислотою, а також без неї, гематоксиліном Верхгофа, толуїдиновим синім з обробкою контрольних зрізів тестикулярною гіалуронідазою, за методом Шиффа з використанням йодної кислоти після обробки амілазою слини в модифікації Мак-Мануса, за допомогою імпрегнації сріблом за методом Фута, а також за Місіме, за методом Перлса з використанням реакції берлінської лазурі за Лізоном, фарбування за Ганді і Майніні, за Коссом, за методом Макаллума, конго червоним, за Касоном, за Романовським –  Гімзою, за методом Мая-Грюнвальда.

     Матеріал для електронно-мікроскопічних досліджень (20 біоптатів шкіри, по 10 з кожної групи) подрібнювали на шматочки, товщиною до 1 мм і фіксували протягом 1,5-2 год при 3⁰С з триразовою зміною осмієвої кислоти. Після фіксації шматочки відмивали в 0,1 моль/л фосфатному буфері з pH 7,4, зневоднювали в зростаючих концентраціях етанолу, абсолютному ацетоні або в оксиді пропілену з попередньою дофіксацією та контрастуванням насиченим розчином уранілацитату і ущільнювали у суміші епону та аралдиту. Напівтонкі зрізи товщиною 1 мкм забарвлювали 1%-м розчином толуїдинового синього для світлооптичного вивчення і орієнтації вибраної ділянки для наступного електронно-мікроскопічного дослідження. Ультратонкі зрізи готували на ультратомі “LKB” і вивчали на елетронному мікроскопі Philips 400 T (Голландія) при прискорюючій напрузі 80 кВ.

Виходячи з того, що Са²⁺-АТФаза відіграє важливу роль у клітинному метаболізмі, нами були проведені дослідження активності цього ферменту з використанням методів електронної гістохімії [Mayahara H. et al., 1980].

Для електронно-гістохімічного визначення Mg²⁺-АТФазної активності з солями свинцю застосовували методику Гоморі у модифікації Бухвалова [Саркисов Д. С. та співавт., 1996].

Фізико-механічні випробування шкіри проводили відповідно до ГОСТу 338–45.

Для визначення відсотка вологи у тканині зразки шкіри зважували на аналітичних вагах і висушували до постійної маси при 80⁰С у сушильній шафі СНОЛ 3,5.3.5.3.5/И1 (Росія).

Для визначення вмісту колагену використовували метод К’єльдаля.

При дослідженні функціональних властивостей шкіри визначали вихід з колагену желатини (показник глибини деструктивних змін) гідротермічним зварюванням шкіри при 100⁰С [Охмат О. А. та співавт., 2006].

Дослідження архітектоніки колагенових волокон шкіри виконували на нативних препаратах. За допомогою кріомікротома ТОС–2 (СРСР) вирізали шматочки шкіри товщиною 150–200 мкм, поміщали їх на предметні скельця, проводили морфометричні дослідження за допомогою окуляр-мікрометра мікроскопа МССО (СРСР) при 400-кратному збільшенні. Кут нахилу колагенових пучків (градуси) відносно поверхні шкіри розраховували як середнє значення у препараті.

Температуру зварювання шкіри визначали з використанням приладу ПТЗ-1 (СРСР).

Екстракцію колагену І типу зі шкіри людини виконували за методом, запропонованим Strom [Саркисов Д. С. та співавт., 1996].

Зв’язування кислот і лугів колагеновою біоматрицею (водний розчин колагену, масова частка 14%) визначали обробкою її різними об’ємами 0,1 N розчину HCl та NaОН з наступним вимірюванням рН потенціометричним методом за допомогою приладу рН-150М (Росія).

Вивчення скоротливих властивостей колагенових волокон під дією 0,13 N HCl проводили за модифікованою нами методикою [35].

У зразках шкіри визначали вміст кобальту, нікелю, міді, заліза, магнію, цинку, кальцію з використанням атомно-адсорбційного спектрометра SP 9 Pye Ynicam (Англія) [Бабко А. К. та співавт., 1974].

Визначення стану вільнорадикального окиснення шкірного покриву проводилося безпосередньо в тканинах шкіри спектрофотометричним методом [Барабой В. А. та співавт., 1991, Волчегорский  И. А. та співавт., 1989]. У зразках шкіри визначали вміст первинних (ДК) і вторинних (МДА) продуктів ПОЛ. Вміст білка в пробах визначали за методом Лоурі.

          Експериментальні дослідження проведені на 170 білих щурах лінії Вістар, яких утримували у стандартних умовах віварію.

Досліди з вивчення біохімічних механізмів реалізації окисного стресу  у шкірі тварин, що зазнали дії різних доз УФ-опромінення спектра В проведені на 50 білих щурах-самцях лінії Вістар віком 3 – 5 міс, масою 250 – 300 г, які були розподілені на 5 груп по 10 в кожній: I – контрольна; II група – тварини, які зазнали лише іммобілізаційного стресу; IIІ група – тварини, які отримували УФ-опромінення спектра В (λ = 297 нм) у суберитемних дозах (200 кДж^.м^-2); IV група –тварини, які отримали  гіпереритемну дозу УФ-спектра В (1000 кДж^.м^-2); V група – тварини, які отримували гіпереритемну дозу УФ-спектра В (1000 кДж^.м^-2) на фоні кастрації, що була проведена за 1 міс до початку експерименту. Кількість опромінень – 10, інтервал – 1 доба. Щури ІІ – V груп зазнавали іммобілізаційного стресу, що пов’язано з умовами проведення експерименту. Опроміненню підлягала шкіра живота, яку голили за  добу до початку експерименту; площа зони впливу в усіх групах була 2 см². Інтенсивність УФ-опромінення певної ділянки спектра визначали за допомогою ультрафіолетметрів УФМ-5, УФМ-65 (СРСР).

Для генерації УФ-опромінення використовували устаткування ОКУФ 5 м (СРСР), в якому джерелом світла була УФ-лампа ДРТ-1000 потужністю 1000 Вт (діапазон опромінення 240 – 380 нм). Опромінення направляли на шкіру живота щурів через інтерференційний фільтр і розсіювальний мікрооб’єктив.   

Продукти ПОЛ у гептан-ізопропанольних екстрактах шкіри тварин визначали  із   використанням   спектрофотометра   СФ-46   (СРСР)   за   методом Волчегорського та співавт. [Волчегорский  И. А. та співавт., 1989]. Вміст ДК (дієнових кон’югатів) розраховували за співвідношенням Е₂₃₂/Е₂₂₀ у гептановій та ізопропанольній фазах.

Визначення ТБК (2-тіобарбітурова кислота) - активних продуктів у тканинах проводили за методом, описаним Барабоєм  [Барабой В. А. та співавт., 1997].

Відновлений глутатіон, а також глутатіонредуктазну активність постмітохондріальної фракції шкіри щурів щурів визначали за методом Путиліної [Путилина Ф. Е., 1982].

Глутатіонпероксидазну (ГПО) активність постмітохондріальних фракцій шкіри щурів вивчали за методом Кругликової [Кругликова Г. О. та співавт., 1997].

Визначення жирнокислотного складу ліпідів шкіри щурів проводили методом газорідинної хроматографії. Ліпіди з тканин екстрагували за методом Folch у модифікації Синяка [Синяк К. М. та співавт., 1976]. Газохроматографічний аналіз проводили на газовому хроматографі “Agilent 6890” (США) з полум’яно-іонізаційним детектором за методом Гички та співавт [Гичка С. Г. та співавт., 1998].

Визначення вмісту та ступеня відновленості піридинових нуклеотидів проводили  за  методом  Слейтера [Slater T. F. et al., 1964] із використанням спектрофотометра “Specord-M40” (Німеччина).

Швидкість ферментативного розщеплення НАД⁺ (нікотинамідаденіндинуклеотид окиснений) визначали ензиматичним методом [Телепнева В. И. та співавт., 1965].

Активність АЛТ і АСТ у плазмі крові визначали за допомогою стандартних наборів реактивів фірми “Global Biomarketing Group” (США) із використанням спектрофотометра “ Specord-M40” (Німеччина).

Вміст білка в пробах досліджували за методом Лоурі або за допомогою біуретової реакції  із використанням спектрофотометра СФ-46 (СРСР).

Досліди з вивчення про- та антиоксидантної рівноваги при дії УФ-опромінення за умов гемічної гіпоксії проведені на 60 білих щурах-самцях лінії Вістар віком 3–5 міс, масою 250–300 г, яким перед введенням NaNO₂ (80 мг^.кг^-1) проводили УФ-опромінення шкіри живота.  Тварини були розподілені на 4 групи по 10 у кожній: I – контроль; II група – тварини, які зазнали лише іммобілізаційного стресу; ІIІ – тварини з гемічною гіпоксією; IV – тварини, які отримували УФ-опромінення спектра В (λ = 297 нм) у суберитемних дозах (200 кДж^.м^-2) протягом тижня; V – тварини, які отримували гіпереритемну дозу УФ-спектра В (1000 кДж^.м^-2) протягом тижня; VІ – тварини, які отримували гіпереритемну дозу УФ-спектра В (1000 кДж^.м^-2) на фоні кастрації. Кількість опромінень була 10, інтервал – 1 доба. Через 60 хв після введення NaNO₂ тварин декапітували, в тканинах шкіри визначали вміст ТБК-активних продуктів, а в постмітохондріальних фракціях цих самих тканин –  активність ГР (глутатіонредуктази) та ГПО.

Вплив суберитемних та еритемних доз УФ-опромінення спектра В на ПОЛ у шкірі щурів при максимальному фізичному навантаженні досліджували при плаванні тварин з додатковим вантажем (10% від маси тіла) в басейні з температурою води 25⁰С. Досліди було проведено на 40 щурах-самцях, які були поділені на 3 групи по 10 у кожній : I – щури, які зазнали впливу максимального фізичного навантаження; II – тварини, які перед максимальним фізичним навантаженням отримували УФ-опромінення у суберитемних дозах (200 кДж^.м^-2) протягом тижня; IІІ – тварини, які перед проведеням  максимального фізичного навантаження отримали еритемну дозу УФ (400 кДж^.м^-2) протягом тижня. Контролем були тварини, яких не піддавали максимальному фізичному навантаженню. Досліди проводили через добу після останнього сеансу опромінення. Реєстрували тривалість плавання щурів. Тварин декапітували через 60 хв після фізичного навантаження.

Виходячи з того, що з одного боку УФ-опромінення у суберитемних та еритемних дозах має певну АО (антиоксидантну) дію, а з іншого – в реальних умовах життя на шкіру виявляє свій несприятливий вплив також і сонячна радіація у надмірній кількості, ми провели дослідження динаміки процесів ПОЛ у шкірі щурів в умовах максимального фізичного навантаження та УФ-опромінення спектра В у гіпереритемних дозах для вивчення альтеративних змін при такому комбінованому впливі. Дослідження проведено на 3 групах щурів по 10 у кожній: I – контроль; II – щури, які зазнали впливу максимального фізичного навантаження у вигляді бігу у вільному третбані зі швидкістю 16 м/хв; III – щури, які отримували гіпереритемну дозу УФ-спектра В (1000 кДж^.м^-2) протягом тижня і зазнали впливу максимального фізичного навантаження у вигляді бігу в третбані зі швидкістю 16 м/хв через 1 год після останнього сеансу опромінення. Тварин декапітували і досліджували ті самі показники в ті самі строки, що і в попередньому досліді.

Продукти ПОЛ у гептан- ізопропанольних екстрактах шкіри тварин визначали  із   використанням   спектрофотометра   СФ-46   (СРСР)   за   методом Волчегорського та співавт. [Волчегорский И. А. та співавт., 1989]. Вміст ДК розраховували за співвідношенням Е₂₃₂/Е₂₂₀ у гептановій та ізопропанольній фазах.

Визначення ТБК-активних продуктів у тканинах проводили за методом Барабоя та співавт. [Барабой В. А. та співавт., 1997].

Вміст відновленого глутатіону в тканинах щурів визначали за методом Путиліної  [Путилина Ф. Е., 1982].

Глутатіонпероксидазну активність постмітохондріальних фракцій шкіри щурів визначали за методом Кругликової [Кругликова Г. О. та співавт., 1976].

Визначення ролі УФ-опромінення у розвитку морфологічних змін шкіри проведено в експерименті на 20 білих щурах лінії Вістар обох статей віком 3 – 5 міс, масою 250 – 300 г, які були розподілені на 2 групи по 10 в кожній: I – контрольна, ІІ група – тварини, які отримали гіпереритемну дозу ультрафіолету спектра В (1000 кДж·м^-2). Опроміненню підлягала шкіра живота, площа зони впливу була 2 см².

     Отримані біоптати шкіри для досліджень на світлооптичному рівні фіксували в 10%-му розчині нейтрального формальдегіду і піддавали рутинній гістологічній обробці. Гістологічні зрізи фарбували гематоксиліном і еозином, толуідиновим синім, альдегідфуксином за Гоморі, а також фарбами за ван Гізон та за Маллорі.

Електронно-мікроскопічному дослідженню підлягало 20 біоптатів шкіри (по 10 з кожної групи), які піддавались обробці для оглядового вивчення і визначення активності Са²⁺-АТФази за методиками, описаними вище.

Дослідження молекулярних механізмів розвитку фотополімеризаційних процесів у колагені шкіри під дією структурувальних агентів та лазерного опромінення проводилося з застосуванням устаткування, в якому джерелом був гелій-неоновий лазер з λ = 633 нм і потужністю 10^-3Вт. Спектральний склад вихідного опромінення звужувався інтерференційним фільтром. Опромінення проходило через мікрооб’єктив і діафрагму, яка розташована у фокусі мікрооб’єктива. Потужність вихідного лазера контролювали вимірювачем потужності та енергії лазерного опромінення (ИМО-2 (н)). Пучок обмежувався діафрагмою і коректувався лінзою, після чого направлявся перпендикулярно до основи з колагеновим середовищем.

Дослідження фотобіохімічного структурування у рідкій фазі було проведене за допомогою устаткування рідкофазного синтезу. Опромінення гелій-неонового лазера направляли через інтерференційний фільтр і мікрооб’єктив, а розсіяне опромінення – на реактор із кварцового скла, що мав водяну сорочку, в який вводили колагенову композицію. Композиція постійно перемішувалася пропелерним змішувачем. Через боковий тубус вводили композицію та здійснювали відбір проб. Водяна сорочка з’єднана з термостатом у якому підтримувалася температура 40,0⁰С.

Для проведення спектроскопічних досліджень готували зразки декількох типів: використовували шари колагену, нанесені на скляні основи; для більш детальних досліджень готували тонкі колагенові плівки без основ методом їх формування між двома гідрофобізованими скляними пластинками, попередньо обробленими трихлорметилсиланом [Корешков А. П. , 1956]; для ІЧ-спектроскопії готували також зразки пресуванням плівок у таблетки з КВr і CsI [Смит А., 1982].

У діапазоні 400–4000 см^-1 ІЧ-спектри знімали на спектрофотометрах Nexus 470 фірми “Nicolet” (США) та Pye-Unicam SP3-300 (США) в діапазоні 200–600 см^-1.

Електронні спектри знімалися на спектрофотометрі ”Specord M-40” та Pye-Unicam PU 8800 (США) у діапазоні 200-830 нм (UV/VIS) відносно еталона MgO.

Дослідження сорбції активних мономерів колагеном визначали для двох типів речовин: неіоногенного (акриламід) та іоногенного (акрилат кальцію).

Кількісне визначення сорбованості мономера колагеновою матрицею проводилося за  методом Кноппа [Герасимов Я. И., 1970], який був модифікований для нашого експерименту.

Для дослідження структурних перетворень колагенових  біокомпозицій, опромінених лазерним променем протягом 2 год в устаткуванні рідкофазного синтезу, формували у вигляді пластин і висушували у ексикаторі над Mg(ClO₄)₂  до постійної маси. Приготовлені зразки (однакової маси і форми) занурювали на платиновому дроті у воду, що знаходилася у кюветі термостату. Через 5 хв визначали масу набухлих зразків на торсійних терезах марки “ВТ-500” з точністю ± 0,5 мг.

Молекулярну масу ділянок макроланцюгів між зшивками у температурному інтервалі 293–313 К визначали з результатів набухання за рівнянням Флорі-Ренера [Brown H. R., 1978].

Густину зразків досліджували методом гідростатичного зважування [Клайн Г., 1966].

Для вивчення безпосередньої дії перекисних радикалів на молекулярну структуру колагенового волокна використовували устаткування, в якому джерелом опромінення був гелій-кадмієвий лазер з довжиною хвилі 325 і 441,6 нм і потужністю 0,1 Вт. В устаткування для проведення фотополімеризації у рідкій фазі вносили готову колагенову систему. Основою у ній був водний розчин колагену І типу зі шкіри людини (масова частка 14%) і 35%-й розчин перекису водню (10% від загального об’єму композиції). Використання перекису водню пов’язане з тим, що продукти перекисного окиснення миттєво піддаються деструкції, що не дає змоги їх використовувати у експериментах. Утворений розчин інкубували протягом доби, а потім піддавали опроміненню. З моменту початку експерименту кожні 120 хв відбирали проби, формували з них тонкі плівки і знімали ІЧ-спектри.

Для визначення ролі NH- і OH- груп були проведені дослідження, в яких замість колагену використовували розчин оксипроліну. Композицію готували на основі 14%-го водного розчину оксипроліну (масова частка 14%) з додаванням 35% розчину перекису водню (становив 10% загального об’єму композиції). Дослідження проводили за допомогою структурування у рідкій фазі. ІЧ-спектри в діапазоні 400–4000 см^-1 знімали на спектрофотометрі Nexus 470 фірми “ Nicolet ” (США).

Набухання колагену вивчали на нативних і опромінених плівках. Для генерації УФ- опромінення використовували устаткування, в якому джерелом був гелій-кадмієвий лазер з довжиною хвилі 325 нм і потужністю 0,1 Вт. Опромінення проводили у устаткуванні рідкофазного синтезу при 40,0⁰С. Водний розчин колагену зі шкіри людини (масова частка 14%), введений у реактор, постійно перемішували пропелерним змішувачем. З початку експерименту кожні 30 хв відбирали проби, формували з них тонкі плівки та знімали ІЧ-спектри на спектрофотометрі Nexus 470 фірми “Nicolet” (США). Опромінення проводили протягом 1 год, коли виявлялися спектроскопічні зміни у пробах. Отримання матеріалу зводилося до приготування колагенових шарів і нанесення їх на скляні основи. Для цього наважку колагену (14,0 г) поміщали у хімічну склянку та додавали 95 мл води. Суміш набухала протягом 24 год. Після цього отримували плівки на скляних основах “методом витягування”, як описано вище. Плівки витримували в боксі протягом доби до висушування, після чого піддавали термічному твердінню в сушильній шафі впродовж 15–20 хв при 60⁰С. Опромінені та неопромінені зразки колагену зволожували дистильованою водою. Відокремлення міцелярної вологи колагену від капілярної проводили за допомогою центрифуги ЦУМ-1 (СРСР) протягом 10 хв (темперетатура середовища 36,6⁰С) при 8000 хв^-1. Капілярно утримана волога при цьому практично повністю видалялась, а міцелярно пов’язана – утримувалася.

     Результати кількісних досліджень оброблялися методами варіаційної статистики з оцінкою достовірності різниць величин, показників кореляційного аналізу. Достовірність відмінностей визначали при порівнянні середніх арифметичних показників за критерієм t Стьюдента, а при порівнянні частоти ознаки у відсотках – методом альтернативного варіювання.

Результати досліджень. Аналіз 1624 амбулаторних карт осіб, які відвідують дермато-косметологічні установи, показав що у 135 (8,3 %) з них виявлялася стареча в’ялість шкіри лиця у вигляді зморщок, зниження еластичних властивостей шкіри, телеангіектазій, ангіом, посиленої пігментації, сенільних кератом. Результати проведеного нами клініко-лабораторного дослідження функціонального стану шкіри лиця у осіб зі старечою її в’ялістю свідчать про виражені зміни показників, зокрема зменшення швидкості відлущування рогового шару епідермісу, підвищення показника еластичності (миттєвої деформації), збільшення часу нейтралізації лугів у несуміжних анатомічних зонах. Зміни функціональних властивостей пов’язані, на нашу думку, з потенціювальною дією зовнішніх чинників навколишнього середовища. Отримані результати наближаються до таких, які отримано у осіб похилого віку (ІІІ група). Біологічний вік у осіб дослідних груп наближався до календарного. Таким чином, стареча в’ялість шкіри лиця не пов’язана з передчасним старінням організму.

Встановлено, що у осіб ІІ – ІV груп зміни стану судин БК виявлялась у вигляді патологічних форм звивистості та спазму артеріол, нерівномірності їх калібру, петель, мікроаневризм, патологічних форм звивистості капілярів, збільшення кількості функціонуючих артеріоло-венулярних анастомозів, порушення паралелізму мікросудин, петель і кутів капілярів, наявності аваскулярних полів, нерівномірності калібру капілярів, судинного новоутворення, зменшення кількості функціонуючих капілярів, звивистості венул, нерівномірності їх калібру, сакуляцій, петель венул, пігментації та зниження прозорості капіляроскопічного фону, екстравазатів, відкладень  гемосидерину. Можна стверджувати про наявність мікроциркуляторних порушень у артеріальному та венозному відділах ГМЦР у осіб старших вікових груп, які збільшуються у людей похилого віку. Гемомікроциркуляторні розлади, що супроводжують старечу в’ялість шкіри лиця, підсилюють її клінічні симптоми та сприяють погіршенню морфофункціонального стану. Отримані результати вимагали дослідження ГМЦР безпосередньо в шкірі.

Аналіз результатів капіляроскопії НЛ у практично здорових людей різного віку та осіб з ознаками старечої в’ялості шкіри лиця виявив зміни морфології ГМЦР у вигляді порушення паралелізму розташування петель, зменшення кількості функціонуючих мікросудин, аваскулярних полів, зменшення довжини артеріального та збільшення довжини венулярного колін петель, нерівномірності калібру артеріального та венулярного колін, зменшення діаметра артеріальної та збільшення діаметра перехідної і венулярної ділянок, мікроаневризм артеріального і перехідного та сакуляцій венулярного коліна,  ампутації ділянок та перехрещення судинних петель. Позасудинні зміни виявлялися каламутним капіляроскопічним фоном, змазаністю контурів мікросудин, периваскулярним набряком, поодинокими екстравазатами, вогнищевою пігментацією капіляроскопічного фону. Інтрасудинна патологія була представлена стазами мікросудин, пристінковими агрегатами у практично здорових людей різного віку та осіб з ознаками старечої в’ялості шкіри лиця, змінами напрямку та швидкості кровотоку, його порушеннями у вигляді дрібнозернистого, густого,  порційного з рідкими і частими порціями крові, рухом крові з зупинками. Виявлені зміни превалювали у осіб ІІІ групи, що свідчить про зміни морфофункціонального стану ГМЦР у осіб похилого віку.

Оскільки не тільки проникність судин, але й їх готовність до відповіді на екзо- та ендогенні чинники є важливою ознакою у розвитку патологічних станів органів і систем, нами була запропонована нова методика з вивчення реактивності ГМЦР нігтьового ложа за результатами ішемічної проби, яка дає змогу виявити дисфункцію ендотелію у відповідь на вплив ендогенного вазодилататора, тобто діагностувати NO- залежний тип такої дисфункції. Ішемічна проба дозволила виявити NO- залежний тип дисфункії ендотелію у осіб ІІ – ІV груп. Показник ендотеліальної дисфункції був найбільшим у осіб ІІІ групи, що свідчить про порушення обмінних процесів у ендотеліоцитах мікросудин.

Вікові зміни шкіри лиця характеризувалися значними змінами гістоархітектоніки, що виявлялися порушенням процесів кератинізації (епідермоцитарна дисфункція), нерівномірним потовщенням базальної мембрани епідермісу, ознаками фіброзу дерми з невідповідністю напрямку колагенових волокон відносно повздовжньої осі фібробластів (фібробластична дисфункція), дегенерацією еластичних волокон, склеротичними змінами судин ГМЦР, зменшенням кількості нервових волокон та їх закінчень, дистрофічними змінами ендотеліоцитів, вогнищевою плазморагією. Вивчення ультраструктури шкіри лиця у осіб похилого віку виявило наступні особливості її будови. Спостерігалося витончення епідермісу, порушення процесів кератинізації. Зміна органел епідермоцитів проявлялася деградацією мітохондріального та гомогенізацією тонофібрилярного апаратів. Візуалізовані морфологічні ознаки апоптозу базальних епідермоцитів. Виявлено індивідуальні особливості змін базальної мембрани кровоносних капілярів залежно від групи обстежених. Найбільші структурні зміни спостерігалися в капілярах сосочкового шару дерми. Індивідуальні особливості змін мікросудин забезпечують особливості проявів старіння шкіри лиця. Зміни сполучнотканинної основи шкіри у всіх групах були ідентичними та характеризувалися ознаками фіброзу. В дермі виявлено збільшення кількості мікрофібрил колагенових волокон, зміни фібрилярної та енергетичних структур фібробластів. Отже, встановлені зміни можна вважати певними і характерними ознаками старіння шкіри лиця.

Базальні епідермоцити, ендотеліоцити мікросудин, перицити, м’язи шкіри виявляють активність Са²⁺-АТФази та Мg²⁺-АТФази на плазматичних мембранах, яка зменшується з віком. Стареча в’ялість шкіри лиця характеризується порушенням енергетичних процесів, що виявляється зменшенням активності цих ферментів на мембранних структурах епідермісу та дерми.

Актинічні ураження виявлялися гіперкератозом, акантозом і дискератозом. У базальному шарі спостерігалося компенсаторне збільшення кількості мітозів, у шиповатому – міжклітинний набряк, вакуольна дегенерація, каріопікноз і каріолізис. Мікросудини шкіри розширювалися, виявлялося витончення їх стінки, що пояснює виникнення великої кількості телеангіоектазій. Спостерігались ознаки фіброзу базальної мембрани капілярів, тромботичні ураження. Дослідження морфологічної картини хронічного актинічного ураження дозволило виділити три основні форми реакції: нормо-, гіпер- і атрофічну. Гіпертрофічна форма виявляється потовщенням усіх шарів епідермісу та посиленням процесів ороговіння клітинних елементів. Атрофічна форма супроводжується витонченням усіх шарів епідермісу. При нормотрофічній формі виявлялися зміни осьової орієнтації ядер базальних епідермоцитів, порушення мітотичної активності гермінативного шару, збільшення кількості апоптозів у базальному шарі епідермісу при збереженні загальної структури епідермісу.

Методи кількісного біохімічного аналізу дозволили виявити досить значні топографічні відмінності за вмістом колагену у осіб похилого віку (метод К’єльдаля). Вміст колагену у привушній ділянці у осіб обох статей віком від 22  до 74 років коливається у межах від 37,63±4,05 до 42,22%±4,16% і не має статистично достовірних відмінностей за віком і статтю. У пупковій зоні осіб віком від 22 до 55 років його вміст коливається в межах від 37,02±4,7 до 37,96%±2,08%. Пупкова зона характеризується збільшеним вмістом колагену (50,68%±5,3%) відносно показників у осіб молодого і середнього віку. Стареча в’ялість шкіри лиця характеризується зменшеним вмістом колагену (21,16%±2,17%), що відрізняє її від вікової інволюції. Вміст вологи у шкірі лиця залежить від віку: у осіб віком від 22 до 35 років він становить 64,8%±1,46%, віком 36–55 років 49,3%±6,64%, віком 61–74 років 35,1%±4,35%. Стареча в’ялість шкіри лиця характеризується зменшеним вмістом вологи (39,0±5,38%), що наближує її до показників, отриманих у осіб похилого віку. Вихід желатини зі шкіри при гідротермічному зварюванні залежить від віку, що свідчить про існування відмінностей у фізико-хімічних властивостях шкіри осіб різних вікових груп. Найбільш стійкою до температурних впливів виявився колаген шкіри людей з ознаками старечої в’ялості шкіри лиця, що характеризується низьким вмістом колагену і наявністю фотохімічних зшивок в його молекулі. Температура зварювання може стати критерієм вікових змін дерми. У молодих осіб цей показник становить 60,6±1,1 і 61,6⁰С±1,3⁰С (привушна і пупкова зони відповідно), у осіб середнього віку – 61,9±2,1 і 60,2⁰С±2,0⁰С (привушна і пупкова зони відповідно), у людей похилого віку – 69,2±1,6 і 70,0⁰С±2,0⁰С. При старечій в’ялості шкіри температура зварювання збільшується (68,7⁰С±2,0⁰С), що пов’язане з фотополімеризаційними процесами у колагені, зокрема утворенням фотозшивок. При набуханні нативного колагену відбувається поглинання рідини (3,04 г води на 1,0 г сухого колагену) у вигляді міцелярного (35,5%, безпосередньо колагеновими фібрилами) і капілярного (66,5%, міжфибрилярними просторами) зв’язування. Ультрафіолетове опромінення колагенових біоматриць призводить до зменшення набухання на 28,7% (2,17 г на 1,0 г сухої речовини), при цьому міцелярне набухання зменшується (21,3%), а капілярне набуває першочергового значення (78,7%).

Гістологічна будова дерми несуміжних анатомічних зон неоднорідна і залежить від функціональних особливостей топографічної ділянки. Різниці будови зумовлюють відмінності у функціональних властивостях окремих зон. Стареча в’ялість шкіри лиця характеризується зменшенням товщини сосочкового (266 мкм ± 21 мкм) і сітчастого (957 мкм ± 38 мкм) шарів дерми та кута нахилу колагенових пучків (46⁰±2⁰). Гістологічні дослідження сполучної тканини шкіри показали, що будова колагенових волокон, особливості їх архітектоніки, зв’язки між ними значно складніші на лиці, порівняно з іншими ділянками тіла людини. Будова пучків колагенових волокон шкіри привушної зони характеризується ромбо- і петлеподібними фігурами зі щільною укладкою пучків. У сітчастому шарі дерми лиця колагенові волокна мають відмінності у орієнтації: встановлено пласто-, ромбо-, вузлоподібний, складнопетлистий і змішаний тип їх переплетення. У осіб похилого віку виявлявся в основному  пластоподібний тип розташування колагенових пучків, при цьому вони рихлі та набряклі. Формування архітектоніки сполучної тканини є багатостадійним процесом. Складність гістологічної будови пов’язана з умовами життя, зокрема дією міміко-артикуляційних укладів. У дермі пупкової зони виявляється простіша структура: зв’язок між волокнами войлокоподібний, чітких геометричних фігур не виявлено. Межа міцності при розтягненні, відносні видовження (при напруженні, розриві, залишкове, пружне), модуль пружності та жорсткість шкіри ідентичні на симетричних ділянках тіла і не мають відмінностей у осіб різної статі. Фізико-механічні властивості шкіри залежать від особливостей переплетення пучків у різних топографічних зонах. Міцність при розтягуванні шкіри прямо пропорційно залежить від товщини дерми і кількості волокон, орієнтованих у напрямку навантаження. Зменшення межі міцності при розтягуванні у осіб з ознаками старечої в’ялості шкіри лиця вказує на деструктивні зміни у колагенових волокнах і їх пучках. Неоднорідність волокнистої структури у різних анатомічних зонах призводить до змін фізико-механічних характеристик дерми, особливо межі міцності. На останній при розриві і видовження при розтягненні суттєво впливає здатність структурних елементів до орієнтації, яка залежать від способу переплетення пучків колагенових волокон. Залежно від переплетення колагенових волокон у сітчастого шару дерми розрізняють три основних типи їх будови. Щільний зв’язок, що характеризується великою кількістю перехрещених пучків, що тісно прилягають один до одного і утворюють ромбоподібні петлі. Зв’язок середньої щільності, що характеризується вертикальними і горизонтальними пучками волокон, між якими виявляються незначні проміжки. Нещільний зв’язок характеризується горизонтальними сплетеннями пучків колагенових волокон і значними проміжками між ними. Поряд з цим розрізняють ще проміжні типи. Концентрація колагену, щільність упакування колагенових волокон прямо пропорційні механічному напруженню, якого набувають певні анатомічні зони лиця. Вікові зміни складу і структури колагенових волокон призводять до порушення фізико-хімічних властивостей сполучної тканини, що зумовлює морфологічні ознаки старіння лиця. Проведені дослідження також дозволили зробити висновок, що еластичні волокна відповідальні за перерозподілення векторів механічних сил.

Розроблена нами комплексна система кількісної оцінки стану колагенового волокна шкіри за результатами визначення його скоротливих властивостей під дією 0,13 N HCl на основі зміни лінійних розмірів у практично здорових осіб і людей з ознаками старечої в’ялості шкіри лиця, що дає змогу об’єктивізувати оцінку фізико-хімічних властивостей сполучної тканини у динаміці з науковою і практичною метою.

У практично здорових осіб віком від 22 до 35 років відсоток скорочення колагенових волокон шкіри становить у середньому 33,94%±1,69% у привушно-жувальній ділянці і 32,42%±1,39% у  пупковій; у осіб віком від 36 до 55 років – 34,18%±1,25% у привушно-жувальній ділянці та 31,53%±1,24% у  пупковій; у осіб віком від 61 до 74 років – 37,37%±1,43% у привушно-жувальній ділянці і 35,41%±1,48% у  пупковій; у осіб з ознаками старечої в’ялості шкіри лиця віком від 36 до 55 років – 38,95%±0,92% у привушно-жувальній ділянці. Відсоток скорочення колагенових волокон залежить від віку, а не від статі. Реакція колагену на соляну кислоту виражається у істотному ущільненні зразка. Причина ущільнення – розрив поперечних зв’язків, що призводить до зменшення лінійних розмірів (контракції) структурних елементів волокна.

Фізико-хімічні показники колагену змінюються з віком. Метод кислотного набухання дає змогу об’єктивно визначити вікові зміни у фізико-хімічному стані колагенового волокна шкіри, а також виявити ступінь його ураження. Кислотне набухання колагену дає можливість об’єктивізувати функціональні зміни, що є особливо важливим у дослідженні патогенезу старечої в’ялості шкіри.

Досліджено вміст кобальту (привушно-жувальна ділянка – 0,15 мкг/г ± 0,02 мкг/г, пупкова – 0,16 мкг/г ± 0,03 мкг/г), нікелю (привушно-жувальна ділянка – 0,54 мкг/г ± 0,07 мкг/г, пупкова – 0,49 мкг/г ± 0,06 мкг/г), міді (привушно-жувальна ділянка – 2,35 мкг/г ± 0,29 мкг/г, пупкова – 2,56 мкг/г ± 0,16 мкг/г), заліза (привушно-жувальна ділянка – 32,02 мкг/г ± 3,09 мкг/г, пупкова – 28,14 мкг/г ± 2,19 мкг/г), цинку (привушно-жувальна ділянка – 38,87 мкг/г ± 2,78 мкг/г, пупкова – 37,04 мкг/г ± 1,89 мкг/г), магнію (привушно-жувальна ділянка – 0,18 мг/г ± 0,03 мг/г, пупкова – 0,21 мг/г ± 0,04 мг/г), кальцію (привушно-жувальна ділянка – 0,31 мг/г ± 0,02 мг/г, пупкова – 0,29 мг/г ± 0,03 мг/г) у шкірі практично здорових людей віком 22 – 35 років.  Вміст кобальту (привушно-жувальна ділянка – 0,27 мкг/г ± 0,03 мкг/г, пупкова – 0,25 мкг/г ± 0,04 мкг/г), міді (привушно-жувальна ділянка – 3,14 мкг/г ± 0,28 мкг/г, пупкова – 3,07 мкг/г ± 0,21 мкг/г), заліза (привушно-жувальна ділянка – 35,47 мкг/г ± 1,6 мкг/г, пупкова – 34,04 мкг/г ± 1,56 мкг/г), кальцію (привушно-жувальна ділянка – 0,38 мг/г ± 0,03 мг/г, пупкова – 0,37 мг/г ± 0,02 мг/г) у шкірі практично здорових людей похилого віку збільшується у несуміжних анатомічних ділянках, а цинку (привушно-жувальна ділянка – 29,72 мкг/г ± 2,51 мкг/г, пупкова – 28,23 мкг/г ± 1,21 мкг/г) – зменшується. Стареча в’ялість шкіри лиця характеризується збільшенням вмісту кобальту (0,24 мкг/г ± 0,03 мкг/г), нікелю (0,66 мкг/г ± 0,05 мкг/г), міді (3,48 мкг/г ± 0,22 мкг/г), заліза (34,51 мкг/г ± 1,49 мкг/г), кальцію (0,39 мг/г ± 0,03 мг/г) і зменшенням – магнію (0,14 мг/г ± 0,2 мг/г). Кількість магнію у шкірі практично здорових людей не має статистичних відмінностей у віці від 22 до 74 років.

При віковій інволюції шкіри значно збільшується вміст первинних і вторинних продуктів ПОЛ у несуміжних анатомічних ділянках. Оксирадикальне ушкодження покриву тіла людини при розвитку старечої в’ялості шкіри лиця має локальний характер і залежить від площі зон надмірного УФ-опромінення. Виникнення морфофункціональних змін можна пояснити руйнівними властивостями продуктів ПОЛ. Особливості клінічних проявів старечої в’ялості шкіри лиця залежать від ступеня порушення про- та антиоксидантного гомеостазу.

У разі опромінення шкіри щурів УФ-променями спектра В у гіпереритемних дозах (1000 кДж·м^-2) поряд з дистрофічними процесами у глибині тканини розвивалась ексудативна реакція, що супроводжувалася набряком, гомогенізацією сполучнотканинних волокон, змінами кількості кровоносних капілярів, крововиливами, периваскулярною, перифолікулярною, дифузною інфільтрацією лейкоцитами, а також активацією тканинних базофілів. Променеві реакції характеризувалися нетривалими зворотними запальними і дистрофічними явищами епідермісу і дерми. Ураження проявлялись її стійкими змінами за рахунок деструктивних чи глибоких дистрофічних процесів не тільки епідермісу і дерми, а і гіподерми. Фотореакції характеризувалися нетривалими зворотними запальними і дистрофічними явищами епідермісу і дерми. При надлишковому УФ-опроміненні виявлявся архітектурний дисбаланс колагенових волокон, що є ознакою фібробластичної дисфункції, яка проявляється хаотичним розташуванням колагенових фібрил відносно поверхні фібробласта. УФ-опромінення спектра В у гіпереритемних дозах призводило до зменшення активності Са²⁺-АТФази на мембранних структурах клітин епідермісу і дерми, а також мікросудин. Виникненню старечої в’ялості шкіри лиця сприяють фототравми. Фотоальтерація виявляється дегенеративними процесами у клітинах епідермісу та дерми, ураженням сполучної тканини, склеротичними змінами мікросудин, збільшенням вмісту кальцію у тканинах дерми.

У патогенезі фотоураження шкіри значне місце займає порушення процесів фізіологічної регенерації. В умовах наших експериментів через 24 год після опромінення не виявлялися мітози. Припинення мітотичної активності є результатом глибоких порушень процесів обміну речовин у клітинах, які викликає опромінення оптичного діапазону. Вирішальне значення у механізмах фотоураження мають зміни внутрішньоклітинного розподілення ферментів внаслідок дезорганізації молекул мембран і альтерації органел цитоплазми. Виходячи з усього вищезазначеного, зміни в епідермісі та дермі зони фотоураження, що виявлені нами за допомогою світлового мікроскопу, являли собою завершений процес, який є результатом попередніх змін, що настали у живій клітині через руйнування внутрішньоклітинних механізмів обміну і були тісно пов’язані зі змінами клітинної ультраструктури.

Виявлені при морфологічному дослідженні дистрофічні зміни – результат порушення обміну в опромінених тканинах. Виявлено між- і внутрішньоклітинний набряк у епідермісі, потовщення стінок мікросудин, зменшення кількості нервових волокон і їх закінчень. Електронно-мікроскопічне вивчення шкіри опромінених тварин дало змогу встановити, що під впливом УФ-опромінення у дозі  (1000 кДж·м^-2) спостерігалися виражені зміни мітохондрій базальних епідермоцитів і фібробластів (набухання, зморщування, ущільнення матрикса, злипання, руйнування крист). Ядра базальних епідермоцитів і клітин остистого шару набували зубчастого вигляду, на окремих ділянках каріолема не виявлялась, ідентифікувалися ділянки ущільнення хроматину. У ядрах базальних епідермоцитів зони зниженої електронної прозорості хроматину межували з локусами просвітлення. Цитоплазма набувала щільності і зменшувалася у об’ємі. Клітини перетворювались у електронно-непрозорі безструктурні маси. На нашу думку, причиною загибелі епідермоцитів і фібробластів було руйнування мембранних систем (мітохондрій, плазматичних мембран). Перерозподіл хроматину ядер і рибосом у цитоплазмі, відіграє важливу роль у порушенні обміну речовин у клітинах, що призводить до їх загибелі. Виявлялося також ураження плазматичних мембран, міжклітинний і інтраплазматичний набряк. Імовірно, при загибелі базальних епідермоцитів важливе значення має реакція мітохондрій, що виражається у їх набряку, руйнуванні мембран і крист, що призводить до витоку окиснювальних ферментів і макроенергетичних фосфатних сполук. Таким чином, руйнування мітохондрій призводило до зменшення кількості енергії, що забезпечує метаболічні процеси, порушує регуляцію енергетичного обміну. Зміни ядер базальних епідермоцитів виявлялись у їх зубчастих контурах, руйнуванні ділянок каріолеми, конденсації гранул хроматину під оболонкою. У ядрах виникали зони конденсації гранул (щільні ділянки), що межували із зонами просвітлення. Поряд з темними ядрами зустрічалися світлі. У ендотеліоцитах виявлялося посилення везикуляції, вакуолізація цитоплазми, пухирці, розпад базальної мембрани капілярів. Таким чином, ультрамікроскопічне дослідження дало змогу встановити зміни ультраструктури шкіри опроміненої шкіри і розширило наше уявлення про механізми фотоураження шкіри.

Розвиток гострої ексудативної запальної реакції, збільшення судинної проникності у зоні опромінення, як результат деполімеризації колагену і розриву мембран за участю фотонів світла, спрямували нашу увагу на вивчення ПОЛ в ураженій УФ-променями шкірі, зокрема його молекулярних механізмів. Вивчали біохімічні механізми реалізації окисного стресу у шкірі щурів, що зазнали дії різних доз УФ-опромінення спектра В. УФ-інтоксикація спричиняє виражені порушення енергетичного обміну в шкірі (зниження вмісту окиснених форм і сумарного вмісту нікотинамідних коферментів, коефіцієнта окиснені/відновлені форми, підвищення швидкості ферментативного розщеплення НАД⁺), які супроводжуються значними змінами жирнокислотного складу ліпідів (збільшення вмісту ненасичених жирних кислот, перш за все, арахідонової), виникненням окисного стресу та функціональними порушеннями про- та антиоксидантної рівноваги (підвищення вмісту ТБК-активних продуктів, зниження вмісту відновленого глутатіону внаслідок його інтенсивного використання та змінами глутатіонредуктазної та глутатіонпероксидазної активностей). Кастрація значно зменшує ці метаболічні прояви токсичного ураження.

Гемічна гіпоксія та граничні фізичні навантаження, які характерні для осіб похилого віку, змодельовані у експерименті на щурах-самцях. Вивчали стан про- та антиоксидантного гомеостазу при комплексній дії з ультрафіолетом спектра В. Встановлено, що за умов гемічної гіпоксії УФ-опромінення в субереритемних дозах сприяє нормалізації вмісту ТБК-активних продуктів, зниженню вмісту відновленого глутатіону, глутатіонредуктазної та глутатіонпероксидазної активностей. Максимальне фізичне навантаження (біг у третбані або плавання) ініціює у щурів найбільш виражену активацію ПОЛ (підвищення вмісту ТБК-активних продуктів) у шкірі. Комбінований вплив максимальних фізичних навантажень та УФ опромінення в гіпереритемних дозах не призводить до підвищення активації ПОЛ. Навпаки, за цих умов сумісна дія зазначених чинників викликає значно меншу активацію ПОЛ, ніж окремо взяті опромінення та фізичне навантаження.

Для з’ясування особливостей фотополімеризаційних процесів було створено модельну біополімерну композицію, яка за основу мала водний розчин колагену (масова частка 14%), гідрохінон (масова частка 0,01%), триетаноламін (масова частка 0,01%), метиленовий блакитний (масова частка 0,0001%). З моменту початку опромінення кожні 120 хв відбирали проби, формували з них тонкі плівки і знімали ІЧ-спектри. Спектроскопічні зміни характеризувалися такими показниками частот хвильового числа: вузька смуга достатньої інтенсивності з максимумом поглинання 820 см^-1, що характеризувала позаплощинне деформаційне коливання δ_as= СН₂; дублетна смуга з максимумами 965–990 см^-1 відповідала позаплощинному деформаційному коливанню δ_as=СН; синглетна смуга значної інтенсивності є проявом валентного симетричного коливання n_s=СН–С, максимум цієї смуги лежав у межах 1070 см^-1. У спектрах проб з експозиціями 24–36 год спектральні зміни зменшувалися градуально і через 42 год сходили нанівець (спектр не мав відмінностей у порівнянні з вихідним). Описані вище явища дозволяють зробити висновок про утворення функціонально активної вінілоподібної групи у колагеновій матриці у результаті лазерного опромінення. Найімовірніше, що ці групи утворювалися на бічних відгалуженнях колагенових ланцюгів, які мали максимальну рухомість, мінімальну кон’югацію з основним колагеновим ланцюгом. Наявність гідрохінону у системі дало змогу стабілізувати подвійні зв’язки вінільних груп, накопичити їх у системі до рівня концентрації, достатньої для ідентифікації методом ІЧ-спектроскопії. Одночасне зменшення інтенсивності всіх смуг у діапазоні 820–1070 см^-1 свідчило про розкриття подвійного зв’язку, тобто утворювався активний центр, здатний до подальшої структуризації, зокрема утворенню зшивок. Отримані результати свідчили про те, що вінільні функціональні групи, які формуються на бічних ланцюгових відгалуженнях колагену під дією опромінення гелій-неонового лазера, відповідають за процеси наступної структуризації колагену з подальшим утворенням зшивок між основними макроланцюгами.

Вивчені закономірності структурних перетворень, які були виявлені у колагеновому середовищі під дією лазерного опромінення видимої частини спектра, спонукали до вдосконалення модельної біоматричної системи, що дозволило глибше вивчити специфіку структурних перетворень, пов’язаних з віком. Наступне асимптотичне наближення до реальної сполучної тканини шкіри потребувало штучного підвищення фоточутливості модельного об’єкта за допомогою застосування джерела подвійних зв’язків для збільшення кількості активних центрів структуризації, що дало змогу дослідити глибинні закономірності структурних змін колагену.

Макромолекулярні властивості структурованих лазерохімічно зразків починали з дослідження стану вихідного колагену. Вивчалася кінетика його набухання у воді при температурі від 20 до 40⁰С з інтервалом 5⁰С. З аналізу кривих набухання встановлено, що при температурі від 20 до 25⁰С виникає обмежене набухання нативного колагену. Однак при 30⁰С і вище спостерігається необмежене набухання зразків. У цьому разі досягався максимальний ступінь набухання, який з часом починав зменшуватися, що видно з форми кінетичних кривих набухання у інтервалі 30–40⁰С. Це говорило про початок розчинення колагену, тобто молекули води руйнують утворений у результаті реакції гель і полімер колагену переходить у розчин у вигляді самостійних молекул, утворюючи справжній розчин. Усі отримані результати свідчили про те, що вихідний колаген не має у своїй структурі зшитих ділянок, у іншому разі не спостерігався б ефект розчинення. При 40⁰С виникало настільки стрімке розчинення колагену, що воно превалювало над процесом набухання.

Структуровані лазерохімічно зразки на основі колагену й амідів акрилової кислоти отримували в установці рідкофазного синтезу. Були досліджені процеси набухання цих зразків у воді при 20–40⁰С. Виходячи з форм кривих набухання встановлено, що внаслідок впливу лазерного опромінення на композицію утворювалися структури і колагенові композиції втрачали притаманну їм самостійність і можливість  утворювати справжній розчин. На підставі цього ми зробили висновок про утворення у досліджених системах зшитих структур.

Встановлено, що за умов лазерохімічного впливу на колаген, який містив акриламід, утворювався прищеплений гребенеподібний полімер, тобто молекули колагену набували розгалуженої структури. Тоді як у разі зшивки колагену метиленбісакриламідом, спостерігалося зшивання активним мономером колагенових молекул з утворенням об’ємної зшитої структури.

Значення макромолекулярних показників зразків збігалися з результатами спектроскопічних досліджень. На утворення об’ємно зшитої структури колагену з метиленбісакриламідом вказувала більш висока щільність і менший максимальний ступінь набухання (практично у три рази нижчий, ніж у колагену, структурованого акриламідом). На це ж вказувала константа набухання, більша швидкість набухання акриламіду щодо метиленбісакриламіду. Безумовним підтвердженням утворення зшитої структури колагену з метиленбісакриламідом була мала молекулярна маса колагенового фрагменту між сусідніми зшивками. Тобто зшивка колагену метиленбісакриламідом під впливом лазерного опромінення призводила до більш глибоких структурних змін з утворенням щільніших агрегатів у порівнянні з процесами фотоструктурування колагену акриламідом. Таким чином, результати ІЧ-спектроскопічних досліджень процесів структуроутворення за участю амідів акрилової кислоти, а також отримані макромолекулярні показники зразків колагену, структурованих цими самими амідами, доповнюють одне одного і узгоджуються з теоретичними уявленнями про будову і властивості макромолекулярних структур.

Процес лазероструктурування колагену амідами акрилової кислоти виникає залежно від їх структури по-різному. Розрахунок макромолекулярних параметрів цих середовищ вказував на утворення більш щільної структури зі метиленбісакриламідом у порівнянні з менш  щільною гребенеподібною структурою у разі колагену, структурованого акриламідом.

Проведені ІЧ-спектроскопічні дослідження з лазерного структурування колагену (а також оксипроліну) акриламідом показало, що у наведених процесах беруть участь NH- та ОН-групи колагенових макромолекул (оксипроліну). У цілому процес являв собою лазерохімічне прищеплення олігомерів акриламіду та макромолекули колагену. Утворений олігомер взаємодіє з функціональними групами колагену. Про це свідчить зниження інтенсивності смуг в ІЧ-спектрах, які відповідають коливанням ОН- та NH-груп колагену.

Аналогічним чином було проведене лазерохімічне структурування оксипроліну з метиленбісакриламідом. Цей процес зводиться до зшивання структури. Остаточний висновок про особливості структуроутворення колагену з амідами акрилової кислоти було можливим зробити при порівнянні макромолекулярних характеристик структурованих зразків.

Для з’ясування особливостей процесів фотохімічної полімеризації під дією лужноземельних металів і лазерного опромінення видимої частини спектра досліджували фотохімічні реакції, що відбуваються у колагеновій біоматриці, яка оброблена акрилатом кальцію. Аналіз спектра показував, що спостерігалася сукупність спектрів чистого колагену й акрилату кальцію. При інкубації нативного колагену у розчині акрилату кальцію поглинався останній колагеновою біоматрицею. Аналіз кінетичних кривих набухання свідчив про утворення зшитих структур, оскільки для них характерне обмежене набухання. У результаті взаємодії колагену з мінеральними речовинами, зокрема кальцієм, утворюється біологічна структура, яка має велику механічну міцність і малу біохімічну активність. Встановлено, що під дією опромінення оптичного діапазону колаген може індукувати на себе сорбцію іонів кальцію з плазми крові чи позаклітинної рідини. Органічна основа матриці утворюється за допомогою деструкції колагенового волокна і виникнення комплексів з лужноземельними металами, зокрема, кальцієм. Таким чином, утворення координаційних сполук кальцію з колагеном І типу під дією опромінення оптичного діапазону можна розглядати як захисну реакцію, яка підвищує резистентність сполучної тканини і протидіє патогенному фактору. Відкладання кальцію на полімерній матриці залежить від ковалентних поперечних зв’язків колагену, кількість яких характеризує ступінь зрілості колагену. Виявлений взаємозв’язок між структурою, організацією і пакуванням макромолекул органічного матриксу сполучної тканини. Виявлено, що ділянки поліпептидного ланцюга, які мають велику кількість негативно заряджених амінокислот відповідальні за ініціальні реакції кальцифікації.

Дослідження в модельних біосистемах акрилатів 3d-металів як структурувальних зшивальних агентів було перспективним, оскільки вони надавали можливість встановити факт утворення координаційних сполук між іонами 3d-металів і колагеном.

Порівняння електронних спектрів поглинання водного розчину акрилату кобальту та колагенової плівки, обробленої тією самою сіллю показало, що вони збігаються і практично ідентичні. Зіставлення положення максимумів смуг поглинання комплексу кобальту до і після гідратації показувало, що дегідратація викликає ослаблення сили поля лігандів внаслідок заміщення атомів кисню молекул води у внутрішній координаційній сфері комплексу кобальту на атоми кисню акрилатів і гідроксильних груп амінокислотних залишків оксипроліну, як найбільш характерного для колагену компонента.

Дослідження ІЧ-спектрів змішаних макрокомплексів 3d-металів з оксипроліном дало змогу з’ясувати участь NН- та ОН-груп амінокислотних залишків у фотобіохімічних реакціях з участю акрильних груп комплексів. Встановлено, що результатом лазерного впливу є приєднання до комплексу металу додатково – через аміно- і гідроксильні групи – двох макромолекули колагену через взаємодію з акрильними лігандами макрокомплексу, внаслідок чого утворюється координаційний поліедр, оточений з усіх боків кисневокоординованими до металу лігандами.

Методи фізичної і біологічної хімії дали змогу отримати принципово нові відомості про закономірності біосинтезу, молекулярної структури і катаболізму колагену при старечій в’ялості шкіри. Встановлено, що всі складові компоненти колагенового волокна після виходу з синтезуючих їх клітин набувають протягом життя складних хімічних і конфірмаційних змін на всіх рівнях структурної організації, причому більшість з цих змін зумовлені молекулярною структурою колагену. Протягом життя змінюється склад колагену шкіри лиця, активна модифікація його білкових структур, що виявляється у будові та формі тканин лиця. Характерною особливістю колагену шкіри при її старечій в’ялості є утворення внутрішньо- і міжмолекулярних поперечних ковалентних зв’язків, що забезпечують компенсаторну стабілізацію структури його молекули, визначають інтенсивність метаболізму і впливають на розчинність колагену.

На основі експериментальних досліджень та їх теоретичного обгрунтування з’ясовано біохімічні механізми реалізації оксидантного захисту сполучної тканини за патологічних станів організму, опосередкованих окисним стресом (опромінення УФ і видимої ділянки спектра). Встановлено, що безпосередня взаємодія продуктів ПОЛ з колагеном не призводить до його деструкції. Описане вище явище дає змогу зробити висновок про фотопротективну дію перекису водню відносно колагенових волокон шкіри. На нашу думку, стабілізувальна дія перекису водню пов’язана з утворенням гідратної оболонки на поверхні колагенового волокна, яка стабілізує всю колагенову структуру. У результаті лазерохімічного структурування колагену (оксипроліну) під дією опромінення УФ і видимої ділянки спектра виникають фотодисоціативні, фотоізомеризаційні та фотодимеризаційні зміни структури. Зміни колагену І типу при старечій в’ялості шкіри лиця спричинені фоторуйнуванням груп NH  і ОН під дією опромінення УФ і видимого (фіолетового) діапазонів спектра.

Патогенез старечої в’ялості шкіри лиця зумовлений сумарним впливом багатьох чинників:

1)      дегідратацією дерми відкритих ділянок шкірного покриву;

2)      комплексоутворенням, що відбуваються між іонами металів та активними групами макромолекул колагену (набувають своєї комплексоутворювальної активності за умов дегідратації, коли молекули води, що відіграють роль дезактиватора бокових функціональних груп колагену, зникають, тим самим активуючи реакційно здатні групи колагену);

3)      фотохімічним зшиванням, тобто фотополімеризаційними процесами, які відбуваються у дермі під впливом сонячних променів (УФ та видимий діапазони спектра);

4)      порушенням динамічної рівноваги між процесами біосинтезу та катаболізму колагену;

5)      розладом ауторегуляції клітин, порушенням роботи транспортних систем (розлади мікроциркуляції, основної речовини сполучної тканини), порушенням функції нервової і ендокринної систем.

ВИСНОВКИ

У дисертації здійснено теоретичне узагальнення і нове практичне розв’язання наукової проблеми відносно етіології і патогенезу старечої в’ялості шкіри лиця.

Науково обґрунтована патогенетична значимість опромінення оптичного діапазону спектра, гемомікроциркуляторних порушень, дисбалансу мікроелементів, реакцій фотополімеризації колагену у розвитку старечої в’ялості шкіри лиця, що відкриває перспективні напрямки для розробки лікувально-профілактичних заходів у дерматокосметології.

1.      На сучасному рівні розвитку медицини стареча в’ялість шкіри лиця є однією з ключових медико-соціальних проблем дерматології, що пов’язано з її поширеністю, поліморфізмом клінічних проявів, труднощами діагностики, відмінностями перебігу та наслідків.

2.      Аналіз 1624 амбулаторних карт осіб, які відвідують дерматокосметологічні установи, показав, що у 135 (8,3 %) з них виявлялася стареча в’ялість шкіри лиця у вигляді зморщок, зниження еластичних властивостей шкіри, телеангіектазій, ангіом, посиленої пігментації, сенільних кератом. Клініко-лабораторне обстеження осіб із зазначеною патологією показало виражені зміни швидкості відлущування рогового шару епідермісу, тинкторіальних властивостей, зниження захисних властивостей шкіри та її реактогенності. Ці показники наближуються до значень, отриманих у практично здорових людей похилого віку на обличчі, а на закритих ділянках тіла відповідають віковій нормі.

3.      Встановлено, що межа міцності при розтягненні, відносні видовження (при напруженні, розриві, залишкове, пружне), модуль пружності та жорсткість шкіри ідентичні на симетричних ділянках тіла, не мають відмінностей у осіб різної статі і залежать від особливостей переплетення колагенових пучків у різних топографічних зонах. Міцність при розтягуванні шкіри прямо пропорційно залежить від товщини дерми і кількості колагенових волокон, орієнтованих у напрямку навантаження. Зменшення межі міцності при розтягуванні у осіб з ознаками старечої в’ялості шкіри лиця вказує на деструктивні зміни у колагенових волокнах і їх пучках.

4.      Дані морфологічних досліджень вказують на те, що вікова інволюція шкіри лиця характеризуються значними змінами гістоархітектоніки, що виявляються порушенням процесів кератинізації (епідермоцитарна дисфункція), нерівномірним потовщенням базальної мембрани епідермісу, ознаками фіброзу дерми з невідповідністю напрямку колагенових волокон відносно повздовжньої осі фібробластів (фібробластична дисфункція), дегенерацією еластичних волокон, склеротичними змінами судин ГМЦР, зменшенням кількості нервових волокон та їх закінчень, дистрофічними змінами ендотеліоцитів, вогнищевою плазморагією. Електронно-гістохімічними методами встановлено, що базальні епідермоцити, ендотеліоцити мікросудин, перицити, м’язи шкіри виявляють активність Са²⁺-АТФази та Мg²⁺-АТФази на плазматичних мембранах, яка зменшується з віком. Стареча в’ялість шкіри лиця характеризується також порушенням енергетичних процесів, що виявляється зменшенням активності цих ферментів на мембранних структурах клітин епідермісу і дерми. Дегенеративні процеси, що відбуваються в шкірі лиця при її старечій в’ялості, характеризується зменшеним вмістом колагену та наявністю фотохімічних зшивок у його молекулі, зменшеним вмістом вологи, збільшенням температури зварювання, товщини сосочкового та сітчастого шарів дерми, а також кута нахилу колагенових пучків.

5.      Морфологічні зміни мікросудин, розлади мікрогемодинаміки, зміни реологічних властивостей крові та NO-залежний тип дисфункції ендотелію характеризують вікову інволюцю шкіри. Гемомікроциркуляторні розлади на системному і місцевому, трофічному рівні, що супроводжують старечу в’ялість шкіри лиця, підсилюють її клінічні симптоми та сприяють погіршенню морфофункціонального стану.

6.      Методами атомно-адсорбційної спектрометрії встановлено збільшення вмісту кобальту, нікелю, міді, заліза та кальцію і зменшення магнію у шкірі лиця при її старечій в’ялості, що є проявом захистно-пристосувальних реакцій. Вміст кобальту, міді, заліза та кальцію у шкірі практично здорових людей похилого віку збільшується у несуміжних анатомічних ділянках, а цинку – зменшується. Вміст магнію у шкірі практично здорових людей не змінюється у віці від 22 до 74 років. Стареча в’ялість шкіри лиця супроводжується підвищенням вмісту первинних (ДК-гідроперекисів) і вторинних (малоновий діальдегід) продуктів ПОЛ. Оксирадикальне ушкодження зовнішнього покриву при розвитку старечої в’ялості шкіри лиця має локальний характер і залежить від площі зон надмірного УФ-опромінення.

7.      Експериментальні дослідження з впливу сонячного спектра на шкіру щурів показали, що при опроміненні УФ-променями спектра В у гіпереритемних дозах (1000 кДж·м^-2) поряд з дистрофічними процесами у глибині тканини розвивається ексудативна реакція, що супроводжується набряком, гомогенізацією сполучнотканинних волокон, змінами кількості кровоносних капілярів, крововиливами, периваскулярною, перифолікулярною, дифузною інфільтрацією лейкоцитами, а також активацією тканинних базофілів. Променеві реакції характеризуються нетривалими зворотними запальними і дистрофічними явищами епідермісу і дерми. Ураження характеризуються її стійкими змінами за рахунок деструктивних чи глибоких дистрофічних процесів не тільки епідермісу і дерми, а і гіподерми. При надлишковому УФ-опроміненні виявляється архітектурний дисбаланс колагенових волокон, що є ознакою фібробластичної дисфункції, яка проявляється хаотичним розташуванням колагенових фібрил відносно поверхні фібробласта. УФ-опромінення спектра В у гіпереритемних дозах призводить до зменшення активності  Са²⁺-АТФази на мембранних структурах клітин епідермісу і дерми, а також мікросудин.

8.      Експериментально встановлено, що УФ-запалення спричиняє виразні порушення енергетичного обміну в шкірі щурів (зниження вмісту окиснених форм і сумарного вмісту нікотинамідних коферментів, коефіцієнта окиснені/відновлені форми, підвищення швидкості ферментативного розщеплення НАД⁺), які супроводжуються значними змінами жирнокислотного складу ліпідів (збільшення вмісту ненасичених жирних кислот, насамперед, арахідонової), виникненням окисного стресу та функціональними порушеннями про- та антиоксидантної рівноваги (підвищеннія вмісту ТБК-активних продуктів, зниження відновленого глутатіону внаслідок його інтенсивного використання та змінами глутатіонредуктазної і глутатіонпероксидазної активностей). Кастрація тварин значно зменшує ці метаболічні прояви токсичного ураження.

9.      Асимтотичне наближення in vitro показало, що світлочутливість колагену шкіри зумовлена реакціями фотополімеризації. Вінільні функціональні групи, які формуються на бічних ланцюгових відгалуженнях колагену під дією опромінення УФ і оптичного діапазонів, відповідають за процеси наступної структуризації колагену з утворенням зшивок між основними макроланцюгами, які утворюються при старечій в’ялості шкіри. Методами лазерохімічного структурування за участю акриламіду та метиленбісакриламіду доказано, що молекулярні механізми розвитку старечої в’ялості шкіри пов’язані з аміно- та гідроксильними групами макроланцюгів колагену.

10.  Спектроскопічними методами встановлено, що процеси фотополімеризації колагену шкіри при її старечій в’ялості мають відмінності, які залежать від вмісту лужноземельних та 3d-металів. При інкубації нативного колагену шкіри у розчинах акрилатів Са (ІІ), Со (II), Nі (II), Сu (II) поглинаються останні, про що свідчать результати як ІЧ, так і електронної спектроскопії поглинання. Внаслідок взаємодії іонів кальцію з NH₂- та ОН- групами колагену утворюється зшита структура, яка містить у собі координаційні вузли. Результатом реакції фотозшивання акрилатів 3d-металів є приєднання до комплексу металу додатково – через аміно- і гідроксильні групи – двох макромолекул колагену за допомогою взаємодії з акрильними лігандами макрокомплексу, що призводить до утворення координаційного поліедру, оточеного з усіх боків кисневокоординованими до металу лігандами.

11.  Зміни молекулярної будови колагену при старечій в’ялості шкіри лиця зумовлені фоторуйнуванням груп N–H і –ОН під дією опромінення УФ і видимого (фіолетового) діапазонів спектра. У результаті лазерохімічного структурування колагену (оксипроліну) під дією опромінення УФ і видимої ділянки спектра виникають фотодисоціативні, фотоізомеризаційні та фотодимеризаційні зміни структури. Безпосередня взаємодія продуктів ПОЛ з колагеном не призводить до його деструкції, а має фотопротективні властивості, які пов’язані з утворенням гідратної оболонки на поверхні колагенового волокна.