ЛІМФОЦИТОПОСЕРЕДКОВАНІ МЕХАНІЗМИ ЗА УМОВ ХРОНІЧНОЇ ГІПЕРІМУНОКОМПЛЕКСЕМІЇ ТА ВПЛИВ НА НИХ КОРВІТИНУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

Короткий зміст

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на статевозрілих білих щурах-самцях масою 200-250 г., в осінньо-зимовий період. Експериментальні втручання та евтаназія тварин проводилась із дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних наукових досліджень (Страсбург, 1985), ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією з питань біоетики Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (протокол № 15 від 12 грудня 2005 р.) порушень морально-етичних норм при виконанні науково-дослідної роботи не виявлено. У процесі дослідження використано 200 тварин, яких розподіляли на групи: перша – інтактні тварини, які отримували плацебо і служили контролем; друга – тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією; третя – інтактні тварини, які отримували корвітин; четверта – тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією, які отримували корвітин.

Хронічну гіперімунокомплексемію відтворювали за допомогою класичного методу за Cohrane C. і Kofler D. (1973) з посиланням на праці Williams R. (1980) та досліджень Чоп’як В.В. (1998). Для цього у хвостову вену кожні 7 днів упродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий альбумін (НВФ “Simko Lpd”, Україна) із розрахунку 100 мг/кг. Розчин корвітину (виробництва ЗАТ НВЦ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод”, Україна) вводили внутрішньоочеревинно в дозі 40 мг/кг раз на добу впродовж 10 днів. Евтаназію тварин здійснювали шляхом декапітації.

Отримання клітин лімфоцитів проводили на подвійному градієнті щільності розчинів фікол-урографіну: фікол (Ficoll-400 – “Pharmacia Fine Hemical”, Швеція) урографін (Urografin – “Shering”, Німеччина) із густинами, що відповідали (с₁ =1,095 г/см³  та с₂  = 1,077 г/см³) (Boyum A., 1987). Ендотеліальні клітини виділяли із черевної аорти щура методом ферментативного диспергування з використанням 0,1% розчину колагенази (“Fluka Chemic A.G.“, Німеччина) (Коваленко Т.М., 1999).

Інкубацію ізольованих лімфоцитів та ендотеліальних клітин проводили у середовищі 199 (РАМН Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва) з 20% вмістом телячої ембріональної сироватки (НВП “Cангва”, Україна) в 24 лункових пластикових планшетах (“Sigma“, США). Для запобігання змішуванню лімфоцитів та ендотеліоцитів клітини розділяли напівпроникними мембранами з діаметром пор 3мм (“Sigma“, США), виділені клітини вносились в лунку планшети у співвідношенні 1:1. Клітини інкубували в термостаті при 37⁰ С в атмосфері із 5% СО₂ впродовж 1 год (Мойбенко О.О., Сагач В.Ф., 2000). Розчин корвітину, в дозі 1•10^{– 4} г/л, в умовах in vitro вносили в лунку планшети. Дозу застосування корвітину визначали на підставі літературних даних (Мойбенко О.О., 2000; Караванская И.Л., 2002).

            Розвиток і верифікацію хронічної гіперімунокомплексемії оцінювали у сироватці крові за рівнем циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), визначення яких проводили за допомогою методу преципітації в поліетиленгліколі – 600, та загальною комплементарною активністю сироватки крові, яку визначали за методом 50% гемолізу еритроцитів (Осипов С. Г., Логинский В.Е., 1983).

Дослідження активності ферментів NO-синтаз (сNOS та іNOS) проводили калориметричним методом (Selter M., 1991). Вміст нітрит-аніонів визначали за допомогою методу Гріна в модифікації Коцюруби А.В. (Green L. S., 1982; Коцюруба А. В., 2000), нітрат аніонів методом (Bank N.R. 1993). Визначення вмісту нітрозоглутатіону (GSNO) проводили за методом (Gerdel D., 1996). Аргіназну активність визначали з допомогою спектрофотометрії (СФ-40) за методом (Gardanta C. L., 1982). Вміст сечовини в інкубаційній суміші та безбілкових зразках проб визначали калориметричним методом за допомогою добірки реактивів (ВІО-LA-TEST, МОКОVINA, “Lachema”, Чехія) та реактивів фірми (“Філіст-Діагностика“, Україна).

Дослідження ультратонкої структури лімфоцитів та ендотеліальних клітин проводили методом трансмісійної електронної мікроскопії за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100.

Статистичне опрацювання результатів дослідження проводили із застосуванням статистичного пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windovs.

Основні результати досліджень та їх обговорення.

Для реалізації поставленої мети, першим етапом нашої роботи було дослідження процесів NO-синтазної та аргіназної активності в ізольованих лімфоцитах та ендотеліальних клітинах при їх інкубації за умов норми і хронічної гіперімунокомплексемії.

Результати, отримані в умовах in vitro, встановили, що присутність в інкубаційному середовищі ендотеліальних клітин за умов норми здатна незначно впливати на процеси синтезу оксиду азоту в лімфоцитах. Зменшення активності іNOS (Р<0,05) компенсовано майже рівнозначним підвищенням активності сNOS (Р<0,05). Сумарна активність NOS у лімфоцитах за умов їх інкубації з ендотеліоцитами має лише тенденцію до зростання. Зміни вмісту стабільних метаболітів NO та нітрозоглутатіону (GSNO) за цих умов були недостовірними. Паралельно з цим відзначено пониження активності аргінази в 1,4 раза (Р<0,05) та зменшення вмісту сечовини у 2,9 раза (Р<0,05). У ендотеліоцитах за умов їх інкубації з лімфоцитами спостерігається зростання активності іNOS і сNOS у 2,1 раза (Р<0,001), проте дана активність ферментів не забезпечила достовірних змін у рівні нітрит - та нітрат - аніонів. У вмісті нітрозоглутатіону достовірних змін також не встановлено.

Отримані результати підтверджують той факт, що ендотеліальні клітини володіють силь­ною системою захисту від ушкоджувального впливу агресивних факторів, що і проявилося знач­ним збільшенням потенціалу NOS (Р<0,001). Стосовно активності аргінази, то в умовах сумісної інку­бації клітин, в ендотеліоцитах виявлено зменшення її активності у 2,5 раза (Р<0,05). Одно­часно відзначено падіння рівня сечовини в клітинах ендотелію, проте воно було недостовірним.

            Аналіз кооперативної взаємодії лімфоцитів та клітин ендотелію у тварин із змодельованою хронічною гіперімунокомплексемією виявив дещо інші особливості у процесах метаболізму оксиду азоту. Так, інкубація лімфоцитів в присутності ендотеліоцитів по відношенні до контролю показала істотне підвищення в 3,6 раза іNOS (Р<0,001) та зменшення в 2,2 раза сNOS (Р<0,001). Досить цікавим за цих умов є зниження вмісту NO₂Ї- аніону у порівнянні з клітинами контролю (Р<0,001), показник рівня NO₃Ї – аніону є також понижений (Р<0,001). Паралельно у досліджуваних тест-об’єктах зменшується і вміст GSNO (Р<0,001). Показник сумарної активності NOS за цих умов також вірогідно знижений (Р<0,05). Активність аргінази у цих клітинах зростає в 1,5 раза (Р<0,05), а вміст сечовини в 5,6 раза (Р<0,05). Інкубація ендотеліоцитів з лімфоцитами дослідних тварин показала зростання іNOS (Р<0,05) по відношенні до контролю, активність NOS, сNOS, рівень стабільних метаболітів та вміст GSNO за даних умов є пониженим. Зміни, виявлені за цих умов у показниках аргінази і сечовини, є наступними: підвищена аргіназна активність (Р<0,05) та значно (на 53%) зростає вміст сечовини (Р<0,05), що в даній ситуації може бути свідченням розвитку оксидантного стресу в ендотеліальних клітинах.

Отже, отримані результати дозволяють припустити, що при хронічному гіперімунокомплексному процесі пониження синтезу оксиду азоту в активованих лімфоцитах прямо або опосередковано призводить до зміни в процесах його синтезу у ендотеліальних клітинах, що в подальшому може призвести до порушення функціональної здатності ендотелію та ушкодження судин. Гальмування фізіологічної регуляторної функції оксиду азоту при хронічній гіперімунокомплексемії створює умови для інгібування NO-синтазного шляху і веде до активації аргіназного шляху метаболізму L-аргініну.

            Для з’ясування особливостей дії корвітину на два шляхи метаболізму NO в умовах in vitro дослідження проведено, як у контрольній групі тварин, так і у тварин із змодельованим хронічним гіперімунокомплексним процесом.

Присутність корвітину в інкубаційному середовищі інкубованих лімфоцитів та ендотеліоцитів інтактних тварин призвела до пониження у лімфоцитах рівня іNOS (Р<0,05), NO₂Ї (Р<0,05) та вмісту GSNO (Р<0,05). За даних умов прослідковується тенденція до зростання показників: NOS (Р<0,05), сNOS (Р<0,05) та NO₃Ї (Р<0,05). Присутність корвітину інгібувала активність аргінази у лімфоцитах в 2,4 раза (Р<0,05), вміст сечовини за цих умов не змінився. Аналогічні дослідження, проведені в ендотеліоцитах інтактних тварин, не виявили вірогідних змін у показниках метаболізму L-аргініну.

Додавання корвітину до інкубаційної суміші клітин за умов хронічної гіперімунокомплексемії виявило його коригуючий вплив на процеси синтезу оксиду азоту.

            Так, наявність корвітину призвела до зниження активності іNOS (Р<0,05), активація якої спостерігалась за умов інкубації лімфоцитів з ендотеліоцитами при хронічній гіперімунокомплексемії. Паралельно підвищився вміст сNOS та рівень стабільних метаболітів у лімфоцитах (Р<0,05), інгібована активність аргінази (Р<0,05) та вміст сечовини (Р<0,05). Виявлено також виражений нормалізуючий ефект корвітину на функціональну активність ендотеліоцитів, що проявилося зниженням активності індуцибельної NO-синтази (Р<0,05), пониженням рівнів NO₂Ї (Р<0,05) і NO₃Ї (Р<0,05) та вмісту GSNO (Р<0,05). Активність аргінази за даних умов понизилась у 2 рази (Р<0,05), що навіть перевищує показник контролю в 1,6 раза (Р<0,05), вміст сечовини також зменшився у 3,4 раза (Р<0,05).

Отже, отримані експериментальні дані свідчать, що в умовах in vitro протекторні особливості водорозчинної форми корвітину пов’язані, перш за все, із його здатністю специфічно пригнічувати активність індуцибельної NO-синтази, без інгібування активності її конститутивної ізоформи в лімфоцитах і, особливо, в ендотеліальних клітинах за умов хронічної гіперімунокомплексної патології. Ця селективна властивість корвітину, за умов даного захворювання, проявляється також інгібуванням аргіназної активності і позитивною зміною неокисного шляху метаболізму L-аргініну на окисний.

            Результати, отримані в умовах in vitro, стали основою для подальшого дослідження in vivo.

Розвиток хронічної гіперімунокомплексемії в цих умовах супроводжується значними змінами імунологічних показників. У всіх дослідних тварин встановлено вірогідне зростання рівня ЦІК (Р<0,01) різної молекулярної маси. Високий рівень ЦІК можна пояснити виснаженням захоплювальної здатності фагоцитів впродовж 12 тижнів досліду. Підтримання хронічної персистенції ЦІК у судинному руслі може також бути результатом недостатньої активності рецепторів мембран еритроцитів, які є основними їх носіями до “кліренсних” органів (Stokol T. et al., 2004). За участю цього механізму вони елімінуються фагоцитарною системою (Дрюк Н.Н., 2002; Якобісяк М., 2004). При надмірному утворенні ЦІК ця система може не спрацьовувати, і вони починають проявляти патогенну дію по відношенню до клітин-мішеней. Підтвердженням порушення функцій мембран цих клітин свідчать роботи (Чоп’як В.В., 1998; Соловьев А.И., 2003; Jancar S., 2005). Крім того, це комплексоутворення є комплементзалежним (Р<0,05), оскільки в умовах довготривалої імунної відповіді склад імунних комплексів поповнюється новими антитілами, що створює умови для їх фіксації та активації системи комплементу. Активація системи комплементу також корелює із гіперпродукцією оксиду азоту, наслідком чого, можливо, є збільшення на поверхні ендотеліоцитів генів, які кодують хемокіни – ІЛ-8, МСР-1, RANTES (Sen C.K., 1996; Чоп’як В.В., 2004).

Зменшення показника гемолітичної активності сироватки крові при хронічній гіперімунокомплексемії може свідчити про посилене використання компонентів системи комплементу для зв’язування ЦІК з клітинами. За цих умов особливо страждає кілінгова функція фагоцитів, сприяючи накопиченню ЦІК на клітинах-мішенях, а також їх преципітації в судинному мікроциркуляторному руслі (Malinski T., 2004).

Перед тим, як застосувати корвітин для корекції порушень імунологічних показників у тварин із хронічним гіперімунокомплексним процесом, ми поставили за мету дослідити його вплив на інтактний організм. Таке дослідження дозволяє виявити вплив препарату на імунологічну та неспецифічну реактивність організму, чутливість окремих ланок імунної системи до його дії, а також виключити можливий дисрегуляторний ефект на механізм імунної відповіді.

Як свідчать результати проведених досліджень, показники ЦІК у сироватці крові інтактних тварин після введення корвітину достовірно знижуються (Р<0,001). За цих умов рівні ЦІК – великих, середніх та малих розмірів – зменшуються. Вивчення впливу корвітину на імунологічні показники інтактних тварин виявило, що даний препарат знижує рівні ЦІК усіх розмірів та показник гемолітичної активності сироватки крові, що може свідчити про підвищення елімінації ЦІК з кровоплину фагоцитуючими клітинами.

Результат оцінки впливу препарату на визначення вмісту ЦІК у сироватці крові щурів за умов імунокомплексної патології показав пониження рівня великих (Р<0,05), середніх (Р<0,05) і малих (Р<0,05) ЦІК та нормалізацію активності системи комплементу (Р<0,05), що свідчить про посилення механізмів фагоцитозу.

Відомо, що імунокомплексне ураження тканин прямо чи опосередковано пов’язано із змінами в метаболізмі оксиду азоту (Uesugi M., 1998). Отримані експериментальні дані показали, що розвиток хронічної гіперімунокомплексемії супроводжується експресією індуцибельної NO-синтази, активність якої в лімфоцитах зросла у 4,7 раза (Р<0,001), а в клітинах ендотелію у 2 рази (Р<0,01). Потенціал конститутивної NO-синтази за цих умов зазнає інгібування – на 61,6% (Р<0,001) в лімфоцитах (рис.1) та на 36,9% (Р<0,05) у ендотеліоцитах (рис.2).

Зміна показників ферментативної активності NOS супроводжуються підвищенням метаболізму аргіназного шляху NO: активність аргінази в лімфоцитах (рис.1) зросла у 5,1 раза (Р<0,001), вміст сечовини – 3,9 раза (Р<0,001); в ендотеліоцитах (рис.2) зміни в синтезі оксиду азоту є менш значними – активність аргінази зросла в 1,6 раза (Р<0,001), вміст сечовини – 1,9 раза (Р<0,001). Можливо, підвищення рівня сечовини у клітинах, при зміні утилізації аргініну на неокисний шлях метаболізму, має компенсаторне значення, враховуючи її відому антиоксидантну роль (Коцюруба А.В., 2000; Aoyagi K., 2003).

Інгібування ферментативної активності NOS може бути зумовлено пониженням біодоступності запасів L-аргініну (Зенков Н.К., 2000; Корж А.Н., 2003), що в подальшому може призвести до порушення рівноваги між двома шляхами – окисним (NO-синтазним) і неокисним (аргіназним). Окрім цього, виявлені зміни в активності NO-синтаз, очевидно, можуть бути пов’язані із тим, що активовані імунними комплексами фагоцити індукують продукування прозапальних цитокінів, які є промоторами iNOS в імунокомпетентних клітинах (Li H., Forstermann U., 2000; Nishimura M., 2004; Nangaku M., 2005). Стійка активація прозапальних цитокінів може створювати сприятливі умови для розвитку автоімуноагресії та подальшого підтримання гіперімунокомплексемії (Чоп’як В.В. 1998; Setiady Y., 2004; Norman M., 2005).

Відомо також, що запальні цитокіни можуть діяти як тригери, що переключають синтез NO з конститутивної ізоформи на індуцибельну (Cattaruzza M. et al., 2003).

Введення корвітину інтактним тваринам показало, що його вплив на процеси синтезу оксиду азоту у лімфоцитах та ендотеліальних клітинах характеризується недостовірним підвищенням ферментативної активності NOS, сNOS та рівнів нітрит - і нітрат - аніонів. Вміст GSNO за цих умов зростає як у лімфоцитах (Р<0,001), так і в ендотеліальних клітинах (Р<0,05). Активність індуцибельної ізоформи NOS в лімфоцитах інгібована (Р<0,001), а у ендотеліоцитах зростання її показника є недостовірним. Дослідження впливу корвітину на активність аргінази і рівень сечовини у лімфоцитах та ендотеліальних клітинах інтактних тварин виявило незначне пониження їх вмісту лише у лімфоцитах (Р<0,01).

Дія корвітину на показники NO-синтазної активності за умов експериментального гіперімунокомплексного процесу мала наступні особливості: введення корвітину супроводжується зростанням сNOS в 2,6 раза у лімфоцитах (Р<0,001), де спостерігається відновлення активності цього ферменту до показників контролю та значним інгібуванням iNOS – на 60,08% (Р<0,001), проте це зменшення не було достатнім для нормалізації активності даного ферменту відносно контролю (рис.1); ферментативну активність NO-синтаз в клітинах ендотелію (рис.2) за цих умов характеризує підвищення активності сNOS, величина якої збільшилася в 2,4 раза (Р<0,001), паралельно із цим відзначено зниження активності іNOS – на 28,6% (Р>0,05). Дані величини NO-синтаз у ендотеліоцитах перевищили вихідний рівень контролю – сNOS у 1,5 раза (Р<0,05) та іNOS в 1,6 раза (Р<0,05).

Отримані експериментальні дані свідчать, що протекторні особливості водорозчинної форми кверцетину – корвітину, при даній патології пов’язані, перш за все, із його здатністю специфічно пригнічувати активність іNOS. На механізм впливу кверцетину щодо пониження активності ферменту індуцибельної NOS, як на транскрипційному, так і на посттрансляційному рівнях, шляхом інгібування експресії мРНК та пониження серії сигнальних інтрацелюлярних шляхів індуцибельної NOS вказували (Kim N.K. et al., 1999; Chen Y.C., Chakravorty M. et al., 2001).