МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ ПЕЧІНКИ ПІД ВПЛИВОМ ПЕСТИЦИДУ 2,4-Д АМІННОЇ СОЛІ (ДИХЛОРФЕНОКСИОЦТОВОЇ КИСЛОТИ) ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ ГЛУТАРГІНОМ

Короткий зміст

Матеріал і методи дослідження. Експерименти були проведені на 121 білому рандомбредному щурі-самці (Rattus Norvegicus L.) масою 150-180 г (5 груп). Тривалість експерименту від 3 до 60 діб.

Щурам першої групи (24 тварини) вводили комерційний препарат 2,4-Д 700 – ефективний гербіцид на основі 2,4-Д диметиламінної солі, внутрішньошлунково (у дозі 1/10 DL50) через день протягом 14 діб (7 введень).

Другій групі (24 тварини) вводили П 2,4–Д та глутаргін одночасно, внутрішньошлунково: пестицид 2,4-Д – 7 введень через день і 14 щоденних введень глутаргіну. Глутаргін продовжували вводити щодня до 30 доби досліду.

24 тваринам третьої групи вводили П 2,4-Д (14 діб) і після цього глутаргін (таблетована форма) у дозі 1,6 мг/кг маси внутрішньошлунково протягом 30 діб, щодня після останнього введення пестициду.

Четверта група (24 тварини): протягом 14 діб вводили П 2,4–Д внутрішньошлунково через день. У наступні 5 діб щодня внутрішньо­очеревинно вводили 4% розчин глутаргіну по 1,7 мл кожній тварині (застосування згідно інструкції).

П’ята група (18 тварин) – контрольна, тварини отримували по 0,5 мл дистильованої води інтрагастрально – через день, протягом 30 діб. Для встановлення біохімічних показників за умов норми було використано 7 тварин.

Усі тварини знаходилися в стандартних умовах віварію. Утримання щурів та маніпуляції, які з ними проводилися, відповідали “Загальним етичним принципам експериментів на тваринах”, ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001р.). Тварини дослідних і контрольної груп (К) утримувались в ідентичних умовах і матеріал, взятий від них для дослідження, оброблявся паралельно. Тварин виводили з експерименту шляхом передозування ефірного наркозу. Шматочки печінки фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, зрізи забарвлювали гематоксиліном і еозином.

Морфометричне дослідження проводили з використанням аналізатора зображень на базі програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool® for Windows® (version 2.00) в інтерактивному режимі з застосуванням об’єктива х40 і фотоокуляра х1,7. Аналізатор зображень калібрували тестовим зразком “МИРА” (ГК 7.216.028-01, виробництво НДІ “Квант”). В інтерактивному режимі вимірювали площу (Sh) Гц і ядра (Sn) Гц та їх периметри. Обчислювали відношення Sn/Sh, коефіцієнти форми Гц (Fh) і його ядра (Fn) (F=P2/4pS, де Р – периметр, S – площа досліджуваного об’єкта) (В.Л.Исаков и др., 1988). У кожному препараті вимірювали метричні показники всіх одноядерних Гц, які містили ядерце.

Мікрофотографії отримані за допомогою мікрофотонасадки МФН-10 (гомаль 1,7), перехідного оптичного пристрою Optem 257010 та цифрової камери Nikon Coolpix 5400. Реальне збільшення на мікрофотографіях складає, відповідно, для об’єктивів х10 – х150, х25 – х375, х40 – х600.

Електронномікроскопічне дослідження печінки проводили згідно загальноприйнятих положень за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ – 125К із наступним фотографуванням при збільшенні від 4800 до 16000 разів.

Гістохімічне дослідження ферментів – СДГ і КФ – проводили за методами Берстона (З.Лойда и др., 1982). Активність оцінювали напівкількісним методом у балах, враховуючи досвід О.Д.Мишнева і співавт. (1986): 0 балів – відсутність активності, 1 бал – поодинокі гранули з забарвленим продуктом реакції, слабе дифузне забарвлення, 2 бали – невелика кількість гранул, переважає дифузне забарвлення, 3 бали – гранули локалізовані біля одного з полюсів клітини на тлі дифузного забарвлення, 4 бали – клітина заповнена гранулами нерівномірно, слабе дифузне забарвлення, 5 балів – дуже висока активність, цитоплазма клітини рівномірно заповнена великою кількістю гранул.

Для оцінки функціонального стану печінки, визначали активність органоспецифічних ферментів – АСТ, АЛТ, ЛФ у сироватці крові тварин за допомогою стандартних наборів фірми “Філісіт-Діагностика”. Визначали маркери інтенсивності ПОЛ та показників стану АОС: вміст ТБК-продуктів (малонового альдегіду) – за методом Е.Н. Коробейникової (1989); рівня дієнових кон’югатів – за модифікацією В.Б.Гаврилова і співавт. (1988); каталази – за А.Н.Бахом і співавт. (1999); церулоплазміну - за модифікацією Г.О.Бабенка (1999).

Для обчислення похідних параметрів і коефіцієнтів використовували електронні таблиці Microsoft® Excel 2000. Статистичний аналіз проводили за допомогою комп’ютерної системи STATISTICA for Windows® методами параметричної статистики з використанням t-критерію Стьюдента для оцінки достовірності відмінності між значеннями метричних показників попарно вибраних груп та кореляційного аналізу з використанням коефіцієнта кореляції Пірсона. Різницю вважали вірогідною при p<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Морфо-функціональні зміни печінки щурів під впливом пестициду 2,4-Д. У тварин першої групи на кінець 3-ї доби введення П 2,4-Д Гц мали набряклу, слабобазофільну цитоплазму, ядра різних розмірів. Між Гц розрізнялися поодинокі лімфоцити і їх невеликі групи. У печінці щурів К групи виявили набряк Гц та звуження просвіту СГ у І зоні.

Морфометричний аналіз на 3-ю добу показав збільшення кількості Гц із Sh>260,01 мкм2 та зменшення із Sh=140,01-220,00 мкм2. Кількість Гц із Sn=10,01-35,00 мкм2 зменшувалася, а із Sn>35,01 мкм2 – зростала. Гістограма розподілу клітин за Sn мала унімодальний тип (пік – 40,01-45,00 мкм2). Коефіцієнт кореляції (r) між показниками Sn і Sh зменшився до 0,496 (К – r=0,520, р<0,05), між Sn/Sh і Sh значно зріс – r=-0,539 (К – r=-0,279, p<0,05). В 1,5 рази збільшилася частка деформованих Гц із Fh>1,25. У 2,3 рази зменшилася кількість Гц із округлими ядрами (Fn від 1,05 до 1,15) і збільшилася – із деформованими (Fn понад 1,16, р<0,05).

Активність СДГ була найменшою в І і ІІ зонах печінкової часточки. Гранули осаду локалізувалися в цитоплазмі Гц нерівномірно. Активність КФ незначно підвищилася в ІІ і ІІІ зонах, дрібні гранули осаду містилися в цитоплазмі рівномірно на тлі її дифузного брунатного забарвлення.

Електронномікроскопічне дослідження Гц виявило інвагінації ядер окремих Гц із розширеною цистерною ядерної оболонки. Цитоплазма Гц набрякла, вакуолізована (вміст вакуолей – прозорий, пластівцеподібний чи ліпідний). Плазмолема судинного полюсу Гц часто була зруйнована. Цистерни гладкої ендоплазматичної сітки (ЕС) сплощені. У мітохондріях (М) - гомогенізація матриксу і фрагментація крист. Біля М містилися сплощені кільцеподібні цистерни гранулярної ендоплазматичної сітки (ГЕС) і редуковані компоненти комплексу Гольджі (КГ). Біля ядер виявлялися лізосоми, пероксисоми, поодинокі гранули ліпофусцину. Периферійні ділянки ендотеліоцитів СГ потоншені, пори розширені. Через руйнування стінки СГ еритроцити місти­лися біля органел Гц. Між ними спостерігалися макрофаги. Простір Діссе вузький.

На 7-у добу виявлялася “мозаїчна” картина пошкодження – часточки з вираженою дискомплексацією пластинок межували з незначно зміненими. СГ нерівномірно розширені. Гц в стані дрібновакуольної дистрофії з набряклою, зернистою цитоплазмою, окремі - у стані некрозу. Усередині часточок і в перипортальних трактах лімфо-плазмоцитарна інфільтрація. У портальних трактах наявні 2-3 жовчні протоки, що разом із підвищеним рівнем ЛФ є ознакою цитолізу і холестазу (О.Я.Бабак та ін., 2004).

Морфометричне дослідження Гц на 7-у добу показало збільшення кількості Гц із Sh понад 320,00 мкм2 і з великою Sn. Пік Sn/Sh зсунувся до 0,06-0,15. КЗ між Sn/Sh і Sh посилилася (r=-0,687, p<0,05), що свідчить про поєднання набряку ядра і цитоплазми з переважанням останнього в клітинах великого діаметру.

Активність СДГ зменшилася в Гц І зони до (1,65±0,13) балів, ІІ зони - до (1,85±0,18) балів і ІІІ зони - до (2,40±0,17) балів (р<0,05). У цитоплазмі Гц переважала дрібна зернистість із окремими великими гранулами. Активність КФ збільшувалася.

Електронномікроскопічно в Гц: навколоядерний набряк цитоплазми з ділянками ущільнення (“гелізація”), гранули ліпофусцину, ліпідні вакуолі середніх та великих розмірів. Ядра великі, світлі. Їх стан разом із морфометричними показниками свідчить про їх токсичне набухання (Хесин Я.Е., 1967). М виявляли деструкцію крист і зовнішньої мембрани на окремих ділянках. На думку деяких дослідників, альтерація М під дією П 2,4-Д є типовим явищем (Palmeira С.М. e.a., 1994). Цистерни ГЕС були сплощені і вогнищево дегранульовані. Люменальна плазмолема ендотеліоцитів мала нечіткі контури. Тобто, П 2,4-Д проявляє мембранотоксичну дію на плазмолему і мембранні органели Гц із порушенням біліпідного шару мембран (Oruc E. O., Uner N.,2000).

На 14-у добу центральні вени печінкових часточок повнокровні, навколо деяких - групи лімфоцитів. У просвіті СГ – стаз крові. У Гц, переважно І зони, визначалася крупновакуольна дистрофія, набряк, некроз. У сполучній тканині портальних трактів інфільтрація макрофагами і лімфоцитами. Судини печінкових тріад мали звужені просвіти.

Морфометричний аналіз показав зменшення кількості дрібних і великих Гц. Гістограма за Sh мала багатовершинний тип із різким зміщенням вправо. Зросла кількість Гц із Sn>50,01 мкм2. Тип гістограми за Sn змінився на бімодальний. Зріс вміст великих Гц із малими ядрами (Sn/Sh = 0,05 - 0,15). КЗ між Sn/Sh і Sh r = -0,577, p<0,05. Збільшилася кількість деформованих Гц (Fh >1,26), а їх гістограма змінилася на бімодальну. Тобто, зміни форми Гц і його ядра, виявлені на гістопрепаратах, підтвердилися морфометрично.

Активність СДГ у Гц І зони часточки зменшилася, а ІІ і ІІІ зон незначно зросла. Активність КФ у Гц І і ІІ зон зростала, тоді як у ІІІ зоні не змінилася, порівняно з 7-ю добою. Гранули продукту реакції локалізувалися в цито­плазмі Гц нерівномірно і виявлялися за межами Гц як великі конгломерати.

Електронномікроскопічне дослідження Гц виявило картину, подібну до 7-ї доби. Судинні полюси Гц мали вогнищеві прояви деструкції і порушення плазмолеми. Простір Діссе був нерівномірно розширеним і містив невелику кількість мікроворсинок Гц. На думку В.В.Серова, К.Лапиша (1989), такі прояви є типовими для токсичного пошкодження Гц.

На 21-у добу збереглася дискомплексація печінкових пластинок. СГ ІІІ зони нерівномірно розширені з адгезованими до люменальної плазмолеми ендотеліоцитів еритроцитами. Цитоплазма Гц І зони містила великі вакуолі, ІІ зони – багато поліморфних вакуолей , ІІІ зони – дрібні вакуолі, подекуди Гц з ознаками некрозу і паранекрозу. У портальних трактах визначалася лімфо-макрофагальна інфільтрація. Цитоплазма Гц у К групі містила дрібну зернистість в усіх зонах часточок.

Морфометрично виявлялися тенденції попередніх термінів досліду з порушенням Sn/Sh, що підтверджує пошкодження функціонального стану Гц, і можливо, із 30-ї доби починають проявлятися ознаки адаптивного збільшення Sn (И.В.Збарский, 1998). Ступінь деформації Гц незначно залежав від їх площі (r = 0,012, p<0,05). Збільшилася кількість Гц із Fn=1,05-1,15 і зменшилася - із Fn понад 1,16 (p<0,05).

Найвищою була активність СДГ у Гц ІІІ зони і найменшою - І зони. У цитоплазмі Гц з’явилися дрібні гранули біля їх полюсів. Активність КФ становила в І зоні (2,54±0,16) балів, р<0,05, у ІІ – (2,40±0,12) балів, р<0,05, у ІІІ – (2,28±0,19) балів, р<0,05.

Електронномікроскопічно: набряк, менш ущільнена, порівняно з 14-ю добою, цитоплазма Гц, в якій присутні ліпідні і прозорі вакуолі різних розмірів, лізосоми, автофагосоми. Ядра Гц мали інвагінації каріолеми, грудочки гетерохроматину. У судинному полюсі Гц часто містилися групи ліпідних вакуолей, просвітлених М, дезорганізованих і дегранульованих цистерн ГЕС. В окремих дрібних М визначалися тонкі, короткі кристи (“молоді” М). Тобто з’являлись ознаки адаптаційних і компенсаторних процесів. Диктіосоми КГ мали розширені цистерни, пухирцевий компонент слабо виражений. Стінка СГ потоншена. Між ендотеліоцитами вкраплювалися макрофаги з глибокими інвагінаціями плазмолеми.

На 30-у добу в Гц виявлялися дистрофічні зміни. Їх цитоплазма набрякла, вакуолізована. Просвіти СГ І зони розширені, а ІІ зони – помірно і ІІІ зони - значно звужені через набряк Гц. У часточках визначалися дрібні лімфо-плазмоцитарні інфільтрати. Сполучна тканина портальних трактів помірно інфільтрована лімфоцитами. Морфометрично, як і на 14-у добу, зберігалися збільшені в розмірах Гц і пряма КЗ між Sn та Sh (r=0,501, p<0,05). Гістограма за Sn змінилася з унімодальної на асиметричну (3 піки), що може свідчити за процеси поліплоїдизації в ядрах (Бродский В.Я., 1981).

Активність СДГ підвищилася – гранули стали більшими. Локалізація продукту реакції на КФ незначно відрізнялася від 21-ї доби.

Електронномікроскопічно: помірний набряк цитоплазми Гц і токсичні пошкодження органел, які були зсунуті до навколоядерної зони. Ядра Гц великі, в ядерцях переважав фібрилярний компонент. У просвіті СГ - сладжі. Через деструкцію судинного полюсу багатьох Гц їх окремі органели знаходилися поблизу стінки СГ.

На 60-у добу центральні вени наближені одна до одної. У цитоплазмі Гц - прояви зернистої і вакуольної дистрофії. У портальних трактах на тлі товстих пучків колагенових волокон спостерігалися фібробласти, лімфоцити і невелика кількість макрофагів.

Від 30-ї до 60-ї доби прослідковувалася тенденція до збільшення числа Гц із малою Sh. Тип гістограми за Sh змінився на багатовершинний. Вміст ядер із Sn<30,00 мкм2 зріс, але не досягав К. Залишалася збільшеною кількість Гц із великими ядрами. Зросло число деформованих Гц (Fh=1,26-1,30). Виявлені нами морфометричні зміни Гц підтверджують гепатотоксичний ефект П 2,4-Д (Т.К.Константинова и др.,1986).

В активності СДГ і КФ за локалізацією і кількістю забарвленого продукту зберігався рівень 30-ї доби.

Електронномікроскопічно в навколоядерній зоні Гц спостерігали М з короткими кристами, помірно щільним матриксом, частковою деструкцією внутрішньої мембрани. У цитоплазмі траплялися ліпідні вакуолі, лізосоми. Цистерни ГЕС дегранульовані. У просвіті СГ сладжі. Просвіт Діссе звужений. Мембрана судинного полюса Гц вогнищево пошкоджена, мікровор­синки відсутні.

Біохімічні дослідження крові тварин показали, що активність АСТ на 7-у добу введення П 2,4-Д збільшилась у 2,83 рази, АЛТ – у 1,80 рази, ЛФ – у 5,24 рази. На 14-у добу активність АСТ зросла до (1,81±0,03) мкмоль/год.л (р<0,05), а активність АЛТ і ЛФ залишилася високою. На 30-у і 60-у доби (відповідно 14 і 45 діб після останнього введення П 2,4-Д) активність АСТ і АЛТ зменшилася, порівняно з 14-ю добою, але була вірогідно збільшеною відносно К. Активність ЛФ незначно зменшилася.

У крові тварин на 7-у добу показники ПОЛ (вміст малонового альдегіду і дієнових кон’югатів) зросли, а активність церулоплазміну і каталази (АОС) значно зменшилися. На 14-у добу зміни показників ПОЛ досягли найвищого рівня, активність церулоплазміну зменшувалася, а каталази- підвищувалася, порівняно 7-ю добою. На 30-у і 60-у доби вміст малонового альдегіду і дієнових кон’югатів помірно зменшувався. Активність церулоплазміну продовжувала зменшуватися, а каталази поступово зростала. Виявлені порушення показників ПОЛ та АОС при хронічних захворюваннях печінки пов’язані з ушкодженням ліпідних компонентів біомембран (Гончарук Є.Г., 2004).

На підставі одержаних результатів ми стверджуємо, що в сукупності морфо-функціональні зміни паренхіми і строми печінки можна охарактеризувати як хронічний токсичний гепатит, який потребує корекції гепато­протекторами.

Структура печінки при одночасному введенні глутаргіну і П 2,4-Д. В експерименті з одночасним введенням П 2,4-Д і глутаргіну на 3-7-і доби Гц набряклі з глибокими дистрофічними пошкодженнями. На 7-у добу в І та ІІ зонах з’являлися Гц з двома ядрами. СГ мали неоднаковий просвіт і сладжі. У часточках і портальних трактах лімфо-плазмоцитарна інфільтрація. Морфометрично виявлено збільшення кількості дрібних і зменшення частки великих Гц. Зменшувалася кількість деформованих Гц (Fh=1,31-1,40). Між Fh і Sh обернена КЗ змінилася на пряму. Гістограми за Sn, Sh, Sn/Sh, Fh і Fn мали унімодальний тип. Активність СДГ Гц залишалася низькою в Гц усіх зон, а КФ дещо зросла.

На 14–у добу зміни в часточках „мозаїчні”. У І зоні часто виявлялися двоядерні Гц. СГ нерівномірно розширені з чітко окресленими макрофагами. Помітно зрослa кількість Гц із Sh >280,01 мкм2 і відсоток ядер із Sn до 40,00 мкм2. КЗ між Sn/Sh і Sh зменшилася (r=-0,435, p<0,05). Розподіл Гц за Fh наблизився до К. Посилилася деформація великих Гц. Активність СДГ в Гц незначно зросла, а КФ мало змінилася від 7-ї доби.

На 21–30-і доби експерименту відзначалася поступова нормалізація гістологічної будови та морфометричних показників Гц, однак повного відновлення структурно-функціональної організації органа не відбувалося. Через 30 діб цитоплазма Гц була вакуолізованою і зернистою. Серед них траплялися Гц з двома ядрами (прояви регенерації Гц). Просвіти СГ широкі в усіх зонах. Портальні тракти інфільтровані лімфоцитами і плазмоцитами. З’явилися Гц із великою Sh. Зменшувалося число Гц із дрібними ядрами. Активність СДГ в Гц була високою в усіх зонах, а при реакції на КФ переважала дифузна дрібна зернистість.

Через 2 міс повернулися ознаки токсичного пошкодження Гц: втрата чіткості меж між ними, набряк і вакуолізація цитоплазми. Непропорційне зменшення Sh і Sn призвело до порушення показника Sn/Sh. Bодночас зросло число деформованих ядер.

Таким чином, застосування глутаргіну з метою попередження пошкодження печінки при введенні його одночасно з П 2,4-Д не досягло поставленої мети – повноцінної корекції стану печінки не відбулося, а у віддаленому терміні спостерігалися прояви зриву стабільності гістологічної, гістохімічної і морфометричної картин органа.

Морфо-функціональний стан печінки при внутрішньошлунковому введенні глутаргіну на тлі токсичного впливу П 2,4-Д. На 3-7-і доби від початку корекції глутаргіном (після введення П 2,4-Д) межі печінкових часточок розрізнялися добре. Просвіти СГ деформовані. Гц різнилися розмірами, часом містили зморщені ядра. Виявлялися Гц з фігурами мітозу. Гц І і ІІ зон мали ознаки крупновакуольної дистрофії. У гістограмах Гц за Sh, Sn, Sn/Sh, Fh і Fn і КЗ між ними виявлено незначні зміни, порівняно з такими до початку корекції. Активність СДГ у Гц зросла, а КФ – зменшилася.

Через 14 діб зміни в Гц поліморфні, їх ядра округлі. У І та ІІ зонах виявлялися двоядерні Гц. Цитоплазма Гц І і ІІ зон вакуолізована (у ІІІ зоні вакуолей менше). СГ нерівномірно розширені. Інтралобулярна та портальна лімфо-плазмоцитарна інфільтрація помірні. Морфометрично відбулося зростання вмісту Гц із великою Sh і Sn та зменшення - із малими розмірами. КЗ між Sn і Sh (r=0,654, у К r=0,520, p<0,05) та між Sn/Sh і Sh (r= -0,516, у К r= -0,279, p<0,05) посилилася. Зменшувалася кількість деформованих ядер. Активність СДГ в Гц зростала, а КФ – повільно знижувалася.

На 21-у добу більшість часточок мали типову цитоархітектоніку. У цитоплазмі Гц – прояви зернистої і дрібновакуольної дистрофії. В усіх зонах часточок спостерігалися двоядерні Гц. СГ І зони помірно звужені. Лімфоцитарні інфільтрати не виявлялися. Гістограма Гц за Sh стала бімодальною. Велика кількість Гц за Fh і Fn наблизилася до К. Активність СДГ в Гц І зони зросла майже вдвічі, у ІІ і ІІІ зоні - помірно. Активність КФ мала тенденцію до подальшого зниження.

Через 30 діб у більшості часточок зберігалася помірна лімфоцитарна інфільтрація. У цитоплазмі Гц виявлялися дрібні вакуолі. У метричних показниках Гц відбулися зміни, протилежні до таких на 14-21-і доби: у великій кількості визначались Гц з Sh >260,01 мкм2 і ядра із Sn до 30,00 мкм2. Гістограми розподілу за Fh і Fn були наближені до К. Активність СДГ в Гц досягла найвищого рівня з нерівномірною локалізацією гранул упродовж печінкових балок. Активність КФ зменшилася.

На 60-у добу (30 діб після введення глутаргіну) ми спостерігали наближену до К будову печінкових часточок. Проте в цитоплазмі багатьох Гц визначалася дрібна зернистість і прозорі вакуолі. Поміж Гц містилися поодинокі лімфоцити і макрофаги. Активність СДГ менша, а КФ більша від 30-ї доби. Гістограми за Sh, Sn і Sn/Sh унімодального типу. Зміни за Fh засвідчили помірну деформацію Гц, а форма ядер була округлою.

Тобто, у результаті корекції глутаргіном, введеним внутрішньошлунково, ми встановили його позитивний вплив, при якому морфологічна картина наближалася до К на 30-у добу (тобто під час введення глутаргіну). До 60-ї доби в морфологічній, гістохімічній і морфометричній картині проявилися ознаки зменшення ефективності цього засобу.

Корекція токсичного впливу П 2,4-Д на печінку внутрішньоочеревинним введенням глутаргіну. На 3-ю добу морфологічні зміни в печінці поліморфні: дискомплексація пластинок І і ІІ зон, різний функціональний стан Гц. У І зоні траплялися Гц зі значним набряком цитоплазми і двоядерні. СГ звужені в І та ІІ зонах, у ІІІ зоні наближені до К. Навколо центральних вен, між Гц та в портальних трактах лімфо-плазмоцитарна інфільтрація.

Зменшилася кількість Гц із Sh=140,00-200,0 мкм2 і Sh>360,0 мкм2, а кількість ядер із Sn до 40,00 мкм2 зменшилася і із Sn>40,01 мкм2 зросла. Гістограми за Sh і Sn мали бімодальний тип. Sn/Sh виявило зсув вліво. Форма ядра стала більш округлою.

Активність СДГ зросла в найбільшій мірі в І зоні і помірно – у ІІ і ІІІ зонах. Активність КФ зменшилась у І зоні від (2,82±0,23) балів до (2,62±0,18) балів, p<0,05. Електронномікроскопічно в Гц набряк цитоплазми, зменшення кількості вакуолей, сплощення цистерн ЕС і розташування ГЕС біля М.

На 7-у добу печінкові балки майже в половини часточок у центролобулярних зонах мали радіальний напрям. Цитоплазма Гц І і ІІ зон містила дрібні вакуолі. Між Гц виявлялися лімфоцити, макрофаги. Просвіти СГ І і ІІ зон нерівномірно звужені. Сполучна тканина портальних трактів набрякла зі слабою лімфо-макрофагальною інфільтрацією. Морфометричні показники Гц за Sh і Sn продовжували нормалізуватися. Активність СДГ помітно зростала в Гц усіх зон - у цитоплазмі з’явилися крупні гранули, а КФ - зменшувалася.

Більшість М Гц мали нормальну будову, цистерни ГЕС щільно упаковані, кількість ліпідних вакуолей, лізосом і пероксисом мінімальна. На жовчевому полюсі Гц помітні мікроворсинки, а між Гц – чіткі десмосоми. Просвіти жовчних капілярів дещо розширені. У стінці СГ вирізнялися макрофаги з помітними відростками і лізосомами в цитоплазмі.

Через 14 діб ступінь дистрофічних змін у Гц зменшувався. У Гц ІІІ зони містилася дрібна зернистість, ІІ зони – дрібні вакуолі, І зони – крупні вакуолі. В усіх зонах часточок траплялися двоядерні Гц, лімфоцити. Визначалися гіперхромні ядра, що дослідники пояснюють підвищенням регенераторної активності Гц (Гудима А.А., 2007). Просвіти СГ нерівномірно розширені. Портальні тракти звичайної будови. Збільшилася кількість Гц із Sh=140,00-280,00 мкм2. Про розвиток компенсаторних процесів у Гц свідчить посилення КЗ між Sn і Sh (r=0,543, p<0,05). Sn/Sh виявило зсув вправо. КЗ між Sn/Sh і Sh зросло (r=-0,447, p<0,05). За Fh домінуючою групою залишалися Гц з Fh=1,21-1,35. Ядра округлилися (Fn до 1,20).

Активність СДГ зросла в Гц усіх зон, продукт реакції на КФ дифузний.

У навколоядерній зоні Гц органели локалізувалися досить щільно. М мали різні розміри, тонкі кристи і матрикс помірної щільності. Кількість цистерн ГЕС навколо них зменшувалася. Ліпідні вакуолі траплялися рідко. Жовчевий полюс Гц містив прозорі вакуолі. Плазмолема, обернена до простору Діссе, мала численні мікроворсинки. Просвіти жовчних капілярів невеликі. Стінка СГ тонка.

21-а доба виявила прогресуючі позитивні зміни в будові Гц. Траплялися двоядерні Гц в усіх зонах. Збільшилася кількість великих за Sh і Sn Гц. КЗ між Sn і Sh пряма, середньої сили. Розподіл за Sn/Sh, Fh і Fn, активність СДГ і КФ, електронномікроскопічна картина Гц були подібні до 14-ї доби.

На 30-у добу помітне значне зменшення ступеня дистрофічних змін. Траплялися Гц з великими ядрами, двоядерні і з фігурами мітозу, а між Гц поодинокі лімфоцити і макрофаги. Гц в стані некрозу і некробіозу відсутні. Складові перипортальних трактів у межах норми. Форма і розміри Гц наближалися до К. Збільшилася кількість Гц великих за Sh. За Sn зменшилося число ядер до 20,00 мкм2 і було нестабільним у групах від 20,01 мкм2. КЗ між Sn і Sh послабшала, а між Fh і Sh змінилася з оберненої на пряму. Вірогідно зросла активність СДГ і зменшилася - КФ. Електронна мікроскопія виявила в Гц М з чіткою зовнішньою мембраною і численними кристами. Цистерни ГЕС гіпертрофовані, на їх зовнішній поверхні помітні густо розміщені прикріплені рибосоми. Мішечки ЕС дрібні. В ядрах Гц спостерігали гіперплазовані ядерця. У Гц визначалися численні вільні рибосоми і полісоми, гранули глікогену.

На 60-у добу більшість часточок мала нормальну будову. Гц виявляли цитоплазму з дрібною базофільною зернистістю. Округлі ядра Гц інколи містили два ядерця. Поодинокі лімфоцити були рівномірно розподілені по часточці. Але, незважаючи на поліпшення стану печінкової паренхіми, її кількісні параметри не повністю відповідали К. Так, у розподілі Гц за Sh визначалася менша кількість Гц із Sh=140,00-180,00 мкм2, пік гістограми змістився вліво. Більша, порівняно з K, кількість ядер мала Sn>35,00 мкм2, гістограма за Sn стала бімодальною (у К – унімодальна). КЗ між Sn/Sh і Sh обернена. Розподіл Гц за Fn наблизився до К.

Гістотопографія активності СДГ і КФ така, як і на 30-у добу. На електронних мікрофотографіях Гц вирізнялися дещо збільшені в розмірах ядра. Окремі М збільшені в розмірах, їх кристи різної довжини, матрикс звичайної щільності. Цистерни ГЕС плоскі, в їх оточенні багато вільних рибосом і полісом.

Біохімічне дослідження показало, що на 7-у добу активність АСТ зменшилася до (1,07±0,06) мкмоль/год.л (р<0,05), АЛТ – до (0,64±0,04) мкмоль/год.л (p<0,05), а ЛФ - у 2,86 рази. Через 28 діб внутрішньоклітинні процеси в Гц стабілізувались і активність АСТ, АЛТ і ЛФ нормалізувалися. Вміст дієнових кон’югатів і малонового альдегіду від 7-ї до 28-ї доби зменшився і досяг норми. Активність церулоплазміну, який синтезується лише на мембранно­зв’язаних полісомах Гц і слугує індикатором їх функціонального стану, досягла (49,47±0,72) у.о., К= (52,16±0,76) у.о. Водночас підвищилася активність каталази.

Таким чином, результати проведених дослідів із внутрішньоочеревинною корекцією глутаргіном показали, що цей спосіб введення мав позитивні наслідки, які проявлялися швидкою нормалізацією стану паренхіми печінки, розвитком у Гц компенсаторних реакцій, утримання морфометричних показ­ників на рівні К до 21-30-ї доби після останнього введення глутаргіну, із деяким наступним ослабленням компенсаторних і регенераторних процесів до 60-ї доби.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання – встановлення закономірностей морфогенезу печінки під дією П 2,4-Д та змін печінки при їх корекції глутаргіном за різних умов його введення на основі мікроскопічного, морфометричного, гістохімічного, електронномікроскопічного та біохімічного дослідження.

1. Під впливом П 2,4-Д у печінці розвивався токсичний гепатит: виявлено порушення цитоархітектоніки печінкових пластинок і їх лімфо-плазмоцитарну інфільтрацію, набряк, деформацію гепатоцитів та їх ядер, як під час введення П 2,4-Д (14 діб), так й у відновному періоді. Від 21-ї до 30-ї доби набряк зменшувався і поступово проявлялись ознаки адаптаційних і компенсаторних процесів, підтверджені морфометрично. На 60-у добу досліду в печінці визначалися залишкові ознаки - дрібновакуольна дистрофія, слаба інфільтрація лімфоцитами і плазмоцитами, недосягнення гепатоцитами нормальних клітинних параметрів. До 14-ї доби досліду в гепатоцитах наростала дисфункція окисно-відновних (зменшення активності СДГ) і катаболічних (збільшення активності КФ) процесів, із 21-ї доби активність ферментів мала тенденцію до стабілізації, але на кінець досліду не досягла показників норми.

2. Електронномікроскопічно під впливом П 2,4-Д у цитоплазмі встановлено токсичне набухання ядер, виразні порушення структури плазмолеми гепатоцитів та ендотеліоцитів, пошкодження органел мембранного типу, зменшення кількості вільних і прикріплених до сплощених цистерн гранулярної ендоплазматичної сітки рибосом, і як наслідок, дистрофічно-деструктивні процеси в гепатоцитах. Зростала кількість лізосом і пероксисом, ліпідних вакуолей, автофагосом, у мітохондріях виявлявся різний ступінь пошкодження мембран. У відновний період (21-30 доби) в ядрах і ядерцях гепатоцитів визначались ознаки регенераторних процесів. У стінці синусоїдних гемокапілярів виявлено потоншення ендотеліального вистелення, обмежена кількість органел у них, в окремих ділянках руйнуван­ня стінки з виходом еритроцитів у простір Діссе.

3. Морфогенез токсичного гепатиту за дії П 2,4-Д супроводжувався дисбалансом процесів ПОЛ і АОС - збільшенням у крові вмісту первинних (дієнових кон’югатів) і вторинних (малонового альдегіду) продуктів вільнорадикального окислення та зменшенням активності церулоплазміну і каталази. Розвивалися синдроми цитолізу (зростання активності АЛТ і АСТ) і холестазу (підвищення активності ЛФ).

4. Результати світлооптичного, морфометричного та електронномікроскопічного дослідження за інтоксикації П 2,4-Д підтвердили, що саме мембранопошкоджувальний механізм дії є одним із визначальних у виникненні реактивних, альтеративних і компенсаторно-пристосувальних процесів при інтоксикації П 2,4-Д на тлі оксидативного стресу (14 діб), але незважаючи на перевагу дистрофічно-деструктивних процесів, після припинення введення П 2,4-Д (21-30 доби) у гепатоцитах спостерігали відновлювальні процеси: гіпертрофію ядер, появу двоядерних клітин. Від 30-ї доби визначалися прояви зриву адаптаційних процесів.

5. При введенні глутаргіну одночасно з П 2,4-Д адаптаційні та компенсаторно-пристосувальні зміни в гепатоцитах були помірними протягом 30 діб: набряк зменшився, форма гепатоцитів і їх ядер зберігала стабільність розподілу на гістограмах і підтверджувалася змінами кореляційної залежності між морфометричними показниками на протилежну, виявлялися гіпертрофічні зміни органел, збільшилися розміри ядер, які дестабілізувалися після припинення введення глутаргіну. Функціональна активність гепатоцитів характеризувалася підвищенням активності СДГ і помірним зменшенням активності КФ із 7-ї до 30-ї доби досліду.

6. При застосуванні глутаргіну внутрішньошлунково в корекції інтоксикації П 2,4-Д, встановлено, що його позитивний вплив на гепатоцити підтримувався тільки під час введення глутаргіну (30 діб) – морфо-функціональний стан печінки поліпшився: кількість гепатоцитів із великою площею профілю гепатоцита на 14-у добу була максимальною, зменшився набряк, визначалися значні гіпертрофічні прояви і поступове повільне їх зменшення в наступні терміни. У цитоплазмі гепатоцитів відповідно зростала активність СДГ і знижувалась активність КФ (не досягаючи контролю на 60-у добу).

7. При внутрішньоочеревинній корекції глутаргіном після 14-денного введення П 2,4-Д виявлено поліпшення всіх показників діяльності печінки. На 3-14-і доби знижувався ступінь дезорганізації пластинок печінкових часточок, у гепатоцитах зменшувалися прояви альтерації, у них ідентифікувались ознаки внутрішньоклітинної гіпертрофії (зростала кількість міто­хондрій, цистерн гранулярної ендоплазматичної сітки, рибосом і полісом, насиченість цитоплазми глікогеном, зменшувалося число ліпідних вакуолей, лізосом і фагосом, зникала лімфо-плазмоцитарна інфільтрація). В ядрах активувалися процеси білкового синтезу (м’які інвагінації, збільшення розмірів ядер, їх плоїдності та гіпертрофія і гіперплазія ядерець). За поліп­шення функціонального стану гепатоцитів свідчили підвищення активності СДГ, зменшення активності КФ, нормалізація показників ПОЛ і АОС, ослаблення активності трансаміназ і лужної фосфатази. Компенсаторні реакції в гепатоцитах і їх морфометричні показники утримувалися на контрольному рівні до 30-ї доби (3 тижні після останнього введення глутаргіну), із наступним ослабленням компенсаторних і регенераторних реакцій.